Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för isolering av lymfocyter från de induktiva webbplatser inklusive Peyers plack i tarmen-associerade lymfoida vävnad och dränerande mesenteriala lymfkörtlar, och effektor webbplatser inklusive lamina propria och intestinal epitel av små tarmens immunförsvar.

Abstract

Intestinal immunsystemet spelar en viktig roll i att upprätthålla barriärfunktionen i mag-tarmkanalen genom att generera tolerant Svaren till kosten antigener och kommensaler bakterier medan montering effektivt immunsvar mot enteropathogenic mikrober. Dessutom har det blivit tydligt att lokala intestinal immunitet har en djupgående inverkan på avlägsna och systemisk immunitet. Det är därför viktigt att studera hur ett intestinal immunsvar induceras och vad immunologisk resultatet av svaret. Här, ett detaljerat protokoll beskrivs för isolering av lymfocyter från tunntarmen induktiva platser som Peyers plack i tarmen-associerade lymfoida vävnad och dränerande mesenteriala lymfkörtlar och effektor sajter som lamina propria och intestinal epitel. Denna teknik garanterar isolering av ett stort antal lymfocyter från små intestinal vävnader med optimal renhet och livskraft och minimal compartmental korskontaminering inom godtagbar tidsbegränsningar. Teknisk kapacitet att isolera lymfocyter och andra immunceller från intestinal vävnader kan förståelsen av immunsvar mot gastrointestinala infektioner, cancer och inflammatoriska sjukdomar.

Introduction

Mag-(GI) tarmkanalen har många veck och utskjutande delar som representerar den största gränssnitt skiljer den inre kroppen och den yttre miljön. Intestinal immunsystemet spelar en viktig roll i att upprätthålla funktionen hinder i mag-tarmkanalen. Det utsätts ständigt för kosten antigener, kommensaler bakterier och patogena mikrober. Som sådan, måste det vara tolerant mot livsmedels antigener och kommensaler bakterier samtidigt bevara kapacitet att snabbt generera ett effektivt immunsvar mot enteropathogenic mikrober1. Intestinal immunsystemet kan delas anatomiskt i induktiva, där naiva lymfocyter aktiveras av antigenpresenterande celler bär antigener från tarmslemhinnan, och effektor platser, där aktiverade lymfocyter utöva viss Effector funktioner2. De induktiva platserna omfattar organiserad lymfoida struktur Peyers plack (PP) att undersökningar intestinala lumen direkt genom åtgärder av specialiserade M celler och regionala dränerande mesenteriala lymfkörtlar (MUSD). Effector webbplatser består av lamina propria (LP), som är bindväv under basalmembranet och intestinala epitelet, ett enda cell lager ovanför basalmembranet som innehåller intraepitelial (IEL). Lymfocyter är stora aktörer av adaptiv immunitet som medla skydd mot infektioner och cancer och kan också bidra till immunopathology i inflammatoriska sjukdomar. Det är viktigt och mycket relevant att studera lymfocyter i dessa skilda anatomiska slemhinnor fack att bättre förstå deras induktion och effektor funktioner.

Ett relativt enkla och enhetliga protokoll för isolering av lymfocyter från dessa avdelningar behövs eftersom antalet utredare att utforska immun händelser som inträffar i tarmen accelererande. Flera forskargrupper har publicerat protokoll som delar flera liknande processer för att isolera immunceller från mus små intestinal fack3,4,5,6,7 . Det finns dock flera tekniska skillnader bland dem beroende på fokus för enskilda protokollet. Exempelvis med fokus på isolera immunceller från LP, undersöker protokoll effekterna av olika enzymatisk tumörheterogenitet på cellernas viabilitet, cell surface markör uttryck och sammansättningen av isolerade immunceller5. Ett annat protokoll belyser en snabb och reproducerbar metod för isolering av lymfocyter utan densitet centrifugering6. Slutligen finns också särskilda protokoll i syfte att isolera mononukleära fagocyter från olika vävnad skikt av tunntarmen7. Här presenteras en mycket reproducerbara protokoll som tillåter sekventiell isolering av lymfocyter befolkningen från MLN, PP, LP och IEL facket av tunntarmen.

