Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Abstract

Bağırsak bağışıklık sistemi etkili bağışıklık yanıtlarını enteropathogenic montaj sırasında hoşgörülü yanıt diyet antijenleri ve Komensal bakteriler oluşturarak gastrointestinal sistem bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar mikroplar. Buna ek olarak, yerel bağırsak dokunulmazlık uzak ve sistemik bağışıklık üzerinde derin bir etkisi vardır açık hale gelmiştir. Bu nedenle, çalışma nasıl bir bağırsak bağışıklık yanıtı indüklenen ve immünolojik sonuç yanıtın ne önemlidir. Burada, detaylı bir protokol gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri gibi ince bağırsak endüktif sitelerinden ve lamina propria gibi siteler efektör lenfositler yalıtım için açıklanan ve bağırsak epitel. Bu teknik en uygun saflık ve canlılığı ve kabul edilebilir zaman kısıtlamaları içinde en az çapraz compartmental bulaşma ile yalıtım lenfositler küçük bağırsak dokulara gelen çok sayıda sağlar. Lenfositler ve bağırsak dokularında diğer bağışıklık hücreleri izole etmek için teknik yeteneği gastrointestinal enfeksiyonlar, kanser ve inflamatuar hastalıklar bağışıklık yanıtlarını anlayış sağlar.

Introduction

Gastrointestinal (GI) sistem birçok kıvrımlar ve iç vücut ve dış çevre ayıran en büyük arabirimini gösterir çıkıntılar vardır. Bağırsak bağışıklık sistemi GI yolu bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar. Sürekli diyet antijenleri, Komensal bakteriler ve patojenik mikroplar maruz. Bu nedenle, bu hızla enteropathogenic mikroplar1etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için kapasite koruyarak gıda antijenleri ve Komensal bakteriler için dayanıklı kalması gerekir. Bağırsak bağışıklık sisteminin anatomik olarak sunulması antijenleri bağırsak mukoza üzerinden taşıyan hücreler antijen tarafından saf lenfositler etkinleştirdiğiniz yere, endüktif ve nerede aktive lenfositler belirli sarfetmek efektör siteleri, bölünmüş olabilir efektör fonksiyonları2. Endüktif siteleri doğrudan eylem özel M hücreler ve bölgesel boşaltma Mezenterik lenf düğümleri (milyon) yoluyla intestinal Lümen anketler organize lenfoid yapı Peyer's yamalar (PP) oluşturmaktadır. Membran ve bağırsak epiteli, intraepitelyal lenfosit (IEL) içeren membran yer alan bir tek hücre katmanı altındaki bağ dokusu olan lamina propria (LP), efektör siteleri oluşur. Lenfositler enfeksiyonlar ve kanser karşı koruma aracılık ve immunopathology inflamatuar hastalıklarda da katkıda büyük oyuncular edinilmiş bağışıklığın vardır. Bu önemlidir ve bu farklı lenfosit çalışmaya son derece alakalı anatomik Mukozal bölmeleri için daha iyi indüksiyon ve efektör fonksiyonları anlıyorum.

Bağırsaklarda oluşan bağışıklık olaylar keşfetmek müfettişler sayısı hızlandırılması gibi nispeten basit ve Birleşik iletişim kuralı üzerinden bu bölmeleri lenfositlerin yalıtım için gereklidir. Birkaç araştırma grubu fare küçük bağırsak bölmeleri3,4,5,6,7 bağışıklık hücreleri izole için birkaç benzer işlemler paylaşır protokolleri yayınladık . Ancak, tek iletişim kuralı odak bağlı olarak aralarında birkaç teknik farklar vardır. Örneğin, LP üzerinden bağışıklık hücreleri izole odaklı, bir protokol hücre canlılığı, hücre yüzey marker ifade ve izole bağışıklık hücreleri5kompozisyon çeşitli Enzimatik sindirim etkisini inceliyor. Başka bir protokol için yalıtım lenfositler yoğunluğu Santrifüjü6olmadan hızlı ve tekrarlanabilir yöntemi vurgulamaktadır. Son olarak, belirli protokoller Ayrıca bağırsağın7farklı doku katmanlarından Mononükleer fagositler yalıtma amacıyla bulunmaktadır. Burada, ince bağırsak milyon, s, LP ve IEL kartı yuvası üzerinden lenfosit nüfusun sıralı yalıtım sağlayan son derece tekrarlanabilir bir protokol sunulmuştur.

