Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.
Abstract
De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het maag-darmkanaal door het genereren van tolerant reacties op dieet antigenen en commensale bacteriën terwijl montage effectieve immuun reacties op enteropathogenic microben. Bovendien is het duidelijk dat lokale intestinale immuniteit een diepgaande invloed op immuniteit van verre en systemische heeft geworden. Daarom is het belangrijk om te bestuderen hoe een intestinale immuunrespons wordt geïnduceerd en wat de immunologische uitkomst van de reactie is. Hier, een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van dunne darm inductieve sites zoals de gut-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren en effector sites zoals de lamina propria wordt beschreven en de intestinale epitheel. Deze techniek zorgt voor isolatie van een groot aantal lymfocyten van kleine intestinale weefsels met optimale zuiverheid en levensvatbaarheid en minimale compartimentaire kruisbesmetting binnen acceptabele tijdsbeperkingen. De technische mogelijkheden om te isoleren van lymfocyten en andere immune cellen van intestinale weefsels kan het begrip van immuunresponsen gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten.
Introduction
Het maag-darmkanaal (GI) heeft vele plooien en uitsteeksels die vertegenwoordigt de grootste interface scheiden van het interne lichaam en de externe omgeving. De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het GI-darmkanaal. Het is voortdurend blootgesteld aan dieet antigenen, commensale bacteriën en pathogene microben. Zo moet het verdraagzaam aan voedsel antigenen en commensale bacteriën blijven met behoud van het vermogen om snel genereren een effectieve immuunrespons op enteropathogenic microben1. De intestinale immuunsysteem kan anatomisch worden onderverdeeld in inductieve sites, waar naïef lymfocyten worden geactiveerd door antigeen presentatie van cellen dragen antigenen van de intestinale mucosa, en effector, waar de geactiveerde lymfocyten specifieke uitoefenen Effector functies2. De inductieve sites omvatten de georganiseerde lymfoïde structuur van Peyer van patches (PP) die enquêtes de intestinale lumen rechtstreeks via het optreden van gespecialiseerde cellen van de M en de regionale zuig mesenterische lymfklieren (MILJ.). De effector sites bestaan uit de lamina propria (LP), oftewel het bindweefsel onder de kelder-membraan en het intestinaal epitheel, een eencellige laag gelegen boven de kelder membraan dat geest lymfocyten (IEL) bevat. Lymfocyten zijn belangrijke spelers van adaptieve immuniteit die bemiddelen bescherming tegen infecties en kanker en kunnen ook bijdragen aan Immunopathologie in ontstekingsziekten. Het is belangrijk en zeer relevant voor de studie van lymfocyten in deze verschillende anatomische mucosal compartimenten beter begrijpen hun inductie en effector functies.
Een relatief eenvoudige en uniforme protocol voor de isolatie van lymfocyten van deze compartimenten is nodig omdat het aantal onderzoekers het verkennen van immuun gebeurtenissen die zich in de darm zijn versnellen. Verschillende onderzoeksgroepen hebben gepubliceerd protocollen die delen van verschillende soortgelijke processen voor het isoleren van immuuncellen van de muis kleine intestinale compartimenten3,4,5,6,7 . Er zijn echter verschillende technische onderling verschillen afhankelijk van de focus van het individuele protocol. Bijvoorbeeld, met de focus op het isoleren van immuuncellen van de LP, onderzoekt één protocol de impact van verschillende enzymatische spijsvertering op de levensvatbaarheid van de cellen, cel-oppervlakte marker expressie en de samenstelling van geïsoleerde immuuncellen5. Een ander protocol wijst op een snelle en reproduceerbare methode voor isolatie van lymfocyten zonder dichtheid centrifugeren6. Tot slot, specifieke protocollen bestaan ook met het oog op het isoleren van mononucleaire fagocyten uit weefsel van de verschillende lagen van de dunne darm7. Hier, wordt een zeer reproduceerbaar protocol waarmee sequentiële Isolatievan lymfocyt populaties van de MLN, PP, LP en IEL compartiment van de dunne darm gepresenteerd.
Wij focussen op het isoleren van hoogst gezuiverde populaties van de LP en IEL compartimenten, die grotendeels vrij is van contaminanten in andere intestinale compartimenten. Dit gebruikte protocol produceert een hoog rendement van maximaal zuiver en levensvatbare lymfocyten binnen acceptabele tijd beperkingen4,8,9,10,11,12. Dit protocol zorgt er ook voor de isolatie van lymfocyten van de LP en IEL compartiment met minimale compartimentaire kruisbesmetting, waardoor een bonafide mogelijkheid om te studeren van lymfocyten in deze afzonderlijke compartimenten. De geïsoleerde lymfocyten kunnen worden onderworpen aan verdere manipulaties zoals flow cytometrische analyse of functionele analyse. Dit protocol is met succes toegepast, tot de isolering van lymfocyten uit de muis dunne darm en dikke darm tijdens bacteriële infecties zoals Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumen Yersinia pseudotuberculosis infecties en inflammatoire aandoeningen zoals chemische - en pathogen-geïnduceerde colitis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te isoleren van de ingeboren immune cellen zoals dendritische cellen, macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten van de muis dunne darm en dikke darm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van het National Institute of Health en goedgekeurd door de Stony Brook University institutionele Animal Care en gebruik Comité.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle goedkeuringen zijn verleend voordat u procedures uitvoert.