Vi fokuserar på isolera högrenade populationer från LP och IEL facken, som är gratis på föroreningar från andra intestinala fack. Ofta används detta protokoll ger en hög avkastning av maximally ren och livskraftig lymfocyter inom godtagbar tid begränsningar4,8,9,10,11,12. Detta protokoll garanterar också isoleringen av lymfocyter från LP och IEL facket med minimal compartmental korskontaminering, att låta en bona fide möjlighet att studera lymfocyter i dessa skilda avdelningar. Isolerade lymfocyterna kan genomgå ytterligare manipulationer som flödet flödescytometrisk analys eller funktionell analys. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på isoleringen av lymfocyter från mus tunntarmen och tjocktarmen under bakterieinfektioner såsom Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumoch Yersinia pseudotuberculosis infektioner och inflammatoriska tillstånd såsom kemiska - och patogen-inducerad kolit. Detta protokoll kan också användas för att isolera innate immuna celler såsom dendritiska celler, makrofager, neutrofiler och monocyter från mus tunntarm och kolon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt National Institute of Health riktlinjer och godkänts av Stony Brook University institutionella djur vård och användning kommittén.

Obs: Se till att alla godkännanden beviljas före utför procedurer.

1. lösningen förberedelse

  1. HGPG (HEPES, L-glutamin, penicillin/streptomycin och gentamycin), 100 ×
    1. Blanda 59,6 g HEPES (sista 500 mM), 14,6 g L-glutamin (sista 200 mM), 1 × 106 U penicillin (2 000 E/mL slutlig), 1 g streptomycin (2 mg/mL slutlig) och 2,5 mg gentamicin (5 µg/mL slutlig). Lägg till RPMI 1640 till 500 mL. Justera pH 7.5 med hjälp av NaOH (före justeringen, bufferten är gul/orange med ett pH-värde omkring 6.0). Filter sterilisera med 0.45 µm filter. Delprov och förvara vid-20 ° C upp till 1 år vid 4 ° C i upp till 1 månad.
  2. HEPES-bikarbonatbuffert, 10 x
    1. Blanda 23,8 g HEPES (sista 100 mM), 21 g NaHCO3 (250 mM slutlig) och tillsätt vatten till 1000 mL. Justera pH-värdet till 7,2 med HCl. Filter sterilisera med 0,45 μm filter. Förvara i rumstemperatur. PH-värdet förändras över tiden. Justera pH-värdet regelbundet.
  3. Skörda media (~ 1 flaska/2-möss)
    1. 500 mL RPMI 1640, tillsätt 25 mL Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (5% slutlig) och 5 mL 100 × HGPG. Lagra upp till 6 månader vid 4 ° C.
  4. Dithioerythritol (DTE) lösning (40 mL/små inälvan)
    1. Blanda 50 mL 10 × Hanks balanserad saltlösning, Ca2+- och Mg2+-gratis, 50 mL 10 × HEPES-bikarbonat buffert och 50 mL Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (10% slutlig). Tillsätt 350 mL H2O och 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM slutlig). Förbereda detta färska före användning.
  5. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra lösningen (50 mL/små inälvan)
    1. Blanda 50 mL 10 × Hanks balanserad saltlösning, Ca2+- och Mg2+-gratis med 5 mL 100 × HGPG. Lägg till 445 mL H2O. lägga till 260 µL 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM slutlig). Förbereda detta färska före användning.
  6. Kollagenas lösning (30 mL/LP)
    1. 500 mL RPMI, tillsätt 50 mL FBS (10% FBS slutlig), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (1 mM slutlig) och 1 mL 0,5 M CaCl2 (1 mM slutlig). Lägg till kollagenas, typ I (100 U/mL slutlig). Förbereda detta färska före användning.
  7. Densitet gradient (GD) lösningar
    1. Förbered 1 × GD stamlösning genom att blanda 90 mL GD stamlösning (se Tabell för material) med 10 mL 10 × PBS. Hålla sterila vid 4 ° C.
    2. Bered 44% GD (8 mL/IEL, 8 mL/LP) genom att blanda 44 mL stamlösning 1 × GD och 56 mL RPMI 1640. Förbereda detta färska före användning.
    3. Förbered 67% GD lösning (5 mL/IEL, 5 mL/LP) genom att blanda 67 mL stamlösning 1 × GD och 33 mL RPMI 1640. Förbereda detta färska före användning.

2. isolering av mesenteriala lymfkörtlar, tarmar, och Peyer patchar

  1. Avliva musen använder koldioxid narkos och sekundära cervikal dislokation. Placera musen på ryggen och spraya med 70% etanol. Använd sax göra ett mittlinjen snitt och öppna huden och bukväggen att exponera i bukhålan.
  2. Lokalisera blindtarmen och använda pincett för att dra försiktigt i blindtarmen ned. Använd tången för att försiktigt flytta tunntarmen till höger, utsätta hela MLN kedjan, som är i linje med kolon.
    Obs: En karta över mesenteriala lymfkörtlar kedja och lymfatiska dränering av tarmen var tidigare avbildade13.
  3. Identifiera noden längst ned i kedjan, ligger närmast blindtarmen. Använda en uppsättning tång att förstå krös/fettet runt det och ta försiktigt bort MLN kedjan från botten till toppen av tweezing fettet från runt lymfkörtel med en annan uppsättning av tången.
  4. Lägg MLN kedjan på en pappershandduk fuktad med skörden media. Ta bort tarmkäxet, fett genom rullande kedjan på tornet papper och dra fettet bort med två uppsättningar av tången. Placera MLN i kalla skörd media för senare isolering steg.
    Obs: (i) direkt hantering av noderna motverkas. I stället förstå krös/fettet runt dem. (ii) det är viktigt att ta bort så mycket fett och tarmkäx som möjligt för att förbättra cellernas viabilitet.
  5. Skär tunntarmen under pyloric sphincter och över blindtarmen med sax. Dra tarmen långsamt ut från ileum till tolvfingertarmen använda en uppsättning tång när du tar bort den bifogade krös, fett med en annan uppsättning pincett.
  6. Placera tarmen på en pappershandduk fuktad med skörden media och reta alla återstående krös, fett med två uppsättningar av tången.
    Obs: (i) Glöm inte att ta bort så mycket fett och tarmkäx som möjligt för optimal cell avkastning och lönsamhet. (ii) hålla tarmen fuktas under detta och följande steg genom att tillämpa skörd media med jämna mellanrum.
  7. Samla Peyers plack genom att ta bort dem från tarmen med böjd sax. Använd en dissekera omfattning eller förstoringsglas om det behövs (nybörjare); de flesta Peyers ska vara synliga för ett tränat öga. Samla 5-11 (typisk) Peyers från tunntarmen. Plats Peyer patchar i kalla skörd media för senare isolering steg.
    Obs: Peyer patchar är små, primärt runda utbuktningar i yttre tarmväggen mittemot raden av krös fastsättning.
  8. Använda den platta sidan av tången och försiktigt glida från tolvfingertarmen mot ileum för att utvisa fekalt innehåll och slem. Upprepa en gång för att ta bort de flesta av slem.
    Obs: Ofullständig borttagning av slem kan minska cellernas viabilitet och avkastning. Ändå vara säker på att glida tarmen försiktigt för att undvika strippar villi eller basalmembranet.
  9. Använd fin sax med trubbiga änden på en punkt, infoga den trubbiga änden i tarmen och uppskuren tarmen längdriktningen från duodenum till ileum. Sidled skär öppnade tarmen i ~ 2-cm bitar. Placera intestinal bitar i en 50 mL konisk slang med 25 mL kall skörd media för senare isolering steg.
    Obs: Att hålla saxen fuktad med media hjälper dem glida enkelt genom tarmen.

3. isolering av lymfocyter från den induktiva platser

  1. Isolera lymfocyter från MLN genom försiktigt separera genom en 70 µm cell SIL med hjälp kolven i en 3-mL spruta. Tvätta cell SIL med 5 mL kall skörd media.
  2. Pellet MLN-celler genom centrifugering vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL kall skörd media. Räkna viabla celler med trypan blå utslagning.
    Obs: röda blodkroppar lyseringsbuffert kan användas för att ta bort röda blodkroppar om blödning inträffade under borttagning.
  3. Isolera lymfocyter från Peyers genom ruvning Peyers plack i en 15 mL koniska rör innehållande 5 mL föruppvärmd kollagenas lösning vid 37 ° C och 220 rpm i 30 min.
  4. Virvel för 15 s vid maximal inställning och filter rötas vävnad och supernatanten till en 50 mL konisk rör genom en sil med 70 µm i cellen. Försiktigt separera de återstående vävnad bitar med hjälp kolven i en 3-mL spruta och tvätta cell silen med 5 mL kall skörd media.
  5. Pellet Peyer's patch celler genom centrifugering vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C och återsuspendera cellpelleten i 1 mL kall skörd media. Räkna viabla celler med trypan blå utslagning.
    Obs: Peyer's patchar isolering kan ha vissa kontaminerande lamina propria lymfocyter och intraepitelial lymfocyter.

4. isolering av intraepitelial lymfocyter från tunntarmen

  1. Tvätta bitar av tunntarmen tre gånger med 25 mL kall skörd media genom att invertera röret 10 gånger, att låta intestinal bitar bosätta sig och hälla bort supernatanten.
    Obs: Vävnad bitar bör lätt reglera till botten av röret. Om de inte gör det, är det en indikation på att för mycket fett och tarmkäx sitter kvar eller de är associerade med en luftbubbla.
  2. Tillsätt 20 mL av förvärmd DTE lösning till 50 mL koniska röret som innehåller inälvan bitar och överför till en 50 mL silikoniserat Erlenmeyerkolv, innehållande en uppståndelse-bar. Rör vid 37 ° C och 220 rpm på en magnetomrörare för 20 min. Använd en stor magnet på utsidan av kolven att hålla stir-baren och överföra vävnad och lösningen tillbaka till 50 mL koniska röret.
  3. Vortex röret vid maximal inställning för 10 s. överföring supernatanten in i en ny 50 mL koniska rör genom en 70 µm cell SIL att vara noga med att hålla vävnad bitarna i det ursprungliga röret. Kasta inte bort supernatanten; supernatanten innehåller intraepitelial lymfocyter. Pellet celler genom centrifugering vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 10 mL kall skörd media och lagra på isen.
  4. Tillsätt 20 mL av förvärmd DTE lösning till 50 mL koniska röret som innehåller inälvan bitar och transfer tillbaka till de 50 mL silikoniserat Erlenmeyerkolv, innehållande en uppståndelse-bar. Rör vid 37 ° C och 220 rpm på en magnetomrörare för 20 min. Använd en stor magnet på utsidan av kolven att hålla stir-baren och överföra vävnad och lösningen tillbaka till 50 mL koniska röret.
    Obs: DTE är reduktionsmedel som berikar intraepitelial lymfocyter.
  5. Vortex röret vid maximal inställning för 10 s. överföring supernatanten genom en 70 µm cell SIL i föregående röret som innehåller celler från supernatanten behandlingens första DTE (från steg 4,3).
    Obs: De återstående intestinal bitarna används för att isolera lymfocyter från lamina propria. Kvalitetskontroll: En bit vävnad kan tas bort och kollade histologiskt se till att epitelceller är närvarande och basalmembranet är intakt.
  6. Pellet celler genom centrifugering supernatanten vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 8 mL 44% GD lösning vid rumstemperatur (RT).
  7. Överföring 8 mL 44% GD lösning/cellsuspensionen till en 17 mm ø x 100 mm stil 14 mL polypropylen runda-botten röret. Underlag med 5 mL RT 67% GD lösning. Centrifugera vid 1600 × g i 20 min på RT utan att använda bromsen.
    Obs: Rör kan vara förbehandlats med bovint serum att förhindra celler fastnar tube väggar.
  8. Observera att viabla celler bilda ett band (buffy coat) på 44% till 67% gränssnittet, döda celler och vissa epitelceller är en slemmig film överst i övertoningen, och de röda blodkropparna är i pelleten. Ta bort det översta lagret av övertoningen till inom ~ 2 cm från gränssnittet genom vakuum aspiration. Använda en Pasteur-pipett för att skörda den buffy coat på gränssnittet och överföra dem till en 50 mL konisk tub som innehåller 40 mL kall skörd media.
  9. Pellet celler genom centrifugering vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL kall skörd media. Räkna viabla celler med trypan blå utslagning.

5. isolering av Lamina Propria lymfocyter från tunntarmen

  1. Ta bort epitelceller från Tarmvävnaden bitar genom att lägga till 25 mL EDTA-lösning som förvärmd till kolven som innehåller de återstående intestinal bitarna. Uppståndelse kolven vid 37 ° C och 220 rpm på en magnetomrörare för 30 min. Använd en stor magnet på utsidan av kolven att hålla stir-baren och noggrant avlägsna supernatanten samtidigt intestinal bitar inom kolven.
    Obs: a EDTA är en kalcium kelator som mål kalcium-beroende korsningar och främjar avskildheten av tarmepitelceller. (ii) supernatanten bör vara molnigt och kan användas för att isolera IEC om sin samling önskas.
  2. Upprepa steg 5.1.
    Obs: Supernatanten bör vara mindre molnigt efter denna inkubation. Kvalitetskontroll: En bit vävnad kan tas bort och kollade histologiskt att tarmepitelceller har tagits bort och basalmembranet är intakt. Ett prov från supernatanten kan även bedömas av flödescytometri att bekräfta att leukocyter (CD45+ celler) är frånvarande.
  3. Tillsätt 50 mL RT skörd media till kolven. Rör om kort med en magnet. Låt intestinal bitar bosätta sig och noggrant avlägsna supernatanten.
    Obs: Det här steget säkerställer avlägsnande av EDTA innan kollagenas matsmältningen som EDTA inactivates kollagenas av kelatbildande kalcium som är kritiska för kollagenas funktion.
  4. Tillsätt 30 mL förvärmd kollagenas lösning till kolven och rör intestinal bitar vid 37 ° C och 220 rpm på en magnetomrörare för 45 min.
  5. Överföra smält vävnad och supernatanten till en 50 mL konisk slang genom filtrering genom en sil med 70 µm i cellen. Försiktigt separera kvarvarande vävnad bitar med hjälp av kolven i en 3-mL spruta för att mosa genom filtret. Tvätta filtret med 10 mL kall skörd media.
  6. Pellet celler genom centrifugering vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 8 mL omgivningstemperatur 44% GD lösning.
  7. Överföring 8 mL 44% GD lösning/cellsuspensionen till en 17 mm ø x 100 mm stil 14 mL polypropylen runda-botten röret. Underlag med 5 mL omgivningstemperatur 67% GD lösning. Centrifugera Övertoningarna vid rumstemperatur och 1600 × g i 20 min med ingen broms.
  8. Ta bort fett lager på toppen av vakuum aspiration. Använda en Pasteur-pipett för att skörda den buffy coat på gränssnittet och överföring till en 50 mL konisk tub som innehåller 40 mL kall skörd media.
  9. Pellet celler genom centrifugering vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL kall skörd media. Räkna viabla celler med trypan blå utslagning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk representation av protokollet är avbildad (figur 1). Lymfocyter i tarmslemhinnan induktiva och effektor platser anordnas tydligt. Peyer's patchar (PP) och mesenteriala lymfkörtlar (MUSD) innehåller lymfocyter i välorganiserade T-cells-områden och B-cell folliklar, intestinala epitelet innehåller lymfocyter som distribueras mer diffust. Lamina propria (LP) innehåller både diffust distribuerade lymfocyter och lymfocyter som finns inom organiserade lymfatisk strukturer som isolerade lymfoida folliklar (ILF) och cryptopatches. Varje intestinal immun fack kännetecknas också av en unik sammansättning av lymfocyter undergrupper (figur 2). MLN är huvudsakligen består av αβ T-celler (~ 70%), medan PP lymfocyter är mestadels B-celler (~ 80%). LP-lymfocyter sammansättning är till stor del beroende av stam men primärt består av αβ T-celler och B-celler. Skild från de andra intestinala fack, lymfocyter bosatta i epitelet är främst γδ T-celler (~ 60%) och αβ T-celler med i huvudsak ingen B-celler. Olika proportioner av αβ T-cell undergrupper finns också inom olika anatomiska platser i tarmarna. Αβ T cellerna i LP är främst CD4+ T cells (~ 70%), medan CD8α+ T celler (~ 85%) dominerar i intraepitelial (IEL) facket. CD8α+ αβ T-celler inom LP och IEL facken uttrycka den CD8αα homodimer eller den CD8αβ heterodimer medan induktiv webbplats CD8α+ αβ T celler huvudsakligen express den CD8αβ heterodimer (figur 3). Majoriteten av γδ T-celler i IEL kupén också uttrycka CD8α, medan γδ T-celler finns i MLN avsaknaden CD8α (figur 3). Oavsett generaliseringar, sammansättningen av lymfocyter undergrupper kan variera mellan mus stammar och kan bli ändras med ålder eller sjukdom. Som sådan, bör en noggrann analys av lymfocyter populationer inom tarmslemhinnan vid steady-state utföras i bakgrunden stam utnyttjas för de experimentella manipulationer.

Cell avkastningen kan variera kraftigt beroende på stam och ålder av möss och experimentella förhållanden användas. Enda, levande celler kan räknas på en hemocytometer eller en automatiserad cell räknar maskin med trypan blå utslagning. Antalet lymfocyter beräknas som: Cell count × CD45+ celler (%) i Gate 3 × lymfocyter (%) i Gate 4 (figur 2). Cirka 15 × 106 MLN lymfocyter, 5-10 × 106 PP lymfocyter, 2-5 × 106 LP lymfocyter och 3-6 × 106 IEL kan erhållas från en 8 - till 12-vecka-gammal naiva C57Bl/6 eller Balb/c mus. Flödesbaserade räknande pärlor kan alternativt användas för att kvantifiera cellpopulationer med förbehållet att cellförlust inträffar under processen färgning. Slutändan, konsekvens i räknar teknik upprätthållas inom labbet för att säkerställa att lämpliga jämförelser kan göras över experiment.