Biz yüksek oranda saflaştırılmış örneğin alınma olasılığını büyük ölçüde kirletici bağırsak diğer bölmeleri üzerinden ücretsiz LP ve IEL bölmeleri izole odaklanır. Bu yaygın kullanılan iletişim kuralı üretir kabul edilebilir saat kısıtlamaları4,8,9,10,11,12içinde sonuna kadar saf ve uygun lenfositlerin yüksek bir verim. Bu iletişim kuralı da iyi niyetli bir fırsat bu ayrı bölmeleri lenfosit çalışma izin en az çapraz compartmental bulaşma ile LP ve IEL yuvası üzerinden lenfositlerin yalıtım sağlar. İzole lenfositler akış sitometrik çözümlemesi veya fonksiyonel analiz gibi daha fazla manipülasyonlar tabi. Bu iletişim kuralı başarıyla lenfositler yalıtım için fare ince bağırsak ve kolon Listeria Monositogenez, Salmonella typhimuriumve Yersinia pseudotuberculosis gibi bakteriyel enfeksiyonlar sırasında uygulanmış enfeksiyonlar ve kimyasal ve patojen bağlı kolit gibi inflamatuar koşulları. Bu iletişim kuralı, dendritik hücreler, makrofajlar, nötrofil ve monosit fare ince bağırsak ve kolon gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri izole etmek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüsü kılavuzlarınıza uygun olarak yapılan ve Stony Brook Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış.

Not: tüm onayları yordamları gerçekleştirmeden önce sahip olduğunuzdan emin olun.

1. çözüm hazırlık

  1. HGPG (HEPES, L-glutamine, penisilin/streptomisin ve viomisin), 100 ×
    1. 14.6 g L-glutamin (200 mM son), 1 × 10 59.6 g HEPES (500 mM son), mix6 U penisilin (2.000 U/mL son), 1 g streptomisin (2 mg/mL son) ve 2.5 mg gentamisin (5 µg/mL son). RPMI ekleyin 1640-500 mL. PH 7.5 NaOH kullanarak için ayarlamak (önce ayarlama, arabellek sarı/pH yaklaşık 6.0 ile turuncu). Filtre sterilize 0,45 µm filtre kullanarak. Aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 1 yıl veya 4 ° c ilâ 1 ay için.
  2. Bikarbonat HEPES tampon, 10 x
    1. 23,8 g HEPES (100 mM son), 21 g NaHCO3 (250 mM son) mix ve 1000 mL su ekleyin. 7,2 pH HCl. filtresiyle ayarlamak 0,45 mikron filtre sterilize. Oda sıcaklığında saklayın. PH zaman içinde değişir. PH düzenli olarak yeniden ayarlayın.
  3. Hasat medya (~ 1 şişe/2 fareler)
    1. 500 mL RPMI 1640, 25 mL ısı inaktive fetal sığır serum (% 5) son ve 5 mL 100 × HGPG ekleyin. 6 ay 4 ° C'de depolayın
  4. Dithioerythritol (DTE) çözüm (40 mL/küçük bağırsak)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks dengeli tuz solüsyonu, Ca2+- ve Mg2+-özgür, 50 mL 10 × bikarbonat HEPES tampon ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum (% 10 final). 350 mL H2O ve 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM son) ekleyin. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
  5. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm (50 mL/küçük bağırsak)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks dengeli tuz solüsyonu, Ca2+- ve Mg2+-5 mL 100 × HGPG ile ücretsiz. 445 mL H2O. eklemek 260 µL 0,5 M EDTA ekleyin/100 mL (1.3 mM son). Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
  6. Collagenase çözüm (30 mL/LP)
    1. 500 mL RPMI, 50 mL FBS ekleyin (% 10 FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl2 (1 mM son) ve 1 mL 0.5 M CaCl2 (1 mM son). Tip ı (100 U/mL final), collagenase ekleyin. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
  7. Yoğunluk gradient (DG) çözümleri
    1. 90 mL DG hisse senedi çözüm karıştırarak 1 × DG hisse senedi çözüm hazırlamak ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) 10 mL 10 × PBS ile. 4 ° C'de steril tutmak
    2. % 44 DG çözüm (8 mL/IEL, 8 mL/LP) 44 mL 1 × DG hisse senedi çözüm ve 56 mL RPMI 1640 karıştırarak hazırlayın. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
    3. % 67 DG çözüm (5 mL/IEL, 5 mL/LP) 67 mL 1 × DG hisse senedi çözüm ve 33 mL RPMI 1640 karıştırarak hazırlayın. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.