1. oplossing voorbereiding
-
HGPG (HEPES, L-glutamine, penicilline/streptomycine en gentamycine), 100 ×
- Meng 59.6 g HEPES (500 mM definitieve), 14.6 g L-glutamine (200 mM in finale), 1 × 106 U penicilline (2.000 U/mL definitief), 1 g streptomycine (2 mg/mL final) en 2,5 mg gentamicine (5 µg/mL definitief). Toevoegen van RPMI 1640 tot 500 mL. Breng pH 7.5 met NaOH (vóór aanpassing, de buffer is geel/oranje met een pH rond 6.0). Filter steriliseren met behulp van een 0,45 µm filter. Aliquot en winkel bij-20 ° C voor maximaal 1 jaar of bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
-
HEPES-bicarbonaat buffer, 10 x
- Meng 23.8 g HEPES (100 mM definitieve), 21 g NaHCO3 (250 mM definitieve) en voeg water tot 1000 mL. Breng pH op 7,2 met HCl. Filter steriliseren met behulp van een filter 0,45 micrometer. Bewaren bij kamertemperatuur. De pH verandert na verloop van tijd. Breng opnieuw de pH regelmatig.
-
Oogsten van media (~ 1 fles/2 muizen)
- 500 mL RPMI 1640, toevoegt 25 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (5% laatste) en 5 mL 100 × HGPG. Opslaan van maximaal 6 maanden bij 4 ° C.
-
Dithioerythritol (DTE) oplossing (40 mL/kleine darm)
- Mix-50 mL 10 × Hanks evenwichtige zoutoplossing en Ca2+- Mg2+-gratis, 50 mL 10 × HEPES-bicarbonaat buffer en 50 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (10% laatste). Voeg 350 mL H2O en 15,4-inch mg dithioerythritol/100 mL (1 mM definitieve). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
-
Ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing (50 mL/kleine darm)
- Mix-50 mL 10 × Hanks evenwichtige zoutoplossing en Ca2+- Mg2+-gratis met 5 mL 100 × HGPG. Toevoegen van 445 mL H2O. toevoegen 260 µL 0.5 M EDTA/100 mL (1.3 mM definitieve). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
-
Collagenase oplossing (30 mL/LP)
- Tot 500 mL RPMI, voeg 50 mL FBS (10% FBS def.), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (1 mM definitieve) en 1 mL 0,5 M CaCl2 (1 mM definitieve). Toevoegen van collagenase, Type I (100 U/mL def.). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
-
Dichtheid kleurovergang (DG) oplossingen
- 1 × DG stockoplossing bereiden door het mengen van 90 mL DG stockoplossing (Zie de Tabel van materialen) met 10 mL 10 × PBS. Steriele bewaren bij 4 ° C.
- Bereid 44% DG oplossing (8 mL/IEL, 8 mL/LP) door het mengen van 44 mL van de stockoplossing van 1 × DG en 56 mL RPMI 1640. Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
- 67% DG oplossing (5 mL/IEL, 5 mL/LP) voor te bereiden door het mengen van 67 mL van de stockoplossing van 1 × DG en 33 mL RPMI 1640. Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
2. isolatie van de mesenterische lymfklieren, darmen, en Peyer van Patches
- De muis met behulp van kooldioxide versuffing en secundaire cervicale dislocatie euthanaseren. Plaats de muis op de rug en spray met 70% ethanol. Schaar gebruik te maken van een incisie middellijn en open de huid en de buikwand de peritoneale holte bloot te stellen.
- Zoek het caecum en gebruik van pincet voorzichtig het caecum om neer te trekken. Pincet gebruiken om de dunne darm zorgvuldig naar het recht, bloot de hele keten van MLN, die is afgestemd op de dikke darm.
Opmerking: De kaart van de mesenterische lymfeklieren ketting en lymfatische drainage van de darmen voorheen afgebeeld13. - Identificeren van het knooppunt van de bodem in de keten, dichtst gelegen aan de blindedarm. Één set pincet gebruiken om te begrijpen het mesenterium/vet eromheen en het zachtjes verwijdert de MLN keten onder naar de top van het vet uit rond de lymfeklier met een andere set van verlostang pincet.
- Leg de ketting MLN op een papieren handdoek bevochtigd met oogst media. Verwijder mesenterium/vet door rollen van de keten op de toren van papier en trekken het vet af met twee sets van de verlostang. Plaats de MLN in koude oogst media voor latere stappen van de isolatie.
Opmerking: (i) rechtstreeks te worden aangeraakt van de knooppunten wordt afgeraden. In plaats daarvan begrijpen het mesenterium/vet om hen heen. (ii) het is cruciaal voor het verwijderen van zo veel mesenterium/vet mogelijk ter verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen. - Gesneden van de dunne darm onder de pyloric sphincter en boven de blindedarm met behulp van schaar. Trek de darm langzaam uit het ileum aan twaalfvingerige darm met behulp van een set van verlostang tijdens het verwijderen van het bijgevoegde mesenterium/vet met behulp van een andere set van verlostang.
- Plaats de darm op een papieren handdoek bevochtigd met oogst media en plagen van alle resterende mesenterium/vet af met twee sets van de verlostang.
Opmerking: (i) moet zoveel mesenterium/vet verwijderen als mogelijk is voor optimale cel opbrengst en levensvatbaarheid. (ii) houden de darm bevochtigd in dit en de volgende stappen door oogst media regelmatig toe te passen. - Verzamelen van Peyer patches door ze te verwijderen uit de darm met gebogen schaar. Gebruik een ontleden scope of Vergrootglas indien nodig (beginners); de meeste Peyer patches moeten worden weergegeven voor de getrainde oog. 5-11 (typische) Peyer patches verzamelen uit de dunne darm. Plaats Peyer patches in koude oogst media voor latere stappen van de isolatie.
Opmerking: Peyer de patches zijn kleine, voornamelijk ronde uitstulpingen in de buitenste darmwand tegenover de lijn van mesenterium bijlage. - Gebruik de platte kant van pincet en zachtjes dia van twaalfvingerige darm naar ileum tot uitzetting van fecale inhoud en slijm. Herhaal deze stappen eenmaal te verwijderen van de meeste van het slijm.
Opmerking: Onvolledige verwijdering van slijm kan verlagen van de levensvatbaarheid van de cellen en opbrengst. Toch moet u Schuif de darm voorzichtig om te voorkomen dat strippen villi of beschadiging van het membraan van de kelder. - Fijne schaar gebruiken met een botte uiteinde op één punt, het botte uiteinde invoegen in de darm en opengesneden de darm lengterichting van de twaalfvingerige darm aan ileum. Lateraal de geopende darm in ~ 2 cm stukken gesneden. Leg de intestinale stukjes in een conische buis van 50 mL met 25 mL koude oogst media voor latere stappen van de isolatie.
Opmerking: De schaar bevochtigd met media houden zal hen helpen glijden moeiteloos door de darm.
3. isolatie van lymfocyten van de inductieve Sites
- Isoleren lymfocyten van MLN door zachtjes distantiëren door een zeef van 70-µm cel met behulp van de zuiger van een 3-mL spuit. Wassen cel zeef met 5 mL koude oogst media.
- Pellet MLN-cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.
Opmerking: rode bloedcellen lysis-buffermengsel kan worden gebruikt voor het verwijderen van rode bloedcellen, als het bloeden opgetreden tijdens het verwijderen. - Isoleren lymfocyten van Peyer van patches door Peyer van patches in een conische buis van 15 mL, 5 mL voorverwarmde collagenase oplossing bij 37 ° C en 220 rpm voor 30 min met broeden.
- Vortex voor 15 s bij maximale instelling en filter weefsel en de bovendrijvende substantie in een conische buis van 50 mL verteerd door een zeef van de cel 70-µm. Zachtjes distantiëren van de resterende weefsel stukken met behulp van de zuiger van een injectiespuit 3 mL en wassen van de cel zeef met 5 mL koude oogst media.
- Pellet Peyer de patch cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.
Opmerking: Peyer de patches isolatie wellicht sommige contaminerende lamina propria lymfocyten en geest lymfocyten.
4. isolatie van geest lymfocyten uit de dunne darm
- De stukken van dunne darm driemaal met 25 mL koude oogst media door de buis 10 keer omkeren, laten de intestinale stukken regelen en gieten uit het supernatant wassen.
Opmerking: Weefsel stukken moeten gemakkelijk regelen naar de onderkant van de buis. Als dat niet het geval is, is een indicatie dat teveel mesenterium/vet verbonden blijft, of ze geassocieerd met een luchtbel worden. - Voeg 20 mL voorverwarmde DTE oplossing aan de conische buis van 50 mL, met darm stuks en overbrengen in een 50 mL gesiliconiseerd conische kolf met een roer-bar. Roer bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 20 min. gebruiken een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en het weefsel en de oplossing ook terug overzetten naar de conische buis van 50 mL.
- Vortex de buis op maximum instellen voor 10 s. overdracht de bovendrijvende substantie in een nieuwe 50-mL conische buis door een 70-µm cel zeef voorzichtig om te houden van de stukjes weefsel in de originele buis. Gooi niet het supernatant; de bovendrijvende vloeistof bevat geest lymfocyten. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL koude oogst media en op te slaan op het ijs.
- Voeg 20 mL voorverwarmde DTE oplossing aan de conische buis van 50 mL, met darm stuks en breng terug naar de 50 mL gesiliconiseerd erlenmeyer met een roer-bar. Roer bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 20 min. gebruiken een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en het weefsel en de oplossing ook terug overzetten naar de conische buis van 50 mL.
Opmerking: DTE is een reductor die geest lymfocyten verrijkt. - Vortex de buis op maximum instellen voor 10 s. overdracht de bovendrijvende vloeistof door een zeef van 70-µm cel in de vorige buis met cellen van het supernatans van de eerste behandeling van de DTE (uit stap 4.3).
Opmerking: De resterende intestinale stukken worden gebruikt voor het isoleren van lymfocyten van de lamina propria. Kwaliteitscontrole: Een stukje weefsel kan worden verwijderd en histologisch gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de epitheliale cellen aanwezig zijn en de kelder membraan intact is. - Pellet cellen door centrifugering van het supernatant bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 8 mL van 44% DG-oplossing bij kamertemperatuur (RT).
- Overdracht de 8 mL 44% DG oplossing/celsuspensie in een 17 mm ø x 100 stijl mm 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis. Onderlaag met 5 mL van RT 67% DG-oplossing. Centrifugeer bij 1600 × g gedurende 20 min op RT zonder gebruik te maken van de rem.
Opmerking: Buizen kunnen worden voorbehandeld met boviene serum om te voorkomen dat cellen kleven aan de muren van de buis. - Merk op dat levensvatbare cellen een band (buffy coat) op het raakvlak van 44 tot 67 vormen %, dode cellen en sommige epitheliale cellen in een mucoid film aan de bovenkant van het verloop zijn en de rode bloedcellen in de pellet zijn. Verwijder de bovenste laag van de kleurovergang binnen ~ 2 cm van de interface van de door vacuüm aspiratie. Gebruik een pipet van Pasteur de buffy coat op het raakvlak van de oogst en hen overbrengen naar een conische buis van 50 mL, met 40 mL koude oogst media.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.
5. isolatie van Lamina Propria lymfocyten uit de dunne darm
- Epitheliale cellen verwijderen uit het intestinale weefsel stukken door 25 mL EDTA-oplossing voorverwarmde toe te voegen aan de kolf, met de resterende intestinale stuks. Roer kolf bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 30 min. gebruik een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en zorgvuldig Verwijder het supernatant terwijl intestinale stukken binnen de kolf.
Opmerking: (i) EDTA is een calcium-complexvormer die richt zich op calcium-afhankelijke kruispunten en bevordert het losmaken van intestinale epitheliale cellen. (ii) het supernatant moet bewolkt en kan worden gebruikt voor het isoleren van de IEC als hun collectie is gewenst. - Herhaal stap 5.1.
Opmerking: Het supernatant moet minder bewolkt na deze incubatie. Kwaliteitscontrole: Een stukje weefsel kan worden verwijderd en histologisch gecontroleerd om ervoor te zorgen dat intestinale epitheliale cellen zijn verwijderd en de kelder membraan intact is. Een monster van het supernatant kan ook worden geëvalueerd door een stroom cytometry om te bevestigen dat leukocyten (CD45+ cellen) afwezig zijn. - Voeg 50 mL RT oogst media aan op de maatkolf. Roer kort met een magneet. Laat intestinale stukken regelen en zorgvuldig Verwijder het supernatant.
Opmerking: Deze stap zorgt u ervoor de verwijdering van EDTA vóór collagenase spijsvertering zoals EDTA collagenase inactiveert door chelaat de calcium die essentieel zijn voor collagenase functie. - Voeg 30 mL voorverwarmde collagenase oplossing in de kolf en roer intestinale stukken bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 45 min.
- Verteerd weefsel en supernatant overbrengen naar een conische buis van 50 mL door filteren door middel van een 70-µm cel zeef. Zachtjes distantiëren resterende weefsel stukken met behulp van de zuiger van een injectiespuit 3 mL aan beslag door de filter. Was het filter met 10 mL koude oogst media.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 8 mL van omgevingstemperatuur 44% DG-oplossing.
- Overdracht de 8 mL 44% DG oplossing/celsuspensie in een 17 mm ø x 100 stijl mm 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis. Onderlaag met 5 mL van omgevingstemperatuur 67% DG-oplossing. Centrifugeer het verlopen bij kamertemperatuur en 1600 × g gedurende 20 minuten met geen rem.
- Verwijder de vetlaag bovenop door vacuüm aspiratie. Gebruik een pipet van Pasteur te oogsten van de buffy coat op de interface en de overdracht aan een conische buis van 50 mL, met 40 mL koude oogst media.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische voorstelling van het protocol wordt afgebeeld (Figuur 1). Lymfocyten binnen de intestinale mucosa inductieve en effector sites zijn duidelijk georganiseerd. Peyer de patches (PP) en de mesenterische lymfklieren (MILJ.) bevatten lymfocyten in overzichtelijke T-cel-ruimtes en B-cel follikels, terwijl het intestinaal epitheel bevat lymfocyten die meer diffuus verspreid zijn. De lamina propria (LP) bevat zowel diffuus gedistribueerde lymfocyten en lymfocyten deel uitmaakt van georganiseerde lymfoïde structuren zoals geïsoleerde lymfoïde follikels (ILF) en cryptopatches. Elke intestinale immuun compartiment wordt ook gekenmerkt door een unieke samenstelling van lymfocyt deelverzamelingen (Figuur 2). De MLN is voornamelijk samengesteld uit αβ T-cellen (~ 70%), terwijl PP lymfocyten zijn meestal B cellen (~ 80%). LP lymfocyt samenstelling is grotendeels afhankelijk van de stam, maar voornamelijk samengesteld uit αβ T-cellen en B-cellen. Onderscheiden van de andere intestinale compartimenten, lymfocyten die woonachtig zijn in het epithelium zijn voornamelijk γδ T-cellen (~ 60%) en αβ T cellen met in wezen geen B-cellen. Er bestaan ook verschillende verhoudingen van αβ T cel subsets binnen verschillende anatomische locaties van de darmen. De αβ T-cellen in de LP zijn voornamelijk CD4+ T cellen (~ 70%), terwijl CD8α+ T cellen (~ 85%) overheersen in het compartiment van de geest lymfocyten (IEL). CD8α+ αβ T cellen binnen de LP en IEL compartimenten express de CD8αα homodimer of de CD8αβ heterodimer overwegende dat inductieve site CD8α+ αβ T cellen voornamelijk express de CD8αβ heterodimer (Figuur 3). De meerderheid van γδ T cellen in het compartiment IEL express ook CD8α, terwijl γδ T cellen in het ontbreken van MLN CD8α gevonden (Figuur 3). Ongeacht algemeenheden, de samenstelling van lymfocyt deelverzamelingen kan variëren tussen muis stammen en kan worden gewijzigd met leeftijd of ziekte. Als zodanig moet een zorgvuldige analyse van lymfocyten bevolking binnen de intestinale mucosa in stationaire toestand worden uitgevoerd in de achtergrond stam gebruikt voor de experimentele manipulaties.
Opbrengst van de cel kan sterk variëren afhankelijk van de stam en leeftijd van de muizen, en experimentele omstandigheden gebruikt. Één, levende cellen kunnen worden geteld op een hemocytometer of een geautomatiseerde cel tellen machine met behulp van trypan blauwe uitsluiting. Het aantal lymfocyten worden berekend als: cel graaf × CD45+ cellen (%) in de Gate 3 × lymfocyten (%) in de Gate 4 (Figuur 2). Ongeveer 15 × 106 MLN lymfocyten, 5-10 × 106 PP lymfocyten, 2-5 × 106 LP lymfocyten en 3-6 × 106 IEL kunnen worden verkregen bij een 8 - tot 12-weken oude naïeve C57Bl/6 of Balb/c muis. Als alternatief kunnen stroom gebaseerde tellen kralen te kwantificeren cel populaties met het voorbehoud dat cel verlies tijdens de kleuring optreedt worden gebruikt. Uiteindelijk, consistentie in het tellen techniek moet worden gehandhaafd binnen het lab om ervoor te zorgen dat passende vergelijkingen kunnen worden gemaakt over experimenten.
In dit protocol, wordt DTE behandeling gebruikt om te verrijken IEL, die wordt gevolgd door EDTA behandeling voor het verwijderen van de IEC voor optimale isolatie van hoogverrijkt lymfocyten. Twee DTE behandelingen zijn voldoende te isoleren > 95% van IEL. Een zeer klein aantal lymfocyten kan ook worden gevonden in de behandeling van de EDTA. Deze lymfocyten lijken op een mengsel van IEL en LP lymfocyten (Figuur 4). Een vergelijking van DTE behandeling en gecombineerde DTE-EDTA behandeling te isoleren IEL is ook uitgevoerd. Gecombineerde behandeling van de DTE-EDTA verhoogt IEC verontreiniging in de IEL voorbereiding (Figuur 5) en vermindert de uiteindelijke opbrengst van levende immune cellen na dichtheid kleurovergang centrifugeren. Dichtheid kleurovergang centrifugeren wordt aanbevolen om te isoleren van lymfocyten van de intestinale compartimenten. Het verwijdert dode cellen, vele epitheliale cellen en slijm, bevordering van het isolement van hoogverrijkt lymfocyten en drastisch minderen stroom cytometry overname keer (Figuur 6).
Figuur 1 . Stroomschema van isolatie protocol. DTE, dithioerythritol. EDTA, ethyleendiamminetetra zuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Een stroom cytometry strategie voor lymfocyt populaties van intestinale weefsels gating. Eencellige schorsingen bereid uit de mesenterische lymfklieren (MLN), lamina propria (LP), Peyer van patches (PP) en geest lymfocyten (IEL) compartiment werden gekleurd met corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof (bijvoorbeeld Live/Dead) en de volgende fluorescerende gelabelde antilichamen: CD45 voor de identificatie van hematopoietische cellen, CD19 voor B-cellen, CD3ε voor T cellen, T-cel receptor (TCR) β voor αβ T cellen, TCRδ voor γδ T cellen, CD8α voor CD8α+ αβ T cellen en CD4 voor CD4+ αβ T cellen. Poort 0 naar voren toonde scatter (FSC) - A/kant scatter (SSC) - A eigenschappen. Poort 1 geïdentificeerd afzonderlijke cellen. Poort 2 geïdentificeerd levende cellen. Poort 3 aangegeven hematopoietische cellen. Poort 4 geïdentificeerd lymfocyten op basis van FSC-A/SSC-A eigenschappen. Poort 5 T-cellen en B-cellen geïdentificeerd. Poort 6 geïdentificeerde αβ T-cellen en γδ T cellen onder totaal aantal T-cellen. Gate 7 geïdentificeerd CD8α+ en CD4+ T cellen in de αβ T-celpopulatie. Percentages (in rood lettertype) binnen kleurcorrectie percelen komen overeen met de frequentie van cellen binnen de aangegeven poort onder de voorgaande ouderlijke bevolking. Poort 0 en gate 1 weergegeven totale gebeurtenissen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Het fenotype ofCD8α+ αβ T cellen en γδ T cellen in weefsels van de intestinale. De expressie van CD8β door CD8α+ αβ T cellen en de uitdrukking van CD8α door γδ T cellen worden afgebeeld. Percentages (in rood lettertype) binnen histogrammen komen overeen met de frequentie van cellen die de aangegeven markering onder de aangegeven ouderlijke bevolking uitdrukken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . De samenstelling van lymfocyten van DTE, EDTA en collagenase behandelingen. De ouderlijke gating strategie is het zelfde als in Figuur 2. Poort 5 T-cellen en B-cellen geïdentificeerd. Poort 6 geïdentificeerde αβ T-cellen en γδ T cellen onder totaal aantal T-cellen. Gate 7 geïdentificeerd CD8α+ en CD4+ T cellen in de αβ T-celpopulatie. Percentages (in rood lettertype) binnen kleurcorrectie percelen komen overeen met de frequentie van cellen binnen de aangegeven poort onder de voorgaande ouderlijke bevolking. Lymfocyten van EDTA isolatie dragen gelijkenis met een mengsel van IEL en LP lymfocyten geïsoleerd van DTE en collagenase behandelingen, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Een vergelijking van DTE behandeling en gecombineerde DTE-EDTA behandeling voor de isolatie van IEL. DTE behandeling werd uitgevoerd volgens dit protocol. IEL werden verzameld na DTE behandelingen en voorafgaand aan het EDTA behandelingen. Gecombineerde behandeling van de DTE-EDTA werd uitgevoerd in dezelfde concentraties gebruikt in dit protocol maar op hetzelfde moment. De eigenschappen van de FSC-A/SSC-A, de levensvatbaarheid en het percentage van de CD45+ hematopoietische cellen worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . De impact van de kleurovergang centrifugeren van de dichtheid op de zuiverheid van IEL en LP lymfocyt preparaten. Eencellige suspensies geïsoleerd volgens dit protocol werden onderworpen aan dichtheid kleurovergang centrifugeren of geanalyseerd door stroom cytometry direct. De eigenschappen van de FSC-A/SSC-A, de levensvatbaarheid en het percentage van de CD45+ hematopoietische cellen worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van lymfocyten van de intestinale mucosa inductieve (MLN en PP) en effector (LP en IEL compartiment) sites. Het protocol is ontwikkeld om het evenwicht van de input (keer) en output (levensvatbaarheid en rendement) naar maximalisering van productiviteit en resultaten. Het protocol zorgt er ook voor minimale compartimentaire kruisbesmetting tussen LP en IEL compartimenten.
Verschillende protocollen voor de isolatie van immuun cellen van de darm van de kleine muis zijn gepubliceerde3,4,5,6,7. De meeste van deze protocollen richten over het isoleren van immuuncellen van de LP. Het intestinaal epitheel is een aparte compartiment van de LP die direct wordt blootgesteld aan de externe omgeving en bestaat uit een unieke samenstelling van lymfocyten. Recente benaderingen hebben getracht een meer globale analyse van immune functie in de darmen door het onderzoeken van verschillende intestinale compartimenten gelijktijdig om te begrijpen van de unieke aspecten van immuunresponsen bij deze compartimenten en de relaties tussen hen. Daarom is een betrouwbaar protocol voor de isolatie van immuuncellen van alle deze compartimenten gewenst. Twee DTE behandelingen zijn voldoende te isoleren > 95% van IEL en sommige IEC. EDTA richt zich calcium-afhankelijke kruispunten en is efficiënt om IEC los te maken. Daarom omvat het supernatant van de latere EDTA-behandelingen meestal IEC. Een zeer klein aantal lymfocyten kan worden gevonden in het supernatant na EDTA behandeling; echter worden ongeveer 20-fold meer lymfocyten verkregen uit de DTE. Bovendien lymfocyten van de EDTA-behandeling lijken op gemengde bevolking van IEL en LP lymfocyten (Figuur 4), waarin wordt voorgesteld de LP besmetting van villi en crypte schade. Daarom in dit protocol, IEL worden bijeengezocht uit de DTE-behandeling voorafgaand aan de behandeling van de EDTA, zuiverheid te maximaliseren door het Kruis-vaks besmetting te minimaliseren. Andere protocollen gebruiken sequentiële dithiothreitol (DTT)-EDTA behandelingen of gecombineerde DTT-EDTA behandeling voor de isolatie van IEL5,6,7. DTT is een epimeer van DTE en zowel handelen als reduceermiddel. In deze protocollen, DTT wordt gemeld dat alleen het verwijderen van slijm en EDTA wordt gebruikt voor het isoleren van IEL. Hoewel het effect van DTT en DTE niet direct vergelijken was, werd IEL na DTE behandeling of de gecombineerde behandeling van de DTE-EDTA geëvalueerd. Niet verrassend, gecombineerde DTE-EDTA behandeling verhoogt IEC verontreiniging in de IEL voorbereiding (Figuur 5) en de aanwezigheid van grote aantallen IEC IEL opbrengsten daalde na dichtheid kleurovergang centrifugeren. Als EDTA schade aan sommige villi en crypten veroorzaken kan, gecombineerde DTE-EDTA behandeling kan ook resulteren in besmetting van LP lymfocyten in het preparaat IEL of verlies van LP cellen uit het isolement van de LP. Bovendien, als > 95% van IEL werden geïsoleerd uit de DTE, aparte DTE en EDTA behandelingen hebben de voorkeur. Sommige protocollen isoleren lymfocyten zonder gebruik te maken van de kleurovergang centrifugeren dichtheid te verrijken immuuncellen6. Dichtheid kleurovergang centrifugeren kost extra tijd en verlies van sommige cellen kan optreden. Echter, het verwijdert dode cellen, epitheliaale cellen en slijm, wat leidt tot hoogverrijkt lymfocyt populaties (Figuur 6), die helpt bij het verbeteren van de opsporing van kleine populaties van cellen en aanzienlijk vermindert Acquisitietijd voor stroom Cytometry. Dichtheid kleurovergang centrifugeren heeft gemeld leiden tot een gewijzigde verhouding van mononucleaire fagocytensysteem deelverzamelingen7; lymfocyt deelverzameling samenstelling lijkt echter normaal. Het is met name handig voor het uitvoeren van dichtheid kleurovergang centrifugeren voor de isolatie van IEL. Over het algemeen is een volledige protocol bedoeld om te isoleren hoogverrijkt en optimaal haalbare lymfocyten van alle de intestinale weefsel, met inbegrip van de LP en IEL met minimale cross-compartimentaire besmetting.
Flink wat tijd en zorg moeten worden genomen tijdens weefsel isolatie stappen te beperken van besmetting tussen preparaten. Onvolledige verwijdering van PP kan sterk vertekenen LP lymfocyten. ILF kan ook LP preparaten besmetten. Echter ILF niet zichtbaar met het blote oog en daarom niet operatief worden verwijderd vóór de spijsvertering. Verschillende muis stammen hebben verschillende aantallen ILF14, die sterk tot de variabele samenstelling van LP lymfocyten tussen muis stammen bijdragen kan. Bij het verwijderen van slijm, zorg schuif voorzichtig de darm om te voorkomen dat schade aan de kelder membraan en LP, die leiden LP besmetting van IEL tot kan. Een indicatie van de besmetting is de aanwezigheid van grote aantallen van B-cellen bij de voorbereiding van de IEL. IEL bevatten weinig B cellen (~ 1% of minder), terwijl LPL maximaal 60% B-cellen, afhankelijk van de stam van de muis kan hebben. CD19 maar niet B220 moeten worden gebruikt ter identificatie van B-cellen in de LP en IEL compartiment, zoals intestinale T-cellen kunnen ook express B22015. Bovendien kunnen vele intestinale T-cellen express traditionele macrophage en DC markeringen zoals CD11b en CD11c, respectievelijk16. Dus, goede dump gating strategieën moet worden benut om ervoor te zorgen de juiste analyse.
Stappen kunnen worden gewijzigd om te voldoen aan behoeften van de onderzoekers. Mechanische spijsvertering mogelijk voldoende voor PP lymfocyt isolatie bij steady-state of collagenase vertering van lymfklieren isolement van sommige deelverzamelingen van leukocyten tijdens ontsteking kan vergemakkelijken. Het soort collagenase gebruikt kan aanzienlijke impact hebben op cel oppervlakte marker expressie en de levensvatbaarheid en de zuiverheid van LP lymfocyten5,17. De darm kan worden gesneden in kleine stukjes voor collagenase spijsvertering, die cel rendement kunnen verhogen. Echter, het vermindert ook de levensvatbaarheid. De incubatietijd met collagenase kan worden geoptimaliseerd voor het maximaliseren van de opbrengst terwijl het minimaliseren van de dood van de cel, wat leidt tot maximale terugwinning van levende cellen. Verschillende laboratoria gebruiken enigszins verschillende dichtheid verlopen te isoleren van lymfocyten. Een gevestigde 44/67% dichtheid kleurovergang protocol wordt hier gepresenteerd. Onderzoekers kunnen het testen van verschillende dichtheid verlopen beste aan hun individuele behoeften. Als een groter aantal lymfocyten gewenst zijn, kunnen twee dunne darmen worden gecombineerd voor DTE behandelingen, EDTA behandelingen en collagenase spijsvertering. Als meer dan twee darmen nodig zijn voor de behandeling van de uiterst zeldzame gebeurtenissen, dan is aan te raden dat eencellige schorsingen na isolatie zijn gebundeld.
Geïsoleerde lymfocyten kunnen worden gebruikt voor verdere fenotypische, functioneel en genomische analyse. Bij het uitvoeren van flow cytometrische analyse, is het zeer aan te raden om altijd gebruik die een levensvatbaarheid kleurstoffen en anti-CD45 antistof dode cellen en niet-hematopoietische cellen, waardoor de analyse sterk te sluiten. Als pure lymfocyt populaties nodig zijn, de cel sorteren van CD45+ cellen samen met andere merkers van keuze kunnen worden uitgevoerd. Pannen op anti-CD8α-gecoate platen kan ook worden gebruikt om te isoleren van pure T cellen uit IEL voorbereiding als de meerderheid van deze T cellen uitdrukkelijke CD8α. Panning of cel Sorteren is in het algemeen vereist voor cultuur van IEL zoals epitheliale cellen besmetten IEL groei kan remmen. Feeder cellen zoals naïeve splenocytes kunnen ook worden toegevoegd aan het bevorderen van IEL overleven in cultuur. Als feeders worden gebruikt, is het belangrijk om te gebruiken congenically verkeerde cellen om te onderscheiden populaties. Bacteriële besmetting is zelden een probleem in deze korte termijn functionele studies zoals oogst media streptomycine, penicilline en gentamicine bevat. Bovendien verwijderen talrijke wassen stappen en dichtheid kleurovergang centrifugeren de meeste bacteriën.
Het proces van de isolatie is tijdrovend en vereist een evenwicht tussen zorg, precisie en snelheid voor optimale resultaten. Om ervoor te zorgen de juiste manipulatie van elke stap terwijl het minimaliseren van de tijd tussen muis offer en het verkrijgen van een enkele celsuspensie maximaliseren levensvatbaarheid van de cellen en de opbrengst moet voldoende tijd worden besteed. Dit is een delicaat evenwicht, dat is ook een knelpunt voor beginners proberen te verkrijgen van consistentie in het isoleren van lymfocyten met hoge levensvatbaarheid en rendement. Een proces van de gehele isolatie vanaf muis euthanasie voor het verkrijgen van een schorsing van de getelde eencellige duurt een ervaren onderzoeker ongeveer 8 h voor 8 muizen. Het is aangeraden om hulp voor meer dan 8 muizen voor het genereren van hoge kwaliteit en reproduceerbare resultaten te krijgen. Het is belangrijk om zorg te gebruiken bij het vergelijken van lymfocyten van deze weefsels met lymfocyten van de milt, bloed of andere lymfoïde weefsels als de uitgebreide incubations kan leiden tot kunstmatige veranderingen die zijn gekoppeld aan de isolatie procedure17. Routine vergelijkingen van LP en IEL populaties aan op dezelfde manier behandeld lymfoïde weefsels zou beoordelen of de markering van belang wordt gemoduleerd tijdens lymfocyt isolatie van intestinale weefsels. Vergelijkbare problemen zijn ook een belangrijk aandachtspunt bij het vergelijken van de RNA-profielen van darmen met die uit de lymfoïde weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
B.S.S. wordt ondersteund door NIH grant (R01 AI076457) en fondsen geboden door Stony Brook University. Z.Q. wordt ondersteund door de NIH verlenen (K12 GM102778).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
