Summary
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.
Abstract
O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto gastrointestinal, gerando respostas tolerantes aos antígenos alimentares e bactérias comensais enquanto montagem eficazes respostas imunes a enteropatogênica micróbios. Além disso, é evidente que a imunidade intestinal local tem um profundo impacto na imunidade sistêmica e distante. Portanto, é importante estudar como uma resposta imune intestinal é induzida e qual é o resultado da resposta imunológico. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o isolamento de linfócitos de intestino sites indutivo como o tecido linfoide associado intestino de Peyer e a drenagem de linfonodos mesentéricos e efetoras sites como a propria do lamina e o epitélio intestinal. Essa técnica garante o isolamento de um grande número de linfócitos pequenos tecidos intestinais com pureza ideal e viabilidade e mínima contaminação compartimental dentro de restrições de tempo aceitável. A capacidade técnica para isolar linfócitos e outras células do sistema imunológico dos tecidos intestinais permite a compreensão das respostas imunes, infecções gastrintestinais, cancros e doenças inflamatórias.
Introduction
Tracto gastrointestinal (GI) tem muitas dobras e saliências que representa a maior interface separando o corpo interno e o ambiente externo. O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto GI. Ele é constantemente exposto a antígenos alimentares, bactérias comensais e micróbios patogênicos. Como tal, deve continuar a ser tolerante aos antígenos alimentares e bactérias comensais, preservando a capacidade de rapidamente gerar uma resposta imune eficaz para micróbios enteropatogênica1. O sistema imunitário intestinal pode ser dividido anatomicamente em sites indutivos, onde ingênuo linfócitos são ativados por transportar antígenos da mucosa intestinal de células apresentadoras, e efetoras sites, onde os linfócitos ativados exercem específicas de funções efetoras2. Os sites indutivos compõem a estrutura linfoide organizada de Peyer (PP) que examina o lúmen intestinal diretamente através da ação de células especializadas de M e os regionais drenagem linfonodos mesentéricos (MLN). Os sites de efetor consistem na lâmina própria (LP), que é o tecido conjuntivo abaixo da membrana basal e o epitélio intestinal, uma camada única célula localizada acima da membrana basal que contém linfócitos intraepiteliais (IEL). Os linfócitos são grandes jogadores de imunidade adaptativa que mediam a proteção contra infecções e cancros e também podem contribuir para Imunopatologia em doenças inflamatórias. É importante e altamente relevantes para o estudo de linfócitos nestes distintos compartimentos da mucosa anatômicos para melhor entendem suas funções efetoras e de indução.
Um protocolo relativamente simples e unificado para o isolamento de linfócitos desses compartimentos é necessário que o número de investigadores explorar imunes eventos que ocorrem no intestino está acelerando. Diversos grupos de pesquisa tem publicado os protocolos que compartilham diversos processos semelhantes para isolar as células imunes do rato pequenos compartimentos intestinal3,4,5,6,7 . No entanto, existem várias diferenças técnicas entre eles dependendo do foco do protocolo individual. Por exemplo, com o foco em isolar as células imunes do LP, um protocolo examina o impacto de vários digestões enzimáticas na viabilidade celular, expressão marcador de superfície de célula e a composição das células imunes isolado5. Outro protocolo destaca um método rápido e reprodutível para isolamento dos linfócitos sem densidade centrifugação6. Finalmente, protocolos específicos também existem com a finalidade de isolar os fagócitos mononucleares de camadas de tecido diferente do intestino delgado7. Aqui, apresenta-se um protocolo altamente reprodutível que permite isolamento sequencial das populações de linfócitos do compartimento do MLN, PP, LP e IEL do intestino delgado.