2. Mezenterik lenf düğümleri, bağırsak, yalıtım ve Peyer's yamalar

  1. Karbondioksit narkozu ve ikincil servikal çıkığı kullanarak fare ötenazi. Sırtında fareyi getirin ve % 70 etanol ile sprey. Cilt ve Periton boşluğu ortaya çıkarmak için karın duvarı açmak ve makas bir ensizyon yapmak için kullanın.
  2. Caecum bulun ve caecum yavaşça çekmeye forseps kullanın. Forseps dikkatli bir şekilde sağa, iki nokta üst üste ile uyumlu tüm MLN zinciri açığa bağırsağın taşımak için kullanın.
    Not:13zincir ve lenfatik drenaj bağırsaklar daha önce oldu Mezenterik lenf düğümlerinin bir harita tasvir.
  3. Zincirdeki en yakın çekum için bulunan alt düğümü tanımlamak. Forseps kümesi bıçaklanmasından/fat etrafında kavramak ve yavaşça MLN zinciri alttan yukarı FAT'tan başka bir set Forseps ile lenf nodu çevresinde tweezing tarafından kaldırmak için kullanın.
  4. MLN zinciri hasat medya ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu. Zinciri kağıt kule üzerinde haddeleme ve forseps iki kümesini içeren yağ çekme bıçaklanmasından/yağ çıkarmak. Yer soğuk hasat medya daha sonra izolasyon adımlar için MLN.
    Not: (i) doğrudan düğümleri kullanımı önerilmez. Bunun yerine, bıçaklanmasından/fat çevrelerindeki kavramak. (ii) bu kadar bıçaklanmasından/yağ hücre canlılık geliştirmek için mümkün olduğunca çıkarmak için önemlidir.
  5. İnce bağırsak Pilor sfinkter altındaki ve üstündeki makas kullanarak çekum kesti. Bağırsak yavaş yavaş ileum için ekli bıçaklanmasından/fat forseps başka bir set kullanarak kaldırma sırasında bir forseps kümesi kullanarak oniki parmak bağırsağı çekin.
  6. Bağırsak hasat medya ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yerleştirin ve kalan bıçaklanmasından/yağ kapalı Forseps ile iki alay.
    Not: (i) optimum hücre verim ve canlılık için mümkün olduğu kadar bıçaklanmasından/fat kaldırdığınızdan emin olun. (ii) bu ve aşağıdaki adımları düzenli aralıklarla hasat medya uygulayarak nemlendirilmiş bağırsak tutun.
  7. Peyer's yamalar yanında izale onları--dan bağırsak eğri makas ile toplamak. Bir diseksiyon kapsamı veya Büyüteç (yeni başlayanlar); gerekirse kullanın çoğu Peyer's yamalar eğitimli gözle görünür olmalıdır. 5-11 (tipik) Peyer's yamalar bağırsağın toplamak. Daha sonra izolasyon adımlar için soğuk hasat medyada yer Peyer'ın yamalar.
    Not: Peyer's yamalar küçük, öncelikle yuvarlak çıkıntı yolun bıçaklanmasından ekin karşısında dış bağırsak duvarında.
  8. Fekal içerik ve mukus sınırdışı duodenum ileum doğru forseps ve yavaşça slayttan düz tarafını kullanıyorsunuz. Mukus çoğunu kaldırmak için bir kez yineleyin.
    Not: Eksik mukus kaldırılması hücre canlılığı azaltmak ve verim. Yine de, yavaşça villus sıyırma veya Membran zarar önlemek için bağırsak slayt emin olun.
  9. Bir noktada bir künt ucuyla iyi makas kullanın, künt sonuna bağırsak yerleştirin ve bağırsak ileum için boyuna duodenum arasında açık kesti. Yan yana açılan bağırsak ~ 2 cm parçalar halinde kesin. Bağırsak adet 25 mL soğuk hasat medya daha sonra izolasyon adımlar için bir 50 mL konik boru yerleştirin.
    Not: medya ile nemlendirilmiş makas tutma zahmetsizce bağırsak slayt yardımcı olacaktır.

3. yalıtım lenfositleri endüktif sitelerden

  1. Lenfositler MLN dan yavaşça 3 mL şırınga pistonu kullanarak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla dissociating tarafından izole et. Hücre süzgeç 5 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.
  2. Pelet MLN-hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.
    Not: kırmızı kan hücre lizis arabellek kanama kaldırma işlemi sırasında oluşursa, kırmızı kan hücreleri kaldırmak için kullanılabilir.
  3. Lenfositler Peyer's yamalar dan Peyer's yamalar 37 ° C ve 30 dk için 220 devir/dakika 5 mL prewarmed collagenase solüsyon içeren 15 mL konik tüp içinde kuluçka tarafından izole et.
  4. Girdap 15 s maksimum ayar ve filtre doku ve süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL konik tüp içine sindirmek. Yavaşça bir 3-mL şırınga pistonu kullanarak kalan doku parçaları ayırmak ve hücre süzgeç 5 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.
  5. 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Peyer's yama hücreleri cips ve hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.
    Not: yamalar yalıtım Peyer bazı bulaşıcı lamina propria lenfositler ve intraepitelyal lenfositlerin olabilir.