I detta protokoll används DTE behandling för att berika IEL, som följs av EDTA behandling ta bort IEC för optimal isolering av höganrikat lymfocyter. Två DTE behandlingar är tillräcklig för att isolera > 95% av IEL. Ett mycket litet antal lymfocyter kan också hittas för EDTA-behandling. Dessa lymfocyter liknar en blandning av IEL och LP lymfocyter (figur 4). En jämförelse av DTE och kombinerade DTE-EDTA behandling att isolera IEL har också utförts. Kombinerad DTE-EDTA behandling ökar IEC kontaminering i IEL preparatet (figur 5) och minskar slutliga avkastning av levande immunceller efter densitet gradient centrifugering. Densitet gradient centrifugering rekommenderas att isolera lymfocyter från de intestinala fack. Det tar bort döda hudceller, många epitelceller och slem, främja isolering av höganrikat lymfocyter och drastiskt minska flödescytometri förvärv gånger (figur 6).

Figure 1
Figur 1 . Flödesschema för isolering protokoll. DTE, dithioerythritol. EDTA, etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . En flödescytometri gating strategi för lymfocyter befolkningen från intestinal vävnader. Enstaka cellsuspensioner beredda från mesenteriala lymfkörtlar (MUSD), lamina propria (LP), Peyers patchar (PP) och intraepitelial (IEL) fack var fläckade fastställbara livskraft färgämne (t.ex. Live/Dead) och följande lysrör-märkt antikroppar: CD45 för identifiering av hematopoetiska celler, CD19 för B-celler, CD3ε för T-celler, T-cells receptor (TCR) β för αβ T-celler, TCRδ för γδ T-celler, CD8α för CD8α+ αβ T-celler och CD4 för CD4+ αβ T-celler. Gate 0 visade fram scatter (FSC) - A/side scatter (SSC) - A egenskaper. Gate 1 identifierade enstaka celler. Gate 2 identifieras levande celler. Gate 3 identifierade hematopoetiska celler. Gate 4 identifieras lymfocyter baserat på FSC-Andersson/SSC egenskaper. Gate 5 identifierat T-celler och B-celler. Gate 6 identifierade αβ T-celler och γδ T celler bland totalt T-celler. Gate 7 identifieras CD8α+ och CD4+ T celler i αβ T-cell befolkningen. Procentandelar (i rött typsnitt) inom falsk tomter motsvarar frekvensen av celler inom indikerade porten av föregående föräldrarnas befolkningen. Gate 0 och gate 1 Visa totala händelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Den fenotyp ofCD8α+ αβ T-celler och γδ T-celler i tarmen vävnader. Uttrycket av CD8β av CD8α+ αβ T-celler och uttryck av CD8α av γδ T-celler är avbildade. Procentandelar (i rött typsnitt) inom histogram motsvarar frekvensen av celler som uttrycker indikerade markören bland angivna föräldrarnas befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Sammansättningen av lymfocyter från DTE, EDTA och kollagenas behandlingar. Föräldrars Usenets strategin är densamma som i figur 2. Gate 5 identifierat T-celler och B-celler. Gate 6 identifierade αβ T-celler och γδ T celler bland totalt T-celler. Gate 7 identifieras CD8α+ och CD4+ T celler i αβ T-cell befolkningen. Procentandelar (i rött typsnitt) inom falsk tomter motsvarar frekvensen av celler inom indikerade porten av föregående föräldrarnas befolkningen. Lymfocyter från EDTA isolering bära likhet med en blandning av IEL och LP-lymfocyter som isolerats från DTE och kollagenas behandlingar, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . En jämförelse av DTE och kombinerade DTE-EDTA behandling för isolering av IEL. DTE behandling utfördes enligt detta protokoll. IEL samlades efter DTE behandlingar och före EDTA behandlingar. Kombinerad DTE-EDTA behandling utfördes på de samma koncentrationer som används i detta protokoll men på samma gång. FSC-A/SSC-A egenskaper, livskraft och andelen CD45+ hematopoetiska celler visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Effekterna av täthet lutning centrifugering på renheten av IEL och LP lymfocyter preparat. Enda cellsuspensioner isolerade enligt detta protokoll var föremål för täthet lutning centrifugering eller analyseras med flödescytometri direkt. FSC-A/SSC-A egenskaper, livskraft och andelen CD45+ hematopoetiska celler visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett detaljerat protokoll presenteras för isolering av lymfocyter från den intestinal mucosal induktiva (MUSD och PP) och effektor (LP och IEL fack) webbplatser. Protokollet har utvecklats för att balansera input (tid) och output (lönsamhet och avkastning) för att maximera produktivitet och resultat. Protokollet garanterar också minimal compartmental korskontaminering mellan LP och IEL fack.

Flera protokoll för isolering av immunceller från mus tunntarmen har varit publicerade3,4,5,6,7. De flesta av dessa protokoll fokusera på isolera immunceller från LP. Intestinala epitelet är en distinkt kupé från LP som är direkt utsatta för den yttre miljön och består av en unik sammansättning av lymfocyter. Senaste metoder försökt en mer global analys av immunförsvaret i tarmen genom att undersöka distinkta intestinal fack samtidigt för att förstå de unika aspekterna av immunreaktioner som förekommer i dessa avdelningar och relationer mellan dem. Därför önskas ett pålitligt protokoll för isolering av immunceller från alla dessa avdelningar. Två DTE behandlingar är tillräcklig för att isolera > 95% av IEL och vissa IEC. EDTA riktar kalcium-beroende korsningar och effektivt att lossa IEC. Supernatanten från de efterföljande EDTA-behandlingarna omfattar därför mestadels IEC. Ett mycket litet antal lymfocyter kan hittas i supernatanten efter EDTA behandling; dock erhålls ca 20-fold mer lymfocyter från DTE fraktionen. Dessutom lymfocyter av EDTA-behandlingen likna blandade populationer av IEL och LP lymfocyter (figur 4), vilket tyder på LP kontaminering från villi och krypta skador. Därför, i detta protokoll, IEL samlas från DTE behandling före EDTA behandling, maximera renhet genom att minimera cross-fack nedsmittning. Andra protokoll Använd sekventiell Ditiotreitol (DTT)-EDTA behandlingar eller kombinerad DTT-EDTA behandling för isolering av IEL5,6,7. DTT är en epimer av DTE och båda fungera som reduktionsmedel. I protokollen, DTT rapporteras att bara ta bort slem och EDTA används för att isolera IEL. Även om effekten av DTT och DTE inte var direkt jämfört, utvärderades IEL efter DTE eller kombinerade DTE-EDTA behandling. Inte överraskande, kombinerad DTE-EDTA behandling ökar IEC kontaminering i IEL preparatet (figur 5) och förekomsten av ett stort antal IEC minskade IEL avkastning efter densitet gradient centrifugering. Eftersom EDTA kan skada vissa villi och kryptor, kombinerade DTE-EDTA behandling kan också resultera i kontaminering av LP lymfocyter i IEL preparatet eller förlust av LP celler från LP isolering. Dessutom som > 95% av IEL isolerades från DTE fraktionen, separat DTE och EDTA behandlingar är att föredra. Vissa protokoll isolera lymfocyter utan att använda täthet lutning centrifugering för att berika immunceller6. Densitet gradient centrifugering tar ytterligare tid och förlust av vissa celler kan förekomma. Men den tar bort döda celler, epitelceller och slem, vilket leder till höganrikat lymfocyter befolkningen (figur 6), som hjälper till att förbättra upptäckten av små populationer av celler och avsevärt minskar förvärv tid för flöde flödescytometri. Densitet gradient centrifugering har rapporterat för att resultera i ändrade förhållande av mononukleära fagocytsystemet delmängder7; lymfocyter delmängd sammansättning verkar dock normalt. Det är särskilt praktiskt att utföra täthet lutning centrifugering för isolering av IEL. Sammantaget presenteras ett komplett protokoll för att isolera höganrikat och optimalt livskraftiga lymfocyter från alla intestinal vävnader inklusive LP och IEL med minimal cross-compartmental kontaminering.

Betydande tid och omsorg måste tas under vävnad isolering steg begränsa kontaminering mellan preparat. Ofullständig borttagning av PP kan kraftigt skeva LP lymfocyter. ILF kan också förorena LP preparat. Dock ILF kan inte ses med blotta ögat och därför inte kan avlägsnas kirurgiskt innan matsmältningen. Annan mus stammar har olika antal ILF14, som kraftigt kan bidra till den varierande sammansättningen av LP lymfocyter mellan mus stammar. När du tar bort slem, ska du försiktigt glida tarmen för att undvika skador på basalmembranet och LP, vilket kan resultera i LP kontaminering av IEL. En indikation på kontaminering är förekomsten av stort antal B-celler i IEL preparatet. IEL innehåller några B-celler (~ 1% eller mindre), medan LPL kan ha upp till 60% B celler beroende på mus stammen. CD19 men inte B220 bör användas för att identifiera B-celler i LP och IEL kupén, som intestinal T-celler kan också uttrycka B22015. Dessutom kan många intestinal T-celler uttrycker traditionella makrofag och DC markörer såsom CD11b och CD11c, respektive16. Ordentlig dump gating strategier bör därför utnyttjas för att säkerställa lämplig analys.

Stegen kan ändras så att forskarnas behov. Mekanisk matsmältningen kan räcka för PP lymfocyter isolering vid steady state eller kollagenas rötning av lymfkörtlar kan underlätta isolering av vissa grupper av leukocyter vid inflammation. Typ av kollagenas används kan ha betydande inverkan på cell surface markör uttryck och livskraft och renhet av LP lymfocyter5,17. Tarmen kan skäras i små bitar för kollagenas matsmältningen, vilket kan öka cellen avkastning. Det minskar dock också lönsamheten. Inkubationstiden med kollagenas kan vara optimerad för att maximera avkastningen och minimera den celldöd, leder till maximal återvinning av levande celler. Olika laboratorier använder något olika täthetlutningar för att isolera lymfocyter. En väletablerad 44% / 67% täthet lutning protokoll presenteras här. Forskare kan testa olika täthetlutningar som bäst passar deras individuella behov. Om ett större antal lymfocyter önskas, kan två små tarmarna kombineras för DTE behandlingar, EDTA behandlingar och kollagenas matsmältningen. Om fler än två tarmar behövs för att pröva extremt sällsynta händelser, är det rekommenderat att enda cellsuspensioner sammanförs efter isolering.

Isolerade lymfocyter kan användas för ytterligare fenotypiska, funktionella och genomisk analys. När du utför flöde flödescytometrisk analys, är det tillrådligt att alltid använda en livskraft färgämnen och anti-CD45 antikropp att utesluta döda celler och icke-hematopoetiska celler, som kommer att kraftigt förbättra analysen. Om ren lymfocyter befolkningen behövs, cell sortering av CD45+ celler tillsammans med andra markörer för val kan utföras. Panorering på anti-CD8α-belagda plattor kan också användas för att isolera ren T-celler från IEL förberedelse som majoriteten av dessa T-celler express CD8α. Panorering eller cell sortering krävs generellt för kultur av IEL som kontaminerande epitelceller kan hämma IEL tillväxt. Mataren celler såsom naiva splenocytes kan också läggas för att främja IEL överlevnad i kultur. Om matare används, är det viktigt att utnyttja congenically omaka celler för att skilja populationer. Bakteriell kontaminering är sällan ett problem i dessa funktionella korttidsstudier som skörden media innehåller penicillin, streptomycin och gentamicin. Dessutom många tvätt steg och täthet lutning centrifugering ta bort de flesta bakterier.

Isolering processen är tidskrävande och kräver en balans mellan vård, precision och hastighet för optimalt resultat. Tillräckligt med tid måste spenderas för att säkerställa korrekt manipulation av varje steg samtidigt minimera tiden mellan mus offer och att erhålla en enda cellsuspension för att maximera cellernas viabilitet och avkastning. Detta är en känslig balans som också är en flaskhals för nybörjare som försöker få konsekvens i isolera lymfocyter med hög lönsamhet och avkastning. En hela isolering process från mus dödshjälp till att erhålla en räknade enda cellsuspension tar en erfaren forskare ca 8 h för 8 möss. Det rekommenderas att få stöd för fler än 8 möss att generera hög kvalitet och reproducerbara resultat. Det är viktigt att försiktig när man jämför lymfocyter från dessa vävnader med lymfocyter från mjälte, blod eller andra lymfoida vävnader som de omfattande inkubationer kan leda till konstgjorda förändringar i samband med den isolering förfarande17. Rutinmässiga jämförelser av LP och IEL befolkningar att på samma sätt behandlade lymfvävnad skulle bedöma huruvida markören sevärdheter moduleras under lymfocyter isolering från intestinal vävnader. Liknande frågor är också ett stort problem när man jämför RNA profiler från tarmarna med de från lymfvävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

B.S.S. stöds av NIH grant (R01 AI076457) och medel från Stony Brook University. Z.Q. stöds av NIH bevilja (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Tags

Immunologi fråga 132 lymfocyter tunntarmen mesenteriala lymfkörtlar Peyers plack lamina propria intraepitelial lymfocyter flödescytometri
Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating… More

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter