Summary
여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.
Abstract
장의 면역 시스템 enteropathogenic에 대 한 효과적인 면역 응답을 설치 하는 동안 식이 항 및 공생 박테리아 허용 응답을 생성 하 여 위장의 장벽 기능 유지에 중요 한 역 미생물입니다. 또한, 그것은 분명 지역 장 면역 먼 및 조직의 면역에 깊은 영향을가지고 되었다. 따라서, 그것은 장 면역 반응을 유도 하는 어떻게 무엇 이며 응답의 면역학 결과 공부 하는 것이 중요입니다. 여기, 상세한 프로토콜 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절 같은 소장 유도 사이트와 lamina propria 같은 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 설명 및 장 상피입니다. 이 기술은 최적의 순도 및 생존 능력 허용 시간 범위 내에서 최소한의 상호 compartmental 오염 작은 창 자 조직에서 세포의 많은 수의 격리를 보장합니다. 세포 및 장 조직에서 다른 면역 세포 분리 기술 기능 위장 감염, 암, 염증 성 질환에 면역 반응의 이해를 수 있습니다.
Introduction
위장 (GI)는 많은 주름 돌출 외부 환경과 내부 신체 분리 큰 인터페이스를 나타내는 있다. 장의 면역 시스템 기 관의 장벽 기능 유지에 필수적인 역할을 한다. 그것은 끊임없이 식이 항, 공생 박테리아 및 병원 성 미생물에 노출 됩니다. 이와 같이, 음식 항 원 및 공생 박테리아 관용 있어야 합니다 빠르게 enteropathogenic 미생물1에 대 한 효과적인 면역 응답을 생성 하는 능력을 유지 하면서. 장의 면역 시스템 해부학 어디 순진한 림프 톨 항 원 장 점 막에서 항 원을 운반 하는 세포에 의해 활성화 됩니다, 유도 사이트 및 이펙터 사이트, 활성화 된 림프 톨 특정 발휘로 분할 될 수 있다 이펙터 기능2. 유도 사이트 구성 조직된 림프 구조에 Peyer의 패치 (PP)의 전문된 M 세포와 지역 배수 mesenteric 림프절 (MLN)의 행동을 통해 직접 창 자 루멘을 조사. 이펙터 사이트 lamina propria (LP), 지하실 멤브레인와 장 상피 세포, intraepithelial 세포 (IEL)를 포함 하는 지하실 멤브레인 위에 있는 단일 셀 레이어 아래 결합 조직으로 구성 됩니다. 세포는 적응 면역의 주요 플레이어는 감염 및 암에 대 한 보호를 중재 하 고 염증 성 질병에 immunopathology에도 기여할 수 있습니다. 그것은 중요 한 고이 고유에 세포를 공부 하는 관련성이 높은 해 부 점 막 구획을 더 나은 이해 그들의 유도 및 이펙터 기능.
소장에 발생 하는 면역 이벤트를 탐험 하는 수 사관의 수는 가속으로 비교적 간단 하 고 통합 프로토콜 이러한 구획에서 세포의 고립에 대 한 필요 합니다. 여러 연구 그룹 출판 마우스 작은 창 자 구획3,,45,6,7에서에서 면역 세포를 분리 하는 데 몇 가지 유사한 프로세스를 공유 하는 프로토콜 . 그러나, 개별 프로토콜의 초점에 따라 그들 가운데 몇 가지 기술적 차이가 있습니다. 예를 들어 LP에서 면역 세포를 분리 하는에 초점을 맞추고, 한 프로토콜 세포 생존 능력, 세포 표면 마커 식, 그리고 고립 된 면역 세포5의 구성에 다양 한 효소 소화에 미치는 영향을 검사 합니다. 다른 프로토콜 밀도 원심 분리6없이 세포의 고립에 대 한 신속 하 고 재현성 방법을 강조 한다. 마지막으로, 특정 프로토콜 또한 작은 창7의 다른 조직 층에서 단 식 세포를 고립 시키기 위해 존재 한다. 여기, 소장의 MLN, PP, LP, 및 IEL 구획에서 림프 구 인구의 순차적 격리를 허용 하는 높은 재현 프로토콜 제공 됩니다.
우리는 크게 다른 장의 구획에서 오염 물질의 무료 LP 및 IEL 구획에서 높게 순화 된 인구를 고립 시키기에 초점. 이 널리 사용 프로토콜 생산 허용 시간 제약4,8,9,10,,1112에서 극대로 순수 하 고 실행 가능한 세포의 높은 수확량. 이 프로토콜 또한 타고 난 기회가 뚜렷한 구획에 세포 공부를 수 있도록 최소한의 크로스 compartmental 오염 LP 및 IEL 구획에서 림프 톨의 격리를 보장 합니다. 고립 된 세포 흐름 cytometric 분석 또는 기능 분석 같은 추가 조작 대상이 될 수 있습니다. 이 프로토콜 성공적으로 적용 된 세포의 고립에 마우스 작은 창 자와 콜론에서 Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 페스트 pseudotuberculosis 등 세균 감염 시 감염 그리고 화학 및 병원 체 유발 장 염 등 염증 성 조건. 이 프로토콜은 수지상 세포, 대 식 세포, 호 중구, 및 monocytes 마우스 작은 창 자와 콜론에서 같은 타고 난 면역 세포를 분리 하도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험 국립 건강 연구소의 지침에 따라 실시 하 고 스토 니 브 룩 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
주: 절차를 수행 하기 전에 모든 승인을 부여 됩니다 확인 하십시오.
1. 솔루션 준비
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HGPG (HEPES, L-글루타민, 페니실린/스, 그리고 gentamycin), 100 ×
- 혼합 59.6 g HEPES (최종 500 mM) 14.6 g L-글루타민 (200 m m 최종), 1 × 106 U 페니실린 (2000 U/mL 최종), 1 g 스 (2 mg/mL 최종), 그리고 2.5 mg gentamicin (5 µ g/mL 최종). 추가 RPMI 1640 ~ 500 mL. 7.5 NaOH를 사용 하 여 pH를 조정 (조정, 전에 버퍼가 노란색/주황색 약 6.0 ph). 필터는 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 약 수 그리고 저장소 또는 1 달까지 4 ° C에서 최대 1 년 동안-20 ° C에서.
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HEPES-중 탄산염 버퍼, 10 배
- 혼합 23.8 g HEPES (최종 100 mM) 21 g NaHCO3 (최종 250 m m) 및 1000 mL에 물을 추가. HCl. 여과기와 pH 7.2 조정 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 실내 온도에 상점. 산도 시간이 지남에 변경 됩니다. 다시 정기적으로 pH를 조정 합니다.
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미디어를 수확 (~ 1 병/2 마우스)
- 500 ml RPMI 1640, 25 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (5% 최종), 그리고 5 mL 100 × HGPG 추가 합니다. 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장
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Dithioerythritol (DTE) 솔루션 (40 mL/작은 내장)
- 믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca2+-Mg2+-무료, 50 mL 10 × HEPES-중 탄산염 버퍼, 그리고 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (최종 10%). 350ml H2O와 15.4 mg dithioerythritol/100 mL (최종 1 m m)를 추가 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
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Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (50 mL/작은 내장)
- 믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca2+-Mg2+-5 mL 100 × HGPG 무료. 445 mL H2o. 추가 260 µ L 0.5 M EDTA를 추가/100 mL (최종 1.3 m m). 사용 하기 전에이 신선한 준비.
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콜라 솔루션 (30 mL/LP)
- 500 mL RPMI, 50 mL FBS 추가 (10 %FBS 최종) 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl2 (최종 1 mM) 및 1 mL 0.5 M CaCl2 (최종 1 m m). 콜라를 추가 내가 (최종 100 U/mL)을 입력 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
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밀도 그라데이션 (DG) 솔루션
- 90 mL DG 재고 솔루션을 혼합 하 여 1 × DG 재고 솔루션을 준비 ( 테이블의 자료를 참조) 10 × PBS의 10 mL와 함께. 4 ° c.에 살 균 유지
- 1 × DG 재고 솔루션 및 56 mL RPMI 1640 44 mL를 혼합 하 여 44 %DG 솔루션 (8 mL/IEL, 8 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
- 1 × DG 재고 솔루션 및 33 mL RPMI 1640 67 mL를 혼합 하 여 67 %DG 솔루션 (5 mL/IEL, 5 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.
2. Mesenteric 림프절, 내장, 절연 및 파이어의 패치
- 마 취 법 이산화 탄소와 2 차 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 마우스를 안락사 그것의 뒤에 마우스를 놓고 70% 에탄올 스프레이 합니다. 중간 절 개를가 위를 사용 하 여 하 고 복 벽 복 막 구멍을 노출 하 고 피부를 엽니다.
- caecum 찾아서를 부드럽게는 caecum 집게를 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 소장 결 맞춰집니다 전체 MLN 체인 노출 오른쪽으로 이동.
참고: 내장의 체인 및 임 파 액 배수 장치는 이전 mesenteric 림프절의 지도13을그려져 있습니다. - 체인, 맹에 가까운 있는 하단 노드를 식별 합니다. 집게의 한 세트를 사용 하 여 mesentery/지방 주위를 파악 하 고 부드럽게 제거 MLN 체인 하단에서 상단에 tweezing 집게의 또 다른 세트로 림프절 주위에서 지방으로.
- 베스트 미디어를 적신 종이 타월에 MLN 체인을 하다. 종이 타워에 체인을 압 연 하 고 집게의 두 세트와 지방을 미루어 여 mesentery/지방을 제거 합니다. 장소 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어 MLN.
참고: 노드 (i) 직접 처리 실망입니다. 대신, 그들의 주위 mesentery/지방 파악. (ii) 세포 생존 능력을 개선 하기 위해 가능한 많은 mesentery/지방 제거에 중요 하다. - 소장 pyloric 괄약근 아래와 위를 사용 하 여 맹 위를 잘라. 당겨 내장 천천히는 회장에서 십이지 집게의 1 세트를 사용 하 여 연결 된 mesentery/집게의 또 다른 세트를 사용 하 여 지방을 제거 하는 동안에.
- 베스트 미디어를 적신 종이 타월에 소장을 놓고 집게의 두 세트와 함께 모든 나머지 mesentery/지방에서 애타게 합니다.
참고: (i) 가능한 최적의 셀 생산량 및 생존 능력에 대 한 많은 mesentery/지방 질을 제거 해야 합니다. (ii) 소장이 다음 단계에 걸쳐 주기적으로 수확 미디어를 적용 하 여 습 유지. - Peyer의 패치 곡선가 위 소장에서 그들을 제거 하 여 수집 합니다. 해 범위 또는 (초보자); 필요한 경우 돋보기를 사용 하 여 대부분 Peyer의 패치는 훈련 된 눈에 표시 되어야 합니다. 작은 창 자에서 5-11 (일반) Peyer의 패치를 수집 합니다. 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어에 장소 파이어 패치.
참고: 파이어의 패치는 작은, 주로 mesentery 첨부 파일의 라인 반대 장 외벽에 bulges 라운드. - 회장으로 십이지에서 집게와 부드럽게 슬라이드의 편평한 측을 사용 하 여 지저분한 콘텐츠 및 점액을 추방. 대부분 점액의 제거를 한 번 반복 합니다.
참고: 점액의 불완전 한 제거 세포 생존 능력을 감소 하 고 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부드럽게 villi 스트립 또는 지하실 멤브레인의 손상을 방지 하려면 소장 슬라이드를 해야 합니다. - 좋은 위를 사용 하 여 한 지점에 무딘 엔드와, 소장에 무뚝뚝한 끝을 삽입 하 고 자르면 소장 십이지에서 경도 회장에. 옆으로 ~ 2 cm 조각으로 열린된 소장을 잘라. 25 mL 찬 수확 미디어 나중 격리 단계 50 mL 원뿔 튜브에 장 조각을 놓으십시오.
참고: 미디어를 적신가 위 유지 소장을 통해 여유롭게 슬라이드 그들 도움이 됩니다.
3. 절연 유도 사이트에서 세포의
- 부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 여 MLN에서 세포를 분리. 셀 스 트레이너 찬 수확 미디어의 5 mL로 씻는 다.
- 펠 릿 MLN-4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
참고: 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 제거 중에 발생 한 출혈 하는 경우 적혈구를 제거 하려면 사용할 수 있습니다. - 37 ° C와 30 분 동안 220 rpm에서 5 mL prewarmed 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 Peyer의 패치를 배양 하 여 Peyer의 헝겊 조각에서 세포를 분리.
- 15 대 한 소용돌이에서 최대 설정 및 필터 s 소화 조직과 상쾌한 50 mL 원뿔 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해. 부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각을 해리 하 고 차가운 수확 미디어의 5 mL와 함께 셀 여과기를 세척.
- Peyer의 패치 셀 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 여 작은 고 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
참고: 파이어 패치 절연의 일부 오염 lamina propria 세포, intraepithelial 세포를 할 수 있습니다.
4. 소장에서 Intraepithelial 세포의 고립
- 반전 튜브 10 배, 정착, 장 조각 하 고는 상쾌한을 붓는 하 여 조각을 소장의 세 번 찬 수확 미디어의 25 mL 씻으십시오.
참고: 조직 조각 쉽게 튜브의 바닥에 침전 해야 한다. 그들이 경우에, 그것은 너무 많은 mesentery/지방 계속 연결 되어 또는 그들은 공기 방울이와 관련 된 표시. - 포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 볶음 bar가 포함 된 50 mL 시 삼각 flask에 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송.
- 최대 설정 10 미 전송는 상쾌한 새로운 50 mL 원뿔 관으로 원래 관에서 조직 조각을 계속 주의 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 튜브 소용돌이. 상쾌한; 버리지 마십시오 상쾌한 intraepithelial 세포를 포함 되어 있습니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 10 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 저장 합니다.
- 포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 다시 50 mL 시 삼각 플라스 크 볶음 bar가 포함 된 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송.
참고: DTE는 풍요롭게 하는 intraepithelial 세포는 감소 시키는 대리인. - 소용돌이에 최대 설정 10 미 전송은 상쾌한 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 포함 하는 셀 (4.3 단계)에서 첫 번째 DTE 치료의 상쾌한에서 이전 관으로 관.
참고: 나머지 장 조각은 lamina propria에서 세포를 분리 하는 데 사용 됩니다. 품질 관리: 조직의 조각은 제거 고 확인 조직학 상피 세포 존재 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다. - 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 상쾌한 centrifuging 펠 릿 셀 실 온 (RT)에서 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. RT 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 브레이크를 사용 하지 않고 20 분 RT에서 1600 × g에서 원심.
참고: 튜브 튜브 벽에 튀어나와에서 세포를 방지 하기 위해 소 혈 청으로 pretreated 될 수 있습니다. - Note는 44% ~ 67% 인터페이스에서 밴드 (버 피 코트)를 형성 하는 실행 가능한 세포, 죽은 세포와 상피 세포 일부에 그라데이션, 상단의 mucoid 영화 있고 붉은 혈액 세포 펠 릿에. 진공 포부에 의해 인터페이스의 ~ 2 cm 내에서 그라데이션 상위 레이어를 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에 버 피 코트를 수확 하 고 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
5. 소장에서 Lamina Propria 세포의 고립
- 남은 장 조각을 포함 하는 플라스 크에 prewarmed EDTA 솔루션의 25 mL를 추가 하 여 장 조직 조각에서 상피 세포를 제거 합니다. 37 ° C와 30 분 대 한 자력에 220 rpm에서 플라스 크 저 어 저 어 바 그리고 신중 하 게 플라스 크 내의 장 조각을 유지 하면서는 상쾌한 삭제 플라스 크의 외부에 큰 자석을 사용 합니다.
참고: (i) EDTA 칼슘 chelator 칼슘 종속 연결 대상 장 상피 세포의 분리를 촉진 하는. (ii) 상쾌한 흐린 이어야 하며 그들의 컬렉션을 원하는 경우 IEC를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. - 5.1 단계를 반복 합니다.
참고:는 상쾌한 덜 흐린이 부 화에 따라 이어야 한다. 품질 관리: 조직의 조각 제거 고 확인 조직학 장 상피 세포를 제거 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다. Cytometry 확인 하는 상쾌한에서 샘플 평가할 수도 있습니다 그 백혈구 (CD45+ 세포) 결 석. - 플라스 크를 RT 수확 미디어의 50 mL를 추가 합니다. 자석으로 간단히 저 어 줍니다. 장 조각 정착 하 고 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 하자.
참고:이 단계는 EDTA은 콜라 콜라 함수에 대 한 중요 한 칼슘 킬레이트 화 여 서 콜라 소화 전에 EDTA의 제거를 보장 합니다. - Prewarmed 콜라 솔루션의 30 mL 플라스 크에 추가 하 고 45 분 자력에 37 ° C 그리고 220 rpm에서 장 조각 저 어.
- 전송 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 하 여 조직 및 50 mL 원뿔 튜브에 상쾌한 소화. 부드럽게 필터를 통해 매 시에 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각 해리. 찬 수확 미디어의 10 mL와 함께 필터를 세척.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 주위 온도 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. 주위 온도 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 실내 온도 아무 브레이크 20 분 동안 1600 × g에서 그라디언트 원심
- 진공 포부에 의해 위에 지방 층을 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스와 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 버 피 코트를 수확.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
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Representative Results
프로토콜의 도식 표현 묘사 된다 (그림 1). 림프 톨 유도 장 점 막 및 이펙터 사이트 내에서 명백 하 게 구성 됩니다. 파이어의 패치 (PP) 및 mesenteric 림프절 (MLN) 포함에 잘 조직 된 T 세포 및 B 세포 모 낭, 림프 톨 장 상피 세포 더 만들어진다 배포 되는 포함. Lamina propria (LP)에 브러시가 분산된 세포와 세포 고립된 림프 낭 (ILF)과 cryptopatches 같은 조직된 림프 구조 내에 포함 된 포함 되어 있습니다. 각 장의 면역 구획은 또한 림프 톨 부분 집합 (그림 2)의 독특한 구성으로 대표. MLN 주로 PP 세포는 주로 B 세포 (~ 80%) αβ T 세포 (~ 70%)의 구성입니다. Lp로 림프 구 구성은 크게 긴장 의존 하지만 주로 αβ T 세포와 B 세포의 구성 이다. 다른 장의 구획 구분, 림프 톨 상피에 거주 하는 주로 γ T 세포 (~ 60%)와 αβ 본질적으로 아무 B 세포와 T 세포. Αβ T 세포 부분 집합의 고유한 비율 또한 내장의 독특한 해 부 위치에서 존재 한다. LP에 αβ T 세포는 주로 CD4+ T 세포 (~ 70%), CD8α 동안+ T 세포 (~ 85%) intraepithelial 세포 (IEL) 구획에 predominate. CD8α+ LP 및 IEL 구획 내 αβ T 세포 표현 CD8αα homodimer 또는 CD8αβ heterodimer 반면 유도 사이트 CD8α+ αβ T 세포 주로 표현 CD8αβ heterodimer (그림 3). IEL 구획에서 γ T 세포의 대다수는 또한 CD8α, 익스프레스 γ T 세포 MLN 부족 CD8α에서에서 발견 하는 동안 (그림 3). 일반에 림프 톨 부분 집합의 구성 마우스 긴장 사이 다를 수 있으며 연령이 나 질병으로 변경 될 수 있습니다. 따라서, 정상 상태에서 장 점 막에서 림프 구 인구의 주의 깊은 분석 실험 조작에 대 한 활용 배경 스트레인에서 수행 되어야 합니다.
셀 수율은 긴장과 쥐, 및 실험 조건 사용의 나이 따라 크게 달라질 수 있습니다. 단일, 살아있는 세포는 hemocytometer 또는 trypan 블루 제외를 사용 하 여 자동된 셀 카운팅 기계에 계산 될 수 있습니다. 림프 톨의 수로 계산 됩니다: 세포 수 × CD45+ 세포 (%) × 게이트 3 게이트 4 (그림 2)에서 세포 (%). 약 15 × 106 MLN 림프 톨, 5-10 × 106 PP 세포, 2-5 × 106 LP 림프 톨, 및 3-6 × 106 IEL 8-에 12 주 된 순진한 C57Bl/6 또는 Balb/c 마우스에서 얻어질 수 있다. 또는 세 구슬 흐름 기반 셀 손실 착 과정에서 발생 하는 경고와 세포 인구를 척도를 사용할 수 있습니다. 궁극적으로, 일관성 기법 계산에 실험에서 적절 한 비교를 만들 수 있도록 실험실 내에서 유지 되어야 합니다.
이 프로토콜에 DTE 치료는 매우 풍부한 림프 톨의 최적의 절연에 대 한 IEC 제거를 EDTA 치료 뒤 IEL를 풍부 하 게 사용 됩니다. 두 DTE 치료는을 충분 한 > IEL의 95%. 세포의 아주 작은 수는 또한 EDTA 치료에서 찾을 수 있습니다. 이러한 lymphocytes 닮은 IEL와 LP 림프 톨 (그림 4)의 혼합물. DTE 치료와 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 격리를 비교도 수행 되었습니다. 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 준비 (그림 5)에서 IEC 오염 증가 하 고 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 라이브 면역 세포의 최종 수확량을 감소 시킨다. 밀도 그라데이션 원심 장의 구획에서 세포를 분리 하는 것이 좋습니다. 그것은 죽은 세포, 많은 상피 세포와 점액, 매우 풍부한 림프 톨의 홍보를 제거 하 고 대폭 감소 하는 cytometry 수집 시간 (그림 6).
그림 1 . 격리 프로토콜의 흐름 차트. DTE, dithioerythritol EDTA, ethylenediaminetetraacetic 산 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 장 조직에서 림프 구 인구에 대 한 전략을 게이팅 cytometry. 단일 셀 정지 mesenteric 림프절 (MLN), lamina propria (LP), Peyer의 패치 (PP) 및 intraepithelial 세포 (IEL) 구획에서 준비 했다 고칠 수 생존 염료와 스테인드 (예: 라이브/죽은) 다음 항 체 형광 표시: 조 혈 모 세포, B 세포에 대 한 CD19, T에 대 한 CD3ε의 식별을 위해 CD45 세포, T 세포 수용 체 (TCR) β αβ T 세포, γ T 셀, CD8α에 대 한 CD8α TCRδ+ αβ T 세포와 CD4에 대 한 CD4+ αβ T 세포. 문 0 앞으로 보여준 분산형 (FSC) A/사이드 분산형 (SSC)-A 속성. 게이트 1 단일 셀을 식별합니다. 게이트 2 라이브 셀을 식별합니다. 게이트 3 조 혈 모 세포를 식별합니다. 게이트 4 확인-A-A/SSC FSC 속성에 따라 림프 톨. 문 5 T 세포와 B 세포를 식별합니다. 6 확인 된 αβ T 세포와 총 T 세포 중 γ T 세포 게이트. 문 7 확인 CD8α+ 와 CD4+ T αβ T 세포 인구에서 세포. 모조 색상 플롯 내에서 (빨간 글꼴)에 비율 이전 부모의 인구 가운데 표시 된 게이트 내의 셀의 주파수에 대응. 0 게이트와 게이트 1 총 이벤트를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 표현 형 ofCD8α+ αβ T 세포, γ T 장 조직에서 세포. CD8β CD8α에 의해의 표현+ αβ T 세포와 CD8α γ T 세포에 의해 표현 묘사 된다. 히스토그램에서 백분율 (빨간 글꼴)에 표시 된 부모의 인구 사이 표시 된 마커를 표현 하는 셀의 주파수에 대응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . DTE, EDTA, 그리고 콜라 치료에서 세포의 구성. 보호자 제어 전략은 그림 2에서 같이. 문 5 T 세포와 B 세포를 식별합니다. 6 확인 된 αβ T 세포와 총 T 세포 중 γ T 세포 게이트. 문 7 확인 CD8α+ 와 CD4+ T αβ T 세포 인구에서 세포. 모조 색상 플롯 내에서 (빨간 글꼴)에 비율 이전 부모의 인구 가운데 표시 된 게이트 내의 셀의 주파수에 대응. EDTA 격리에서 림프 톨 DTE와 콜라 치료에서 각각 격리 IEL와 LP 림프 톨의 혼합물을 닮은 곰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . DTE 취급과 IEL의 격리에 대 한 결합 된 DTE EDTA 치료의 비교. DTE 치료는이 프로토콜에 따라 수행 되었다. IEL 후 DTE 치료 및 EDTA 치료 전에 수집 했다. 이 프로토콜에 사용 되는 동일한 농도에서 하지만 동시에 결합 된 DTE EDTA 치료 수행 되었다. FSC-A/SSC-A 속성, 생존 능력 및 CD45 비율+ 조 혈 모 세포가 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . IEL LP 림프 구 준비의 순수성에 밀도 그라데이션 원심의 영향. 이 프로토콜에 따라 고립 된 단일 셀 정지 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 복종 또는 직접 cytometry에 의해 분석. FSC-A/SSC-A 속성, 생존 능력 및 CD45 비율+ 조 혈 모 세포가 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
자세한 프로토콜 유도 (MLN와 PP) 점 막 세포는 창 자에서 격리에 대 한 제시와 이펙터 (LP 및 IEL 구획) 사이트. 프로토콜 균형 입력 (시간) 및 출력 (생존 및 수율) 결과 및 생산성을 극대화 하기 위해 개발 되었습니다. 프로토콜은 또한 LP와 IEL 구획 사이 최소 상호 compartmental 오염을 보장합니다.
마우스 소장에서 면역 세포의 고립에 대 한 여러 가지 프로토콜 되었습니다 게시3,,45,,67. 이러한 프로토콜의 대부분 LP에서 면역 세포를 고립 시키기에 초점. 장 상피 LP 외부 환경에 직접 노출 되 고 세포의 독특한 구성의 구성에서 뚜렷한 구획 이다. 이러한 구획 및 관계에서 일어나는 면역 반응의 독특한 측면을 이해 하는 동시에 독특한 장 구획을 검사 하 여 장내 면역 기능에 대 한 더 많은 글로벌 분석 최근 접근 모색 사이 그들을. 따라서, 이러한 모든 구획에서 면역 세포의 고립에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜은 원한다. 두 DTE 치료는을 충분 한 > IEL 및 일부 IEC의 95%. EDTA 칼슘 종속 연결 대상 고 IEC 분리 효율적입니다. 따라서, 이후 EDTA 치료에서 상쾌한 주로 IEC 구성 됩니다. 세포의 아주 작은 수는 EDTA 치료; 후에 상쾌한에서 찾을 수 있습니다. 그러나, 약 20-fold 더 많은 세포는 DTE 분수에서 얻을 수 있습니다. 또한, EDTA 치료에서 세포 villi와 토 굴에서 LP 오염 제안 IEL와 LP 세포 (그림 4)의 혼합된 인구를 닮은 손상. 따라서,이 프로토콜에 IEL 수집 됩니다 EDTA 치료 전에 DTE 치료에서 간 구획 오염 최소화 하 여 순도 극대화. 다른 프로토콜 사용 하 여 순차 dithiothreitol (DTT)-EDTA 치료 또는 IEL5,,67의 격리에 대 한 결합 된 DTT EDTA 치료. DTT DTE의 epimer 이며 둘 다 감소 시키는 대리인으로 행동. 이러한 프로토콜에 DTT만 점액을 제거 하 보고 되 하 고 EDTA IEL를 격리 하는 데 사용 됩니다. DTT와 DTE의 효과 직접 비교 하지, 하지만 IEL DTE 치료 또는 결합 된 DTE EDTA 치료 후 평가 했다. 아니나 다를까, 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 준비 (그림 5)에서 IEC 오염 증가 하 고 IEC의 많은 수의 존재는 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 IEL 수확량 감소. 일부 villi 및 지하실 EDTA를 손상 시킬 수, 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 준비에 lp로 세포의 오염 또는 LP 격리에서 lp로 세포의 손실에도 발생할 수 있습니다. 또한,로 > IEL의 95%는 DTE 분수에서 고립 되었다, 별도 DTE와 EDTA 치료 선호 됩니다. 일부 프로토콜은 면역 세포6풍부 하 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하지 않고 세포를 격리 합니다. 밀도 그라데이션 원심 추가 시간이 걸립니다 그리고 일부 셀의 손실이 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 죽은 세포, 상피 세포와 점액, 매우 풍부한 림프 구 인구 (그림 6), 세포의 작은 인구의 탐지를 강화 하는 데 도움이 하 고 실질적으로 획득 시간 흐름을 감소 선도 제거 cytometry입니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 되 식 하위 집합7;의 변경된 비율을 보고 했다 그러나, 림프 톨 부분 집합 구성 정상 나타납니다. 특히 IEL의 고립을 위한 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 수행 도움이 됩니다. 전반적으로, LP 및 IEL를 포함 하 여 최소한의 크로스 compartmental 오염 장 조직 모두에서 높은 농축 하 고 최적의 가능한 세포를 분리 하는 완전 한 프로토콜 제공 됩니다.
상당한 시간과 정성 준비 사이 오염 제한 조직 격리 단계 동안 이동 해야. PP의 불완전 한 제거 크게 LP 세포를 왜곡 수 있습니다. ILF LP 준비 오염 또한 수 있습니다. 그러나, ILF 맨 눈으로 볼 수 없습니다 및 따라서 제거할 수 없습니다 수술 소화 전에. 다른 마우스 긴장 다른 수가 ILF14마우스 긴장 사이 LP 세포의 가변 구성에 크게 기여할 수 있다. 점액을 제거, 지하실 멤브레인와 LP, IEL의 LP 오염 발생할 수 있는 손상을 방지 하려면 소장을 부드럽게 밀어 해야 합니다. 오염에의 한 표시 IEL 준비에서 B 세포의 큰 숫자의 존재입니다. IEL 포함 몇 B 세포 (~ 1% 이하의), LPL 마우스 스트레인에 따라 최대 60 %B 셀을 가질 수 있습니다. CD19 하지만 하지 B220 장의 T 세포 수 또한 B22015표현으로 LP 및 IEL 구획, B 셀을 식별 하기 위해 사용 되어야 한다. 또한, 많은 장 T 세포 전통적인 대 식 세포와 CD11b 등 CD11c, 각각16DC 마커 표현 수 있습니다. 따라서, 적절 한 덤프 전략 게이팅 적절 한 분석을 위해 활용 합니다.
단계는 연구자의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 기계적 소화는 정상 상태에서 PP 림프 구 분리에 대 한 충분 한 수 있습니다 또는 콜라 소화 림프절의 염증 동안 백혈구의 일부 하위 집합의 절연을 촉진 수 있습니다. 콜라 사용 유형의 세포 표면 마커 식 생존 및 LP 림프 톨5,17의 순도에 상당한 영향을 있을 수 있습니다. 소장 콜라 소화, 셀 생산량을 증가 시킬 수 있습니다에 대 한 작은 조각으로 잘라 수 있습니다. 그러나, 그것은 또한 생존 능력을 감소 시킨다. 콜라와 함께 부 화 시간 라이브 셀의 최대 복구로 이어지는 세포 죽음을 최소화 하면서 수익률을 극대화 하기 위해 최적화 될 수 있습니다. 다른 실험실 약간 다른 밀도 그라디언트를 사용 하 여 세포를 분리. 잘 설립 44% / 67% 밀도 그라데이션 프로토콜 여기 표시 됩니다. 연구원은 가장 그들의 개인적인 필요에 맞게 서로 다른 밀도 기울기를 테스트할 수 있습니다. 세포의 큰 번호를 원하는 경우 두 개의 소장 DTE 치료, EDTA 및 콜라 소화에 대 한 결합할 수 있습니다. 두 개 이상의 창 자를 극히 드문 이벤트를 검토를 위해 필요한 경우 다음이 좋습니다 단일 셀 정지 격리 후 풀링됩니다.
분리 된 림프 톨 추가 phenotypic, 기능, 및 게놈 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 흐름 cytometric 분석을 수행할 때 그것은 매우 권장 항상 사용 하는 생존 염료 안티 CD45 항 체 분석 향상 시킬 크게 것입니다 비 조 혈 세포, 죽은 세포를 제외. 순수한 림프 구 인구는 필요한 경우, CD45 정렬 셀+ 셀 선택의 다른 표시가 함께 수행할 수 있습니다. 안티 CD8α 코팅 접시에 패닝도 대부분이이 T의 세포가 특급 CD8α로 IEL 준비에서 순수 T 세포를 분리 사용할 수 있습니다. IEL 성장을 억제할 수 있는 상피 세포를 오염 하는으로 이동 또는 세포 분류는 IEL의 문화에 대 한 일반적으로 필요 합니다. 순진한 splenocytes 같은 피더 세포 IEL 생존 문화에서 홍보에 추가할 수 있습니다. 지류 사용 하는 경우 그것은 구별 인구 congenically 일치 하지 않는 셀을 활용 하는 것이 중요입니다. 페니실린, 스 및 gentamicin 수확 미디어 포함으로 세균성 오염 거의 이러한 단기 기능 연구에서 문제입니다. 더하여, 수많은 세척 단계 및 밀도 그라데이션 원심 대부분의 박테리아를 제거합니다.
격리 프로세스 시간이 소요 하 고 최적의 결과 대 한 배려, 정밀도 속도의 균형을 요구. 마우스 희생 사이 시간을 최소화 하 고 세포 생존 능력 및 수율을 최대화 하기 위해 단일 세포 현 탁 액을 취득 하면서 각 단계의 적절 한 조작 되도록 충분 한 시간을 보냈다 해야 합니다. 이것은 또한 높은 생존 능력 및 수율 세포 격리에 일관성을 얻기 위해 노력 하는 초보자를 위한 병목은 섬세 한 균형 이다. 계산된 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 마우스 안락사에서 시작 하는 전체 격리 프로세스는 경험 있는 연구원 약 8 h를 8 쥐에 대 한 걸립니다. 그것은 고품질 및 재현성 결과 생성 하는 이상 8 쥐에 대 한 지원을 받을 것이 좋습니다. 그것은 격리 절차17와 관련 된 인공 변경으로 이어질 수 있습니다 이러한 조직에서 비장, 혈액, 또는 광범위 한 외피로 다른 림프 조직에서 세포와 세포를 비교 하는 때 주의 사용 해야 합니다. 마찬가지로 치료 림프 조직에 LP 및 IEL 인구의 일상적인 비교 장 조직에서 림프 구 분리 동안 관심의 마커는 변조 여부 평가 것입니다. 림프 조직에서 RNA 프로 파일 창에서 비교할 때 비슷한 문제가 주요 관심사도 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
B.S.S.는 NIH 그랜트 (R01 AI076457)와 스토 니 브 룩 대학에서 제공 하는 자금에 의해 지원 됩니다. Z.Q.는 NIH에 의해 지원 됩니다 (K12 GM102778) 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
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