4. ince bağırsak üzerinden intraepitelyal lenfositlerin yalıtım

  1. Tüpü 10 kat ters çevirme, bağırsak adet yerleşmek izin ve süpernatant dökme ince bağırsak parçalar üç kez 25 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.
    Not: Doku parçaları kolayca tüp altına yerleşmek. Eğer onlar yapmak değil, çok fazla bıçaklanmasından/fat bağlı kalır veya bunların bir hava kabarcığı ile ilişkili olduğu bir gösterge 's.
  2. Bağırsak parçaları içeren 50mL konik tüp 20 mL prewarmed DTE çözeltisi ekleyin ve bir 50 mL siliconized Erlenmeyer bir heyecan-bar içeren şişesi için transfer. 37 ° C'de karıştırın ve bir manyetik karıştırıcı 20 dakika süreyle üzerinde 220 devir/dakika büyük bir mıknatıs balonun dışarıdan heyecan-bar tutun ve doku ve çözüm 50 mL konik tüp geri aktarmak için kullanın.
  3. Girdap tüp için 10 s. Transfer süpernatant bir yeni 50 mL konik tüp içine orijinal tüpte doku parçaları tutmak için dikkatli olmak bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla ayarlama maksimumda. Süpernatant; atmayın süpernatant intraepitelyal lenfosit içerir. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 10 mL soğuk hasat medyada resuspend ve buz üzerinde saklayabilirsiniz.
  4. Bağırsak parçaları içeren 50mL konik tüp 20 mL prewarmed DTE çözeltisi ekleyin ve geri 50 mL siliconized Erlenmeyer bir heyecan-bar içeren balon için transfer. 37 ° C'de karıştırın ve bir manyetik karıştırıcı 20 dakika süreyle üzerinde 220 devir/dakika büyük bir mıknatıs balonun dışarıdan heyecan-bar tutun ve doku ve çözüm 50 mL konik tüp geri aktarmak için kullanın.
    Not: DTE intraepitelyal lenfositlerin zenginleştiren bir indirgeyici var.
  5. Girdap tüp için 10 s. Transfer süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla süpernatant ilk DTE tedavi (Kimden adım 4.3) hücrelerden içeren önceki tüp içine ayarlama maksimumda.
    Not: Kalan bağırsak adet lenfositler lamina propria dan izole etmek için kullanılır. Kalite kontrol: Doku bir parça kaldırıldı ve histolojik olarak epitel hücresi varsa ve membran sağlamdır emin olmak için kontrol ettim.
  6. Pelet hücreleri süpernatant 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 8 mL % 44 DG çözeltisi (RT) oda sıcaklığında resuspend.
  7. Transfer 8 mL % 44 DG çözüm/hücre süspansiyon 17 mm ø x 100 içine mm 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp tarzı. 5 mL RT % 67 DG çözeltisi ile altına koymak. 1600 × g 20 dk, RT için de freni kullanmadan santrifüj kapasitesi.
    Not: Tüpler hücreleri tüp duvarlara yapışmasını önlemek için sığır serum ile pretreated.
  8. Not hücrelerin bir grup (buffy ceket) %44 67 arayüzü oluşturmak, geçişin en üstündeki mukoid bir filmde ölü hücreleri ve bazı epitel hücreleri vardır ve kırmızı kan hücreleri içinde Pelet vardır. Degradeye ~ 2 cm arabiriminin üst tabakası tarafından vakum aspirasyon kaldırın. Pasteur pipet buffy mantoyu arayüz hasat ve bir 50 mL konik tüp 40 mL soğuk hasat ortamı içeren aktarmak için kullanın.
  9. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.

5. yalıtım üzerinden ince bağırsak Lamina Propria lenfositlerin

  1. Epitel hücreleri kalan bağırsak parçayı içeren şişeye 25 mL prewarmed EDTA çözeltisi ekleyerek bağırsak doku parçaları kaldırın. Heyecan şişesi 37 ° C ve üzerinde 30 dakika süreyle bir manyetik karıştırıcı 220 devir/dakika, heyecan-bar tutun ve dikkatle süpernatant balonun içinde bağırsak adet tutarken atmak için balonun dışarıdan büyük bir mıknatıs kullanın.
    Not: kalsiyum-bağımlı kavşak hedefler ve dekolmanı bağırsak epitel hücrelerinin bir kalsiyum şelatör EDTA (i) dir. (ii) süpernatant bulutlu olmalı ve onların toplama istenirse IEC yalıtmak için kullanılabilir.
  2. 5.1 arasındaki adımları yineleyin.
    Not: Süpernatant bu kuluçka takip daha az bulutlu olması gerekir. Kalite kontrol: Doku bir parça kaldırıldı ve histolojik olarak bağırsak epitel hücreleri kaldırıldı ve membran sağlamdır emin olmak için kontrol ettim. Bir örnek üzerinden süpernatant Ayrıca onaylamak için Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir o lökosit (CD45+ hücreleri) yok.
  3. RT hasat Medya 50 mL şişe için ekleyin. Kısaca bir mıknatıs ile karıştırın. Yerleşmek ve dikkatle süpernatant atın bağırsak adet izin.
    Not: EDTA collagenase için collagenase işlevi önemlidir kalsiyum şelat tarafından inaktive gibi EDTA kaldırma collagenase sindirim önce bu adım sağlar.
  4. Şişesi için 30 mL prewarmed collagenase çözeltisi ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı 45 dakika için üzerinde bağırsak adet 37 ° C ve 220 devir/dakika karıştırın.
  5. Transferi doku ve 50 mL konik tüp süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla süzme yoluyla sindirmek. Yavaşça kalan doku adet filtreden püre için 3 mL şırınga pistonu kullanarak ayırmak. 10 mL soğuk hasat medya filtresiyle yıkayın.
  6. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 8 mL ortam sıcaklığı % 44 DG çözüm resuspend.
  7. Transfer 8 mL % 44 DG çözüm/hücre süspansiyon 17 mm ø x 100 içine mm 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp tarzı. 5 mL ortam sıcaklığı % 67 DG çözeltisi ile altına koymak. Oda sıcaklığında ve 1600 × g 20 dk için hiçbir fren degradeler santrifüj kapasitesi.
  8. Şişman katmanın üst tarafından vakum aspirasyon kaldırın. Buffy mantoyu arabirimi ve 40 mL soğuk hasat ortamı içeren bir 50 mL konik tüp aktarmak, hasat için bir Pasteur pipet kullanın.
  9. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol şematik gösterimi tasvir edilir (şekil 1). Lenfositler efektör siteleri ve bağırsak mukoza endüktif içinde belirgin bir biçimde düzenlenir. Peyer's yamalar (PP) ve Mezenterik lenf düğümleri (milyon) içerir lenfositler iyi organize edilmiş T-hücre ve B-hücre köklerinin, bağırsak epitel daha diffüz dağıtılır lenfosit içerir, ancak. Lamina propria (LP) havza dağıtılmış lenfositler ve izole lenfoid follikül (IIf) ve cryptopatches gibi organize lenfoid yapılar içinde yer alan lenfosit içerir. Her bağırsak bağışıklık bölmesi ayrıca lenfosit alt grupları (Şekil 2) benzersiz bir bileşimi tarafından Harles. MLN PP lenfositler çoğunlukla B hücreleri (~ %80) iken αβ T hücrelerinin (~ %70), oluşan ağırlıklı olduğunu. LP lenfosit kompozisyon büyük ölçüde zorlanma bağımlı ama öncelikle αβ T hücreleri ve B hücreleri oluşmaktadır. Bağırsak diğer bölmeleri, epitel içinde ikamet eden lenfosit ağırlıklı olarak γδ T hücreleri (~ %60) ve αβ T hücrelerinin aslında hiçbir B hücreleri ile farklıdır. αβ T hücre alt kümeleri farklı oranlarda da bağırsak içindeki farklı anatomik yerlerde bulunmaktadır. LP αβ T hücreleri CD4 esas olarak vardır+ T hücreleri (~ %70), CD8α+ T hücreleri (~ %85) ağırlıklı intraepitelyal lenfosit (IEL) kompartımanda. CD8α+ αβ T hücreleri LP ve IEL bölmeleri içinde ifade CD8αα homodimer veya CD8αβ heterodimerdir ise endüktif sitesi CD8α+ αβ T hücreleri çoğunlukla hızlı CD8αβ heterodimerdir (şekil 3). γδ T hücreleri MLN olmaması CD8α bulundu iken γδ T hücreleri IEL yerde çoğunluğu da CD8α, hızlı (şekil 3). Genel bilgiler, ne olursa olsun lenfosit bileşimi fare suşları arasında değişebilir ve yaş veya hastalık ile değişmiş olur. Bu nedenle, dikkatli bir analiz içinde kararlı durum, bağırsak mukoza lenfosit nüfusun deneysel manipülasyonlar için kullanılan arka plan zorlanma yapılmalıdır.

Hücre verim büyük ölçüde zorlanma ve fareler ve kullanılan deneysel koşullar yaş bağlı olarak değişebilir. Tek, canlı hücreler bir hemasitometre veya trypan mavi dışlama kullanarak bir otomatik hücre sayım makinesi sayılabilir. Lenfosit sayısı olarak hesaplanır: hücre sayısı × CD45+ hücreleri (%) kapı 3 × lenfositler (%) kapısı 4 (Şekil 2). Yaklaşık 15 × 106 MLN lenfositler, 5-10 × 106 s lenfositler, 2-5 × 106 LP lenfositler ve 3-6 × 106 IEL bir 8 - için 12-hafta-yaşlı saf C57Bl/6 veya Balb/c fare elde edilebilir. Alternatif olarak, sayım boncuk akış tabanlı hücre popülasyonlarının hücre kaybı boyama işlemi sırasında oluşan ihtar ile ölçmek için kullanılabilir. Sonuçta, teknik sayma tutarlılık uygun karşılaştırma deneyleri arasında yapılabilir emin olmak için laboratuvar içinde muhafaza edilmelidir.

Bu protokol için DTE tedavi zenginleştirilmiş lenfositler optimum yalıtım için IEC kaldırmak için EDTA tedavi ardından IEL zenginleştirmek için kullanılır. İki DTE tedaviler yalıtmak için yeterli > IEL % 95'i. Lenfositler çok az sayıda da EDTA tedavisinde bulunabilir. Bu lenfositler IEL ve LP lenfositler (şekil 4) karışımı benzer. DTE tedavi ve IEL yalıtmak için kombine DTE-EDTA tedavi karşılaştırma da sahne aldı. Kombine DTE-EDTA tedavi IEC kirlenme IEL hazırlık (şekil 5) artar ve yoğunluk gradient Santrifüjü sonra canlı bağışıklık hücreleri son verimi azaltır. Yoğunluk gradient Santrifüjü lenfositler bağırsak bölmeleri gelen izole etmek için tavsiye edilir. Büyük ölçüde azalan Akış Sitometresi edinme (şekil 6) Zaman ve ölü hücreleri, birçok epitel hücreleri ve mukus, zenginleştirilmiş lenfositler yalıtım teşvik kaldırır.