Focamos em isolar populações altamente purificadas de compartimentos do LP e do IEL, que são em grande parte livres de contaminantes de outros compartimentos intestinais. Isto amplamente utilizado protocolo produz um alto rendimento de linfócitos màxima puros e viáveis dentro de tempo aceitável restrições4,8,9,10,11,12. Este protocolo também garante o isolamento dos linfócitos do compartimento do LP e IEL com mínima contaminação cruzada compartimental, permitindo uma oportunidade genuína estudar os linfócitos nesses compartimentos distintos. Os linfócitos isolados podem ser submetidos a outras manipulações como fluxo cytometric análise ou análise funcional. Este protocolo foi aplicado sucesso ao isolamento de linfócitos de rato do intestino delgado e cólon durante infecções bacterianas como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume pseudotuberculosis Yersinia infecções e condições inflamatórias, como a colite química e patógeno-induzida. Este protocolo também pode ser usado para isolar as células imunes inatas como células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e monócitos do rato do intestino delgado e cólon.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações do Instituto Nacional de saúde e aprovados pelo Comitê de uso e Stony Brook University institucional Cuidado Animal.
Nota: Certifique-se que todas as aprovações são concedidas antes da realização de procedimentos.
1. preparação da solução
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HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e gentamicina), 100 ×
- Misturar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g L-glutamina (200 mM final), 1 × 106 U penicilina (2.000 U/mL final), estreptomicina 1G (2 mg/mL final) e gentamicina 2,5 mg (5 µ g/mL final). Adicionar RPMI 1640 para 500 mL. Ajustar o pH a 7,5 usando NaOH (antes do ajuste, o buffer é amarelo/laranja com um pH em torno de 6.0). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,45 µm. Alíquota e loja a-20 ° C por até 1 ano ou a 4 ° C por até 1 mês.
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Tampão HEPES-bicarbonato, 10 x
- Misturar 23,8 g HEPES (100mm final), 21 g NaHCO3 (250 mM final) e adicionar água para 1.000 mL. Ajustar o pH para 7.2 com HCl. filtro esterilizar usando um filtro de 0,45 μm. Armazenar em temperatura ambiente. O pH é alterado ao longo do tempo. Re-ajuste o pH periodicamente.
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Colheita de mídia (~ 1 garrafa/2 ratos)
- A 500 mL de RPMI 1640, adicione 25 mL inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (5% final) e 5 mL 100 × HGPG. Armazenar até 6 meses a 4 ° C.
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Solução de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeno intestino)
- Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca2+- Mg2+-grátis 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino (10% no final). Adicione 350 mL H2O e 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM no final). Prepare este fresco antes da utilização.
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Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (50 mL/pequeno intestino)
- Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca2+- Mg2+-livre com 5 mL 100 × HGPG. Adicionar 445 mL H2O. Adicionar 260 µ l EDTA de 0,5 M/100 mL (final de 1,3 mM). Prepare este fresco antes da utilização.
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Solução de colagenase (30 mL/LP)
- A RPMI de 500 mL, adicionar 50 mL FBS (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (final de 1 mM) e 1 mL 0,5 M CaCl2 (final de 1 mM). Adicionar a colagenase, tipo I (final de 100 U/mL). Prepare este fresco antes da utilização.
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Soluções de (DG) gradientes de densidade
- Preparar 1 × DG solução misturando DG de 90 mL de solução (consulte a Tabela de materiais) com 10 mL de 10 × PBS. Manter estéril a 4 ° C.
- Prepare a solução DG de 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP), misturando 44 mL da solução-mãe 1 × DG e 56 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.
- Prepare a solução DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP), misturando 67 mL da solução-mãe 1 × DG e 33 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.
2. isolamento dos linfonodos mesentéricos, intestinos e do Peyer Patches
- Eutanásia o mouse usando narcose de dióxido de carbono e deslocamento cervical secundário. Coloque o mouse em suas costas e pulverizar com etanol a 70%. Use a tesoura para fazer uma incisão e abrir a pele e a parede abdominal para expor a cavidade peritoneal.
- Localize o ceco e use a pinça para puxar delicadamente o ceco. Use fórceps para deslocar cuidadosamente o intestino delgado para a direita, expondo toda a cadeia MLN, que é alinhada com o cólon.
Nota: Um mapa dos gânglios linfáticos mesentéricos, cadeia e drenagem linfática do intestino foi anteriormente descrito13. - Identifica o nó inferior da cadeia, localizado mais próximo ao ceco. Use um conjunto de pinças para agarrar o mesentério ou a gordura em torno dele e remova cuidadosamente a cadeia MLN do fundo ao topo por arrancas a gordura ao redor do nó de linfa com outro conjunto de pinças.
- Colocar a cadeia MLN sobre uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita. Remova o mesentério/gordura por rolando a cadeia da torre de papel e retirar a gordura com dois conjuntos de pinças. Coloque o MLN em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento.
Nota: (i) direta manipulação de nós é desencorajada. Em vez disso, segure o mesentério ou a gordura em torno deles. (ii) é essencial para remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para melhorar a viabilidade celular. - Corte o intestino abaixo do esfíncter piloro e acima o ceco com uma tesoura. Retire o intestino lentamente do íleo ao duodeno, usando um conjunto de pinças enquanto retira o mesentério/gordura anexado usando um outro conjunto de pinças.
- Coloque uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita o intestino e provocar qualquer mesentério/gordura restante fora com dois conjuntos de pinças.
Nota: (i) Certifique-se de remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para o rendimento da célula ideal e viabilidade. (ii) manter o intestino umedecido durante esta e as etapas a seguir aplicando colheita mídia periodicamente. - Colete de Peyer, removendo-as do intestino com uma tesoura curva. Use uma dissecação escopo ou lupa se necessário (iniciantes); a maioria de Peyer deve estar visíveis para o olho treinado. Colete 5-11 (típico) de Peyer do intestino. Patches do lugar Peyer em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento.
Nota: De Peyer patches são pequenos, principalmente por protuberâncias na parede intestinal exterior em frente a linha de fixação do mesentério. - Use o lado liso da pinça e delicadamente slide do duodeno para íleo para expelir muco e conteúdo fecal. Repeti uma vez para remover a maioria do muco.
Nota: Remoção incompleta de muco pode diminuir a viabilidade celular e rendimento. No entanto, certifique-se de deslizar o intestino com cuidado para evitar descascamento vilosidades ou danificar a membrana basal. - Use tesoura bem com um fim brusco em um ponto, insira a extremidade sem corte no intestino e corte o intestino aberto longitudinalmente do duodeno ao íleo. Lateralmente, corte o intestino aberto em ~ 2 cm. Coloque as peças intestinais em um tubo cónico de 50 mL com mídia de colheita frio 25 mL para etapas posteriores de isolamento.
Nota: Manter a tesoura umedecida com mídia irá ajudá-los deslizar facilmente através do intestino.
3. isolamento de linfócitos de Sites indutivos
- Isole os linfócitos do MLN, dissociando suavemente através de um filtro de célula de 70 µm usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL. Lave o filtro de célula com 5 mL de mídia colheita frio.
- Pelota MLN-células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.
Nota: tampão de lise de células vermelhas do sangue pode ser usado para remover células vermelhas do sangue se o sangramento ocorreu durante a remoção. - Isole os linfócitos de Peyer incubando de Peyer em um tubo cônico de 15 mL contendo solução de colagenase 5 mL pré-aquecido a 37 ° C e 220 rpm por 30 min.
- Vórtice por 15 s na configuração máxima e filtro digerido tecido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente, dissociar as restantes peças de tecido, usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL e lavar o filtro célula com 5 mL de mídia colheita frio.
- Células de Peyer remendo de pelotas por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.
Nota: Peyer do isolamento de patches pode ter algum contaminante linfócitos da lâmina própria e linfócitos intraepiteliais.
4. isolamento de linfócitos intraepiteliais do intestino
- Lave os pedaços de intestino três vezes com 25 mL de mídia colheita frio por inversão do tubo 10 vezes, deixando as peças intestinais resolver e decantar o líquido sobrenadante.
Nota: Peças de tecido devem resolver prontamente à parte inferior do tubo. Se não o fizerem, é uma indicação que demasiada mesentério/gordura permanece anexada ou eles estão associados com uma bolha de ar. - Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir para um balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL.
- O tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante para um novo tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm tendo o cuidado de manter as peças de tecido no tubo original de vórtice. Não descartar o sobrenadante; o sobrenadante contém linfócitos intraepiteliais. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 10 mL e armazenar no gelo.
- Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir de volta para o balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL.
Nota: DTE é um agente redutor que enriquece linfócitos intraepiteliais. - Vórtice do tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante através de um filtro de célula de 70 µm no tubo anterior contendo células do sobrenadante do primeiro tratamento DTE (da etapa 4.3).
Nota: As peças restantes intestinais são usadas para isolar linfócitos da propria do lamina. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais estão presentes e a membrana basal está intacta. - Pellet de células por centrifugação o sobrenadante em 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% na temperatura de quarto (RT).
- A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min no RT sem usar o freio.
Nota: Os tubos podem ser pré-tratados com soro bovino para impedir que as células aderindo às paredes do tubo. - Note-se que células viáveis formam uma banda (buffy coat) na interface de 44% para 67%, células mortas e algumas células epiteliais estão em um filme mucoide na parte superior do gradiente e células vermelhas do sangue está na pelota. Remova a camada superior do gradiente para dentro de ~ 2 cm da interface por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco buffy na interface e transferi-los para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.
- Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.
5. isolamento de linfócitos da lâmina própria do intestino
- Remova células epiteliais de pedaços de tecido intestinal adicionando-se 25 mL da solução de EDTA escaldada para o frasco contendo as peças restantes intestinais. Frasco de agitar a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético durante 30 min. Use um grande ímã do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e cuidadosamente, desprezar o sobrenadante, mantendo intestinais pedaços dentro do frasco.
Nota: (i) o EDTA é um quelante de cálcio metas entroncamentos de cálcio-dependente e promove o desprendimento das células epiteliais intestinais. (ii) o sobrenadante deve ser nublado e pode ser usado para isolar o IEC se sua coleção for desejada. - Repita a etapa 5.1.
Nota: O sobrenadante deve ser menos nublado após esta incubação. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais intestinais foram removidas e a membrana basal está intacta. Uma amostra do líquido sobrenadante também pode ser avaliada por citometria de fluxo para confirmar que leucócitos (CD45+ células) estão ausentes. - Adicione 50 mL de mídia de colheita de RT no balão. Mexa rapidamente com um ímã. Deixe pedaços intestinais resolver e cuidadosamente descartar o sobrenadante.
Nota: Este passo garante a remoção de EDTA antes da digestão de colagenase EDTA inactivates colagenase por quelantes do cálcio que é essencial para a função de colagenase. - Adicionar 30 mL de solução de colagenase escaldadas no balão e misture pedaços intestinais a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 45 min.
- Transferi tecido digerido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL por filtragem através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente dissocia os pedaços restantes do tecido usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL de mash através do filtro. Lave o filtro com 10 mL de mídia colheita frio.
- Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% de temperatura ambiente.
- A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG de 67% de temperatura ambiente. Centrifugue os gradientes em temperatura ambiente e 1600 × g por 20 min com sem freio.
- Remova a camada de gordura na parte superior por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco de buffy para a interface e a transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.
- Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.
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Representative Results
Uma representação esquemática do protocolo é retratada (Figura 1). Linfócitos dentro da mucosa intestinal indutivo e sites effector organizam-se distintamente. Peyer do patches (PP) e linfonodos mesentéricos (MLN) contêm linfócitos em áreas bem organizadas de células T e células B folículos, enquanto que o epitélio intestinal contém linfócitos que são mais difusamente distribuídos. A lâmina própria (LP) contém linfócitos difusamente distribuídos e linfócitos contidos em estruturas linfoides organizadas como folículos linfoides isolados (ILF) e cryptopatches. Cada compartimento imune intestinal também é caracterizado por uma composição única de subconjuntos de linfócitos (Figura 2). O MLN é predominantemente composto por pilhas de T αβ (~ 70%), enquanto que os linfócitos PP são principalmente células B (~ 80%). Composição de linfócitos de LP é largamente dependente da tensão, mas principalmente composto de células αβ T e células B. Distinto dos outros compartimentos intestinais, linfócitos que residem no epitélio são principalmente as pilhas de T do γδ (~ 60%) e as células T αβ com essencialmente nenhuma célula B. Diferentes proporções de subconjuntos de célula T αβ também existem dentro de posições anatômicas distintas dos intestinos. As células αβ T no LP são principalmente CD4+ T células (~ 70%), enquanto CD8α+ T células (~ 85%) predominam no compartimento de linfócitos intraepiteliais (IEL). CD8α+ células αβ T dentro de compartimentos do LP e IEL expressam o homodímero de CD8αα ou o CD8αβ heterodímero considerando indutivo local CD8α+ αβ T células predominantemente express o heterodímero CD8αβ (Figura 3). A maioria das células γδ T no compartimento do IEL também express CD8α, enquanto as células γδ T encontraram em falta o MLN CD8α (Figura 3). Independentemente de Generalidades, a composição dos subconjuntos de linfócitos pode variar entre estirpes de rato e pode ser alterada com a idade ou doença. Como tal, deve efectuar-se uma análise cuidadosa das populações de linfócitos na mucosa intestinal no estado estacionário na estirpe de fundo utilizada para as manipulações experimentais.
Rendimento de célula pode variar muito, dependendo da estirpe e da idade dos ratos e condições experimentais utilizadas. Única, ao vivo as células podem ser contadas em um hemocytometer ou uma máquina de contagem de célula automatizada utilizando trypan azul exclusão. O número de linfócitos é calculado como: célula contagem × CD45+ células (%) no portão 3 × linfócitos (%) no portão 4 (Figura 2). Aproximadamente 15 × 106 MLN linfócitos, os linfócitos do PP6 × 10 5-10, 2-5 × 106 LP linfócitos e 3-6 × 106 IEL podem ser obtidos de um rato de C57Bl/6 ou Balb/c ingênuo de 8 a 12 semanas de idade. Alternativamente, grânulos de contagem baseado em fluxo podem ser usados para quantificar populações de células, com a ressalva de que a perda celular ocorre durante o processo de coloração. Em última análise, consistência na técnica de contagem deve ser mantida dentro do laboratório para garantir que as comparações adequadas podem ser feitas através de experimentos.
Neste protocolo, DTE tratamento é usado para enriquecer o IEL, que é seguido por tratamento de EDTA para remover IEC para isolamento ideal de linfócitos altamente enriquecidos. Dois tratamentos DTE são suficientes para isolar > 95% do IEL. Um número muito pequeno de linfócitos também pode ser encontrado no tratamento EDTA. Estes linfócitos assemelham-se a uma mistura de linfócitos IEL e LP (Figura 4). Também foi realizada uma comparação do tratamento de DTE e tratamento combinado de DTE-EDTA para isolar o IEL. Tratamento combinado de DTE-EDTA aumenta a contaminação de IEC na preparação IEL (Figura 5) e reduz o rendimento final das células imunes ao vivo após a centrifugação gradiente de densidade. Recomenda-se a centrifugação gradiente de densidade para isolar linfócitos de compartimentos do intestinais. Ele remove as células mortas, muitas células epiteliais e muco, promovendo o isolamento dos linfócitos altamente enriquecidos e diminuindo drasticamente a citometria de fluxo aquisição vezes (Figura 6).
Figura 1 . Carta de fluxo do protocolo de isolamento. DTE, dithioerythritol. EDTA, ácido etilenodiaminotetracético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . A citometria de fluxo, retenção de estratégia para as populações de linfócitos dos tecidos intestinais. Suspensões de célula única preparadas dos linfonodos mesentéricos (MLN), lâmina própria (LP), de Peyer patches (PP) e compartimento de linfócitos intraepiteliais (IEL) foram coradas com corante de viabilidade fixável (por exemplo, vivo/morto) e o seguinte anticorpos fluorescentes-Etiquetado: CD45 para identificação de células hematopoiéticas, CD19 por células B, CD3ε para T cells, T-cell receptor (TCR) β para células αβ T, TCRδ para as células γδ T, CD8α para CD8α+ αβ T células e CD4 para CD4+ células αβ T. Propriedades de A - A/side scatter (CCD) - dispersão (FSC) portão 0 mostrou-se para a frente. Portão 1 identificadas células únicas. Portão 2 identificadas células vivas. Portão 3 identificadas células hematopoiéticas. Portão 4 linfócitos identificados com base nas propriedades de FSC-um/SSC. Portão 5 identificadas células T e células B. Portão 6 células identificadas αβ T e células γδ T entre as pilhas de T totais. Portão 7 identificado CD8α+ e CD4+ T células na população de células T αβ. Percentagens (em fonte vermelha) dentro pseudocolorida parcelas correspondem à frequência de células dentro do portão indicado entre a população parental anterior. Portão 0 e portão 1 exibem eventos totais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . O fenótipo ofCD8α+ em tecidos intestinais células células αβ T e γδ T. A expressão de CD8β por CD8α+ αβ T células e a expressão de CD8α pelas células T de γδ são retratados. Percentagens (em fonte vermelha) dentro de histogramas correspondem à frequência de células que expressam o marcador indicado entre a população parental indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . A composição de linfócitos de tratamentos DTE, EDTA e colagenase. a estratégia associada parental é o mesmo como ilustrado na Figura 2. Portão 5 identificadas células T e células B. Portão 6 células identificadas αβ T e células γδ T entre as pilhas de T totais. Portão 7 identificado CD8α+ e CD4+ T células na população de células T αβ. Percentagens (em fonte vermelha) dentro pseudocolorida parcelas correspondem à frequência de células dentro do portão indicado entre a população parental anterior. Os linfócitos do isolamento de EDTA semelhança a uma mistura de linfócitos IEL e LP isoladas de tratamentos DTE e colagenase, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Uma comparação do tratamento de DTE e tratamento combinado de DTE-EDTA para a isolação do IEL. DTE tratamento foi realizado de acordo com este protocolo. IEL foram coletadas após tratamentos DTE e antes de tratamentos de EDTA. Tratamento combinado de DTE-EDTA foi realizado às mesmas concentrações empregadas neste protocolo, mas ao mesmo tempo. As propriedades de FSC-um/SSC, viabilidade e a porcentagem de CD45+ células hematopoiéticas são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . O impacto da centrifugação gradiente de densidade na pureza das preparações de linfócitos IEL e LP. Suspensões de única célula isoladas de acordo com este protocolo foram submetidas a centrifugação gradiente de densidade ou analisadas por citometria de fluxo diretamente. As propriedades de FSC-um/SSC, viabilidade e a porcentagem de CD45+ células hematopoiéticas são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um protocolo detalhado é apresentado para o isolamento de linfócitos do intestinal da mucosa indutivo (MLN e PP) e sites effector (compartimento de LP e IEL). O protocolo foi desenvolvido para equilibrar (tempo) de entrada e saída (viabilidade e rendimento) para maximizar a produtividade e resultados. O protocolo também garante mínima contaminação compartimental entre compartimentos LP e IEL.
Vários protocolos para o isolamento de células do sistema imunológico do intestino de rato foram publicados3,4,5,6,7. A maioria desses protocolos concentrar-se em isolar as células imunes do LP. O epitélio intestinal é um compartimento distinto da LP que é exposto diretamente para o ambiente externo e consiste em uma composição única de linfócitos. Abordagens recentes têm procurado uma análise mais global da função imune nos intestinos, examinando distintos compartimentos intestinais simultaneamente para entender os aspectos únicos de respostas imunes, ocorrendo nesses compartimentos e as relações entre eles. Portanto, um protocolo confiável para o isolamento de células do sistema imunológico de todos esses compartimentos é desejado. Dois tratamentos DTE são suficientes para isolar > 95% do IEL e alguns IEC. EDTA cálcio-dependente junções-alvo e é eficiente para desanexar IEC. Portanto, o sobrenadante dos tratamentos subsequentes de EDTA compreendem principalmente IEC. Um pequeno número de linfócitos pode ser encontrado no sobrenadante após tratamento de EDTA; no entanto, cerca 20-fold mais linfócitos são obtidos a partir da fração DTE. Além disso, os linfócitos do tratamento de EDTA assemelham-se populações mistas de linfócitos IEL e LP (Figura 4), que sugere a contaminação do LP de vilosidades e cripta danos. Portanto, neste protocolo, IEL são recolhidos a partir do tratamento de DTE antes do tratamento de EDTA, maximizando a pureza, minimizando a contaminação cruzada-compartimento. Outros protocolos usam sequencial ditiotreitol (DTT)-tratamentos de EDTA ou tratamento combinado de TDT-EDTA para a isolação do IEL5,6,7. TDT é um epímero da DTE e ambos atuam como agentes redutores. Estes protocolos, TDT é relatado apenas remover o muco e EDTA é usado para isolar o IEL. Embora o efeito da TDT e DTE não foi diretamente comparado, IEL após tratamento de DTE ou tratamento combinado DTE-EDTA foi avaliada. Não surpreendentemente, tratamento combinado DTE-EDTA aumenta a contaminação de IEC na preparação IEL (Figura 5) e a presença de grandes números de IEC diminuição IEL rendimentos após centrifugação gradiente de densidade. Como EDTA pode danificar algumas vilosidades e criptas, tratamento combinado DTE-EDTA também pode resultar na contaminação de linfócitos de LP na preparação IEL ou perda de células do LP do isolamento de LP. Além disso, como > 95% de IEL foram isoladas a partir da fração DTE, tratamentos DTE e EDTA separados são preferidos. Alguns protocolos isolam linfócitos sem usar centrifugação gradiente de densidade para enriquecer as células imunes6. Centrifugação de gradiente de densidade leva mais tempo e poderá ocorrer perda de algumas células. No entanto, ele remove as células mortas, as células epiteliais e muco, levando a populações de linfócitos altamente enriquecido (Figura 6), que ajuda a melhorar a detecção de pequenas populações de células e diminui substancialmente o tempo de aquisição para o fluxo de citometria. Relatou-se centrifugação gradiente de densidade para resultar em relação alterada de fagócitos mononucleares subconjuntos7; no entanto, composição de subconjunto de linfócitos aparentemente normal. É particularmente útil realizar centrifugação gradiente de densidade para o isolamento do IEL. Em geral, apresenta-se um protocolo completo para isolar linfócitos altamente enriquecidos e perfeitamente viáveis de todos os tecidos intestinais, incluindo o LP e IEL com mínima contaminação cruzada-compartimental.
Cuidados e tempo substancial devem ser tomadas durante as etapas de isolamento de tecido para limitar a contaminação entre as preparações. Remoção incompleta de PP grandemente pode distorcer os linfócitos LP. ILF também pode contaminar os preparativos do LP. No entanto, IIF não pode ser visto a olho nu e, portanto, não pode ser removida cirurgicamente antes da digestão. Estirpes de mouse diferente têm diferentes números de ILF14, que pode contribuir muito para a composição variável de linfócitos LP entre estirpes de rato. Ao remover o muco, certifique-se de deslizar suavemente o intestino para evitar danificar a membrana basal e o LP, que poderia resultar na contaminação do LP do IEL. Uma indicação de contaminação é a presença de um grande número de células B na preparação IEL. IEL contêm poucas células B (~ 1% ou menos), enquanto que LPL pode ter até 60% B células, dependendo da estirpe de rato. CD19 mas B220 não deve ser usado para identificar células B no compartimento do LP e IEL, como células T intestinais também podem expressar B22015. Além disso, muitas células T intestinais podem exprimir o macrófago tradicional e marcadores de DC como CD11b e CD11c, respectivamente16. Portanto, deve utilizar-se a lixeira adequada retenção de estratégias para garantir a análise adequada.
Passos podem ser modificados para acomodar as necessidades dos investigadores. Digestão mecânica pode ser suficiente para o isolamento de linfócitos PP no estado estacionário ou digestão de colagenase dos gânglios linfáticos pode facilitar o isolamento de alguns subconjuntos de leucócitos durante a inflamação. O tipo de colagenase usado pode ter impacto substancial na expressão do marcador de superfície celular e a viabilidade e a pureza do LP linfócitos5,17. O intestino pode ser cortado em pedaços pequenos para a digestão de colagenase, podendo aumentar o rendimento da célula. No entanto, ele também reduz a viabilidade. O tempo de incubação com colagenase pode ser otimizado para maximizar o rendimento enquanto minimiza a morte celular, levando a máxima recuperação de células vivas. Laboratórios diferentes usam gradientes de densidade ligeiramente diferentes para isolar linfócitos. Um protocolo de gradiente bem-estabelecida 44 67% de densidade é aqui apresentado. Pesquisadores podem testar gradientes de densidade diferentes para melhor atender as suas necessidades individuais. Se desejar um número maior de linfócitos, dois intestino pode ser combinado para DTE tratamentos, tratamentos de EDTA e digestão de colagenase. Se mais de dois intestinos são necessários para examinar eventos extremamente raros, então é recomendável que suspensões celulares único são agrupadas após o isolamento.
Linfócitos isolados podem ser usados para posterior análise fenotípica, funcional e genômica. Ao realizar a análise de fluxo cytometric, é altamente aconselhável sempre uso que uma viabilidade corantes e anticorpo anti-CD45 para excluir as células mortas e células não-hematopoiéticas, que irão aumentar consideravelmente a análise. Se as populações de linfócitos puro são necessários, célula classificação de CD45+ células juntamente com outros marcadores de escolha podem ser executadas. Garimpando no anti-CD8α-placas com revestimento em também pode ser usado para isolar puras células T de preparação do IEL, como a maioria destes T células CD8α express. Panning ou célula classificação é geralmente necessário para a cultura do IEL como contaminar células epiteliais pode inibir o crescimento do IEL. Células do alimentador como ingênua splenocytes também podem ser adicionadas para promover a sobrevivência do IEL na cultura. Se alimentadores são utilizados, é importante utilizar células congenically incompatível para distinguir as populações. Contaminação bacteriana é raramente um problema nestes estudos funcionais de curto prazo como mídia de colheita contém penicilina, estreptomicina e gentamicina. Além disso, várias etapas de lavagem e centrifugação gradiente de densidade removem a maioria das bactérias.
O processo de isolamento é demorado e exige um equilíbrio de cuidado, precisão e velocidade para obter melhores resultados. Tempo suficiente deve ser gasto para assegurar a manipulação adequada de cada etapa, enquanto minimizando o tempo entre o sacrifício de rato e obtenção de uma suspensão de célula única para maximizar o rendimento e a viabilidade celular. Este é um equilíbrio delicado que também é um gargalo para iniciantes tentando obter consistência em isolar linfócitos com rendimento e alta viabilidade. Um processo de isolamento toda a partir eutanásia de rato para obtenção de uma suspensão de contagem única célula leva um investigador experiente aproximadamente 8 h para 8 ratos. É aconselhável obter assistência para mais de 8 ratos para gerar alta qualidade e resultados reprodutíveis. É importante usar cuidado quando comparar linfócitos destes tecidos com linfócitos de baço, sangue ou outros tecidos linfoides como a incubação do extenso pode levar a alterações artificiais associadas com o procedimento de isolamento17. Comparações de rotina das populações LP e IEL similarmente tratados os tecidos linfoides iria avaliar se o marcador de interesse é modulado durante o isolamento de linfócitos dos tecidos intestinais. Questões semelhantes são também um grande interesse ao comparar perfis de RNA do intestino com as dos tecidos linfoides.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
BSS é suportado pelo NIH grant (R01 AI076457) e os fundos concedidos pela Universidade Stony Brook. Z.Q. é suportado pelo NIH conceder (K12 GM102778).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
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