Figure 1
Resim 1 . Yalıtım iletişim kuralının akış şeması. DTE, dithioerythritol. EDTA, ethylenediaminetetraacetic asit. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Bir Akış Sitometresi bağırsak dokularında lenfosit nüfus için strateji geçişi. Mezenterik lenf düğümleri (milyon), lamina propria (LP), Peyer's yamalar (PP) ve intraepitelyal lenfosit (IEL) yuvası hazırlanan tek hücre süspansiyonlar tamir edilebilir canlılığı boya ile lekeli (örneğin canlı/ölü) ve aşağıdaki Floresan etiketli antikorlar: CD45 hematopoetik hücreler, B hücreleri için CD19, CD3ε T için tanımlanması için hücreleri, T-hücre reseptör (TCR) β αβ T hücreleri, γδ T hücreleri, CD8α için CD8α için TCRδ için+ αβ T hücreleri ve CD4 CD4 için+ αβ T hücreleri. İleri gösterdi kapısı 0 dağılım (FSC) - A/yüzü dağılım (SSC) - A özellikleri. Kapısı 1 tek hücreleri tespit. Geçit 2 canlı hücreleri tespit. Kapı 3 hematopoetik hücrelerin tespit. FSC-A/SSC-A özelliklerine göre belirlenen kapısı 4 lenfositler. Kapı 5 T hücreleri ve B hücreleri tespit edilmiştir. Kapı 6 tespit αβ T hücreleri ve γδ T hücreleri toplam T hücreleri arasında. Kapı 7 tespit CD8α+ ve CD4+ T hücreleri αβ T hücre nüfus içinde. Oranlarda (kırmızı yazı tipi) yalancı araziler içinde belirtilen kapıyı önceki ebeveyn nüfustaki içindeki hücreleri frekans karşılık gelir. Kapı 0 ve kapısı 1 Toplam olayları görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Fenotip ofCD8α+ αβ T hücreleri ve γδ T hücreleri bağırsak dokularda. CD8α tarafından CD8β ifade+ αβ T hücreleri ve CD8α γδ T hücreleri tarafından ifade tasvir. Oranlarda (kırmızı yazı tipi) çubuk grafikler içinde belirtilen ebeveyn nüfus arasında belirtilen işaret hızlı hücre frekans karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Lenfositler DTE, EDTA, collagenase uygulamaları üzerinden bileşimi. Ebeveyn gating strateji Şekil 2aynıdır. Kapı 5 T hücreleri ve B hücreleri tespit edilmiştir. Kapı 6 tespit αβ T hücreleri ve γδ T hücreleri toplam T hücreleri arasında. Kapı 7 tespit CD8α+ ve CD4+ T hücreleri αβ T hücre nüfus içinde. Oranlarda (kırmızı yazı tipi) yalancı araziler içinde belirtilen kapıyı önceki ebeveyn nüfustaki içindeki hücreleri frekans karşılık gelir. EDTA yalıtım lenfositleri DTE ve collagenase tedavisi, sırasıyla izole IEL ve LP lenfositler karışımı benzerlik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . DTE tedavi ve kombine DTE-EDTA tedavi IEL yalıtım için karşılaştırma. DTE tedavi bu protokole göre gerçekleştirildi. IEL toplanan DTE tedaviler sonra ve önce EDTA tedaviler. Kombine DTE-EDTA tedavi bu protokol için kullanılan Aynı konsantrasyonlarda ama aynı zamanda gerçekleştirildi. FSC-A/SSC-A özellikleri, canlılık ve CD45 yüzdesi+ hematopoetik hücrelerin gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . IEL ve LP lenfosit hazırlıkları saflığına dair yoğunluk gradient Santrifüjü etkisi. Bu protokole göre izole tek hücre süspansiyonlar yoğunluk gradient Santrifüjü tabi veya Akış Sitometresi tarafından doğrudan analiz edildi. FSC-A/SSC-A özellikleri, canlılık ve CD45 yüzdesi+ hematopoetik hücrelerin gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detaylı bir protokol endüktif (milyon ve PP) Mukozal lenfosit gelen bağırsak yalıtım için sunulur ve efektör (LP ve IEL yuvası) siteleri. Protokol giriş (zaman) ve çıkış (canlılık ve verim) verimlilik ve sonuçları maksimize etmek için dengelemek için geliştirilmiştir. Protokol Ayrıca LP ve IEL bölmeleri arasında en az çapraz compartmental bulaşma sağlar.

Fare bağırsağı bağışıklık hücreleri yalıtım için birkaç protokol-si olmak be yayınlanan3,4,5,6,7. Bu iletişim kuralları en LP üzerinden bağışıklık hücreleri izole üzerinde odak. Bağırsak epitel doğrudan dış ortama maruz ve lenfositler benzersiz bir bileşimi LP üzerinden farklı bir bölme var. Son yaklaşımlar aynı anda bağışıklık yanıtı bu bölmeleri ve ilişkileri içinde ortaya çıkan benzersiz özelliklerini anlamak için ayrı bölmeler bağırsak inceleyerek bağırsak bağışıklık fonksiyonu daha küresel bir analizini çalışmışlardır Bunlar arasında. Bu nedenle, bağışıklık bütün bu bölümler hücrelerinden yalıtım için güvenilir bir protokolü arzu edilir. İki DTE tedaviler yalıtmak için yeterli > IEL ve bazı IEC % 95'i. EDTA kalsiyum-bağımlı kavşak hedefleyen ve IEC ayırmak için etkilidir. Bu nedenle, sonraki EDTA tedavileri üzerinden süpernatant oluşturan çoğunlukla IEC. Çok az sayıda lenfosit süpernatant EDTA tedaviden sonra bulunabilir; Ancak, yaklaşık 20-fold daha fazla lenfositler DTE kesir elde edilir. Ayrıca, lenfositler EDTA tedaviden lenfositlerin villus ve crypt LP kirlenme öneriyor IEL ve LP (şekil 4), karışık nüfus benzer hasar. Bu nedenle, bu protokol için IEL toplanır önce EDTA tedavi, DTE tedaviden çapraz bölmeli kirlenme en aza indirerek saflık en üst düzeye çıkarma. Diğer protokoller sıralı dithiothreitol (DTT) kullanın-EDTA tedaviler veya kombine DTT-EDTA tedavi IEL5,6,7yalıtım için. DTT DTE bir epimer ve her ikisi de azalan bakiyeli aracıları olarak hareket. Bu iletişim kuralları, DTT mukus kaldırmak için bildirilir ve EDTA IEL izole etmek için kullanılır. Her ne kadar DTT ve DTE etkisi doğrudan kıyaslanamaz, DTE tedavi veya kombine DTE-EDTA tedavi sonra IEL değerlendirilmiştir. Doğal olarak, kombine DTE-EDTA tedavi IEC kirlenme IEL hazırlık (şekil 5) artar ve IEC çok sayıda varlığı IEL verimleri yoğunluk gradient Santrifüjü sonra azalmıştır. EDTA bazı villus ve kriptalarının zarar verebilir gibi kombine DTE-EDTA tedavi de LP lenfositler IEL hazırlık kirlenme veya LP yalıtım üzerinden LP hücrelerinin kaybı neden olabilir. Ayrıca, olarak > IEL % 95'i DTE kesir izole, ayrı DTE ve EDTA tedaviler tercih edilir. Bazı iletişim kuralları lenfositlerin bağışıklık hücreleri6zenginleştirmek için yoğunluk gradient Santrifüjü kullanmadan izole et. Yoğunluk gradient Santrifüjü ek zaman alır ve bazı hücrelerinin kaybı oluşabilir. Bununla birlikte, ölü hücreleri, epitel hücreleri ve hücre küçük nüfus tespiti geliştirmek için yardımcı olur ve satın alma zaman akışı için önemli ölçüde azalır zenginleştirilmiş lenfosit nüfus (şekil 6), önde gelen mukus, kaldırır sitometresi. Yoğunluk gradient Santrifüjü mononükleer fagosit alt kümeleri7değişmiş oranında sonuçlanması bildirdi; Ancak, lenfosit alt kompozisyon normal görünüyor. Yoğunluk gradient Santrifüjü IEL yalıtım için gerçekleştirmek özellikle yararlıdır. Genel olarak, bir iletişim tüm zenginleştirilmiş ve en iyi şekilde uygulanabilir lenfositler en az çapraz compartmental kontaminasyonu ile LP ve IEL gibi bağırsak dokularında yalıtmak için sunulmaktadır.

Önemli ölçüde zaman ve bakım doku yalıtım adımları sırasında kontaminasyon hazırlıkları arasında sınırlamak için alınması gerekir. PP tamamlanmamış kaldırılmasına büyük ölçüde LP lenfositler çarpık. IIf de LP hazırlıklar kontamine. Ancak, IIf çıplak gözle görülemez ve bu nedenle sindirim önce cerrahi kaldırılamaz. Farklı fare suşları ILF14LP lenfositler fare suşları arasında değişken bileşimi katkı, farklı numaralar var. Mukus kaldırırken, yavaşça kaydırın zarar vermemek için membran ve LP, IEL LP kirlenme içinde neden olabilir bağırsak emin olun. Bir kirlenme B hücreleri IEL hazırlık çok sayıda varlığı göstergesidir. IEL kaç B hücreleri içeren (% ~ 1 veya daha az), oysa LPL %60 B hücreleri fare zorlanma bağlı olabilir. Bağırsak T hücreleri de B22015hızlı gibi CD19 ama değil B220 LP ve IEL yerde B hücreleri tanımlamak için kullanılmalıdır. Ayrıca, birçok bağırsak T hücreleri geleneksel makrofaj ve DC işaretleri CD11b ve CD11c, sırasıyla16gibi hızlı. Bu nedenle, uygun dökümü stratejileri çoğunluğuna uygun analiz sağlamak için kullanılması gereken.

Adımları araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir. Mekanik sindirim kararlı duruma, PP lenfosit yalıtım için yeterli olabilir veya collagenase sindirim lenf nodlarının bazı alt kümeleri lökositlerin yalıtım enflamasyon sırasında kolaylaştırabilir. Collagenase kullanılan türü hücre yüzey marker ifade ve canlılığı ve saflık LP lenfositler5,17üzerinde önemli etkisi olabilir. Bağırsak hücre verim artışı collagenase sindirim için küçük parçalara kesilebilir. Ancak, aynı zamanda canlılığı azaltır. Collagenase kuluçka zamanla canlı hücreleri maksimum kurtarılması için önde gelen hücre ölümü en aza indirirken verimi en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş olması. Farklı labs biraz farklı yoğunluk gradyanlar lenfositler belirlemek için kullanın. Bir iyi kurulmuş % %44/67 yoğunluğu degrade protokol burada sunulmaktadır. Araştırmacılar en iyi onların bireysel ihtiyaçlarına uygun farklı yoğunluk gradyanlar test edebilir. Lenfositler daha çok sayıda isterseniz, iki küçük bağırsak DTE tedaviler, EDTA tedaviler ve collagenase sindirim için birleştirilebilir. İkiden fazla bağırsak son derece nadir olayları incelemek için gerekiyorsa, o zaman bu tek hücre süspansiyonlar yalıtım sonra havuza alınmış tavsiye edilir.

İzole lenfositler daha fazla fenotipik, işlevsel ve genom analizi için kullanılabilir. Akış sitometrik analiz yapılırken, bu her zaman için son derece tavsiye kullanımı bir canlılık Boyayıcılar ve ölü hücreleri ve analiz büyük ölçüde artıracaktır sigara hematopoetik hücreler dışlamak için anti-CD45 antikor var. CD45 sıralama saf lenfosit nüfus gerekiyorsa, hücre+ hücreleri ile birlikte diğer işaretleri seçim yapılabilir. Anti-CD8α-kaplamalı plakalar üzerinde kaydırma de hızlı CD8α çoğunluğu bu T hücreleri gibi IEL hazırlık saf T hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Epitel hücreleri kirletici IEL büyüme inhibe olabilir olarak kaydırma veya hücre sıralama genellikle IEL kültür için gereklidir. Besleyici hücreler saf splenocytes gibi IEL hayatta kalma kültürü tanıtmak için ekleyebilirsiniz. Besleyiciler kullanılması halinde, nüfus ayırt etmek için congenically eşleşmeyen hücreleri kullanmak önemlidir. Hasat medya penisilin, streptomisin ve gentamisin içerdiğinden bakteriyel kontaminasyon nadiren bu kısa vadeli fonksiyonel çalışmalar bir sorun olduğunu. Ayrıca, çok sayıda çamaşır adımları ve yoğunluk gradient Santrifüjü çoğu bakteri kaldırın.

Yalıtım işlem zaman alıcıdır ve en iyi sonuçlar için bir denge-bakım, hassas ve hız gerektiriyor. Fare kurban arasındaki süreyi en aza indirmek ve hücre canlılığı ve verimi en üst düzeye çıkarmak için bir tek hücre askıya alma sırasında uygun manipülasyonu her adım emin olmak için yeterli zaman geçirmiş gerekir. Bu aynı zamanda yüksek canlılık ve verim ile lenfositler izole tutarlılık elde etmeye yeni başlayanlar için bir performans sorunu olan hassas bir denge var. Fare ötenazi sayılan tek hücre süspansiyon elde etmek için başlayan bir tüm yalıtım işlem bir deneyimli araştırmacı yaklaşık 8 h 8 fareler için alır. Bu yüksek kalite ve tekrarlanabilir sonuçlar üretmek fazla 8 fareler için yardım almak için tavsiye edilir. Ne zaman bu dokuların üzerinden lenfositler lenfositler dalak, kan veya diğer lenfoid doku olarak geniş incubations ile karşılaştırma yalıtım yordamı17ile ilişkili yapay değişikliklere neden olabilir dikkatli olun ki. İşaretçiyi ilgi bağırsak dokularında lenfosit izolasyon sırasında modülasyonlu benzer şekilde tedavi lenfoid dokulara LP ve IEL nüfusun rutin karşılaştırmalar değerlendirmek. Benzer sorunlar da bağırsak RNA profillerden bu lenfoid doku ile karşılaştırıldığında önemli bir endişe vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

B.S.S. NIH grant (R01 AI076457) ve Stony Brook Üniversitesi tarafından sağlanan fonlar tarafından desteklenmektedir. Z.Q. NIH tarafından desteklenmektedir (K12 GM102778) verin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Tags

İmmünoloji sayı 132 lenfositler ince bağırsak Mezenterik lenf düğümleri Peyer's yamalar lamina propria intraepitelyal lenfositlerin Akış Sitometresi
Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating… More

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter