Summary
在本研究中, 我们描述了一种分析 C924T 基因型的方法。该协议包括三个阶段: DNA 提取、聚合酶链反应扩增 (PCR) 和琼脂糖凝胶限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析。
Abstract
血栓素 A2 受体 (TBXA2R) 基因是具有7个跨膜区域的 g 蛋白耦合超家族的成员。它参与动脉粥样硬化的进展, 缺血, 和心肌梗死。在这里, 我们提出了一个方法的患者基因分型, 以调查转录后的功能 (rs4523) 位于 3 ' 区域的 TBXA2 受体基因。该方法依靠从全血中提取 DNA, 对含有 C924T 突变的 TBXA2 基因部分进行扩增, 并利用限制性消化分析鉴定野生类型和/或突变基因型,特别是琼脂糖凝胶上的限制片段长度多态性 (RFLP)。此外, TBXA2R 基因测序证实了这一结果。该方法具有高效、PCR 和限制性酶分析快速识别 C924T 多态性等优点。通过分析 TBXA2R C924T 多态性的患者基因型, 可以对牙菌斑形成和动脉粥样硬化进展进行预测研究。应用这种方法有可能识别更容易受到动脉粥样硬化过程的受试者, 特别是高风险、阿司匹林治疗组的受试者。
Introduction
Tbxa2r 是 g 蛋白耦合超家族的成员, 具有7个跨膜区域, 在细胞膜或细胞内结构1,2上广泛表达和定位。TBXA2R 信号通路参与了晚期动脉粥样硬化过程3。TBXA2 受体在动脉粥样硬化过程中表达增加, 临床和实验研究表明, TBXA2 受体在缺血和心肌梗死4中的相关作用。C924T 是 TBXA2R 基因的单核苷酸多态性 (SNP), 在健康志愿者中被认为是一种功能多态性, 并与临床疾病有关 5。此外, 我们以前的研究6表明, tbxa2r 基因的 c924t 多态性参与了转录稳定性;具体而言, 突变体 (TT) 型转录与野生类型 (CC) 相比有增加的不稳定性。此外, 一些刺激, 如二磷酸腺苷 (ADP), 肾上腺素和胶原蛋白在不同浓度诱导血小板聚集不太有效的突变型 (TT)。这与减少血栓形成和止血是一致的。因此, TBXA2R 转录的不稳定性和血小板聚集的相关减少可能与 TBXA2R TT 基因型对动脉粥样硬化形成及其并发症的保护作用有关..
在这里, 我们描述了一种方法, 为患者基因分型, 以调查 C924T 多态性 (rs4523) 的转录后作用位于 3 ' 区域的 TBXA2 受体基因。该方法依赖于以下步骤: (1) 从全血中提取 DNA, (2) PCR 扩增含有 C924T 突变的 TBXA2R 基因部分, (3) 利用限制片段长度鉴定野生类型和突变体基因型琼脂糖凝胶的多态性 (RFLP)。RFLP 是一种利用同源 DNA 序列7的变异的技术.该应用程序被用来检测 DNA 多态性, 特别是 Snp, 并发现和关联遗传变异8的生物学相关性.首次使用 RFLP-PCR 对人体进行了多态性分析, 为 ABO 血 9.RFLP-PCR 方法允许通过使用高度特异性的限制性内切酶10评估 dna 消化后不同长度的片段来分析同源 DNA 序列中的基因突变.
在过去几年中, 使用 PCR 技术进行 SNP 分析时采用了以下方法: 短等位基因特异性寡核苷酸11、等位基因特异性 pcr 12、dna 微阵列13引物扩展的杂交,寡核苷酸结扎法14, 直接 dna 测序用于识别位置特异性单核苷酸多态性15, taqman 方法16, 提取矩阵辅助激光去离子-电离时间------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------质谱分析17和基因芯片18。这些技术使用起来并不简单, 可能需要昂贵的设备。相反, PCR-RFLP 方法价格低廉, 使用简单, 使用方便, 具有高效率, 并允许快速识别 C924T 多态性。此外, 我们还通过使用 Sanger 方法15对 tbxa2r 基因进行测序来确认结果。
通过分析 TBXA2R C924T 多态性的患者基因型, 可以对斑块形成和动脉粥样硬化进展进行预测研究。这种方法可以识别更容易受到动脉粥样硬化过程的研究对象, 特别是那些高风险、阿司匹林治疗的患者。
Protocol
该议定书遵循了基耶蒂大学医学研究伦理委员会的准则。
1. 试剂设置
- 准备 Tris-EDTA (TE) 缓冲液 (pH 值 8.0)。在烧杯中加入 200Μl edta 0.5 M 和1毫升的 TRIS-CL 1M, 并在无菌水中加入100毫升。TE 缓冲液最终浓度:10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA。在室温下存储 (RT)。
- 准备10倍库存溶液电泳缓冲液 (TBE) 的1升。溶解108克的 Tris 碱, 55 克硼酸, 40 毫升的 EDTA 0.5 M (pH 8) 到烧杯, 并带到1升的体积与无菌水。存放在 RT。
- 准备凝胶加载染料。溶解0.25 克的溴酚蓝, 0.25 克二甲苯氰醇 FF, 50 克甘油, 1 mM EDTA (pH 8) 在60毫升去离子化或蒸馏水中, 并带到100毫升的体积与无菌水。存放在 4°c (几个月) 或-20°c (年)
-
准备200毫升2% 琼脂糖凝胶。使用新鲜或, 或者, 储存固化在 RT 长达几个星期。
- 在600毫升烧杯中, 在 1x TBE 缓冲液的 200 mL 中溶解4克琼脂糖。使用磁性混合器搅拌约 5分钟, 直到琼脂糖完全悬浮。
- 在沸水或热板上加热2% 琼脂糖溶液 (约 10分钟, 直到琼脂糖完全溶解)。请注意, 加起来胶凝胶的烧杯必须用铝箔覆盖。或者, 在高温下用微波炉加热未覆盖的烧杯约3-5分钟。
- 使用磁性混合器旋转2% 琼脂糖溶液, 检查琼脂糖是否完全溶解。
注: 琼脂糖颗粒在完全溶解前呈半透明颗粒。可能需要对颗粒重新加热几分钟 (约 5-10分钟)。 - 如果使用琼脂糖凝胶的储存部分, 则将用铝箔覆盖的烧杯加热热水浴池 (约 60°c), 直到琼脂糖溶解。在浇注之前, 用巴斯德移液器去除表面上凝固琼脂糖的任何 "痕迹"。
2. DNA 纯化
-
在开始纯化之前, 请执行以下操作:
- 使用人类新鲜的全血样本, 或在水浴中 (在 37°c) 中快速解冻全血冷冻样本 (约 2-3分钟), 然后在使用前将平衡液降至 RT。
- 将新鲜或解冻的血液样本多次倒置。
- 按照供应商关于100μl 洗脱体积的协议开始纯化过程。
-
定量并计算测量260、280和320纳米吸收率的 DNA 纯度。
- 使用无菌水稀释样品并校准分光光度计。
- 应用以下公式, 以计算 DNA 样品浓度 = 50μg/ml x (A 260-a320) x 稀释因子, 以及 dna 的纯度 = (a260-a320)/ (a 280-a320),并具有可接受的比率在1.7 到1.9 之间。
3. DNA 样品的 PCR 扩增
- 在 0.2 mL 微放大管中制备25Μl 的反应混合物, 如表 1所示。
- 按照表 2所示的扩增程序, 使用自动热循环器对纯化后的 dna 样品进行 pcr 扩增。
- 在 PCR 扩增结束时, 将 DNA 样本保持在 4°c, 以停止 PCR 反应。
4. PCR 产品的 RFLP
- 为每个样品制备22.5Μl 的主混合溶液, 以便选定的限制性酶消化 PCR 产品, 如表 3所示。
- 使用移液器和滤嘴将2.5μl 的 PCR 产品转移到每个样品的新 PCR 管中。
- 使用移液器和过滤器头, 在含有每个样品 PCR 产品的管中加入22.5Μl 的消化母组合溶液。
- 在37°c 下将反应混合物 (主混合溶液和 PCR 产物) 培养4小时。
5. PCR-RFLP 样品的凝胶电泳分析
- 在凝胶中加入 0.5μgml (EtBr) 10分钟, 将琼脂糖凝胶凝胶染色 10分钟, EtBr 可在紫外 (UV) 光下进行可视化。
注意: 在处理、储存和处置 EtBr 时使用手套和其他保护装置非常重要, 因为它是一种具有潜在致癌性的诱变剂。 - 将准备好的琼脂糖凝胶倒进凝胶盘中, 并将梳子固定到位, 等待固化。
- 将凝固的琼脂糖凝胶放入凝胶盒 (电泳装置)。
- 在凝胶盒中填充 1x TBE, 直到凝胶被覆盖。
- 使用移液器和过滤器吸头, 将放大消化 DNA 的 6μl (具体而言, 将每个样品的5Μl 和凝胶加载染料的 1Μl) 加载到琼脂糖凝胶的井中。在单独的井中添加 DNA 大小标记, 并与样品平行。
- 在 100 V 处运行凝胶20-30分钟。
- 使用 uv 透射光计, 可视化切割的 DNA 片段或未消化的 PCR 产品, 将片段与 DNA 大小标记进行比较, 并按照制造商的指示通过摄影记录结果。
注意: 在紫外线光源周围使用保护装置 (安全眼镜或面罩)。
Representative Results
该方法的目的是评估与 C924T 多态性有关的血栓 a 2 受体基因型。人类的 TBXA2R 基因位于 19 p13.3, 跨越 15 kbp, 由三个外显子组成, 由两个内含子分离。使用图 1所示的 pcr 引物扩增了 tbxa2r 基因 (539 bp) 的 C924T 多态性, 该引物设计良好, 可扩增特定 dna 区域, 但不是同源或类似的非特异性区域。此外, 还对 PCR 产物进行了 Rfl 分析 (图 1), 并在琼脂糖凝胶上对结果进行了可视化, 以表征特定研究的 snp。
根据 DNA 消化后存在的不同片段长度, 可以区分患者的基因型 C924T 多态性。事实上, 如图 2所示, 主要等位基因 (cc) 的纯合性显示两个波段 (395 和 144 bp), 因为限制性酶精确地切断了 c924t 多态性位点的 TBXA2R 基因部分。小等位基因 (TT) 的纯合性表现为单波段 (539 bp), 因为不会发生限制性酶切割。杂合 (CT) 等位基因显示三个波段 (539, 395 和 144 bp)。如图 2所示, 由 RsaI 消化在 pcr 产品上定义的 C924T 多态性已通过序列分析得到证实。
| 组件 | 体积 (μL) | 最终浓度 |
| 10倍 PCR 缓冲液小网 20 (15 M MgCl2) | 0.25 | 1.5 Mmol/L2 mmol |
| dNTP 组合 (10 mM) | 1 | 200μm |
| 底漆 (forward)(10 Pmop/μm) | 1 | 0.4Μmμl |
| 底漆 (reverse)(10 Pmop/μm) | 1 | 0.4Μmμl |
| Taq聚合酶 (5uucμl) | 0。2 | 1 uxμl |
| 样本 DNA (42 ngμl) | 1 | 42 ng/μL |
| Dnase-无水 | 20.55 | |
| 总 | 25 |
表 1:Pcr 扩增设置.在 0.2 mL PCR 管中设置25Μl 母模混合反应混合物, 以扩增单个 DNA 样本。
| 标准 PCR | |||
| 初始激活步骤 | 5分钟 | 95°c | |
| 三步自行车 | |||
| 变性 | 30秒 | 94°c | |
| 退火 | 60秒 | 55°c | |
| 扩展 | 60秒 | 72°c | |
| 周期数 | 30次 | ||
| 最后延期 | 8分钟 | 72°c | |
表 2:Pcr 扩增程序.设置自动热循环器, 以执行 PCR 并扩增模板 DNA。在4°c 的温度下, 通过冷却来阻止 PCR 反应。
| 组件 | 体积 (μL) (n = 1) | 体积 (μL) (n = 10) * |
| 10倍酶缓冲液 | 2。5 | 27。5 |
| 限制性酶 (5 uucμl) | 0。5 | 5。5 |
| Dnase-无水 | 19。5 | 214。5 |
| 总 | 22。5 | 247。5 |
表 3:PCR 产物的限制性酶消化.制备了一种主混合溶液, 使选定的限制性酶对 PCR 产物进行消化。*: 要为10个样品建立主混合溶液, 再添加 10%, 最后构成11个样品。
图 1: PCR 引物和 RsaI 限制性酶.为扩增含有 C924T 多态性的 539 bp 的 TBXA2R 基因部分而设计的正向和反向引物。RsaI 是为识别 GTAC 位点而选择的限制性酶。˅: RsaI 酶的切割部位。C (/t): C924T 多态性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 电泳模式和 dna 序列分析.(A) c924t 基因型在用特定的 RsaI 酶消化后, 由 RFLP 模式识别。(B) dna 序列分析: 利用显示 c924t 多态性的序列分析, 证实了 RFLP 在 rsai 限制性酶消化后得到的结果。这一数字已从 De Iuliis等人、前列腺素 &Amp; 其他脂类调解员6中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在本研究中, 我们描述了一种方法, 允许患者基因分型, 以调查 C924T 多态性 (rs4523) 的转录后作用位于 TBXA2R 基因的 3 ' 区域。首先, 这种方法依赖于从全血中提取 DNA。特别是, 第一个过程包括纯化人类的总 DNA, 基因组和线粒体, 从全血样本新鲜或冷冻, 用 EDTA (柠檬酸或肝素) 处理。对于全血样本的短期储存, 在2-8°c 下储存长达10天。在储存超过10天的情况下, 请将样品存放在-70°c。自动纯化过程包括4个步骤: 裂解、捆绑、清洗和洗脱。其次, 该方法依赖于含有 C924T 突变的 TBXA2R 基因部分的 PCR 扩增。最后, 利用限制性酶分析 (RFLP) 对琼脂糖凝胶进行了野生类型和突变基因型鉴定。
协议中的关键步骤如下: (i) 在使用储存在 RT 的琼脂糖凝胶的一部分的情况下, 固化琼脂糖可以在沸水浴 (在60°c 下大约 15-20) 或在浇水前的微波炉中 (3-5分钟) 重新溶解。注意: 在瓶子中重新融化琼脂糖时, 松开瓶盖。(ii) 此外, 当再加热琼脂糖时, 蒸发会导致其浓度增加。因此, 通过添加少量的水进行补偿可能是有用的。(三) 利用琼脂糖凝胶对小于 1, 000 bp 的 DNA 片段进行了鉴别, 建议使用 TBE 缓冲液进行最佳分离。(四) 我们更喜欢使用琼脂糖凝胶, 而不是聚丙烯酰胺凝胶, 因为后者的制备比较困难, 设置起来需要更长的时间。(v) 凝胶电泳运行时间的选择取决于放大产物的预期尺寸。根据该协议, 在2% 琼脂糖凝胶中, PCR 片段的大小从 10-500 bp 不等, 因此必须从人体样本中提取10至50纳克的优质模板 DNA, 从而在 100 v 时进行20-30 的电泳。.出于这个原因, 我们更喜欢使用自动 DNA 纯化, 而不是半自动或手动的。(vii) 准备 PCR 扩增的主混合反应和 PCR 产品消化的主混合溶液, 在计算的体积中再增加 10% (以考虑移液过程中的液体损失) 乘以所需体积的样品数量一个 DNA 样本
该方法最常见的缺陷是由于不正确的热循环程序、不正确的扩增主混合制剂或 DNA 模板污染而产生了额外的放大产品。此外, PCR 产品的缺失可能是由于分离的Taq聚合酶或不正确的热循环运行。此外, 意外片段的存在可能是由于 PCR 产品污染或不激活酶的消化不完整、限制性酶体积过少或孵育时间太短。
在过去几年中, 使用 PCR 技术进行 SNP 分析时采用了以下方法: 短等位基因特异性寡核苷酸11、等位基因特异性 pcr 12、dna 微阵列上的引物扩展 13, 寡核苷酸结扎法 14, 直接 DNA 测序鉴定位置特异性单核苷酸多态性 15, taqman 方法16, 提取矩阵辅助激光去光/电离时飞行 (MALDI-TOF) 质谱法 17和 genecp18。这些方法并不理想, 因为它们使用起来并不简单, 也不需要昂贵的设备。相反, 本研究中描述的 PCR-RFLP 方法价格低廉, 使用简单, 使用方便, 效率高, 并允许快速识别 C924T 多态性。对目前方法的一个限制是, 它只能用于少量的 Spp 和工作会话中的几个样本。
对于未来的应用, 该方法可用于预测牙菌斑形成和动脉粥样硬化进展的分析患者基因型的 tbxa2r C924T 多态性。此外, 这种方法可以确定更容易受到动脉粥样硬化过程的研究对象, 特别是使用阿司匹林治疗的高危患者。最后, 该方法可用于研究特定药物 (如抗凝剂和抗惊厥药) 的个性化药物中涉及的其他多态性, 以了解适当的药物剂量和个体药理作用。每个患者在开始治疗前的临床反应, 并避免不良反应。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由意大利大学管理公司60% 的 Ateneo 赠款资助, 由意大利 s. m. 和 e. t. 提供。我们还收到了 Chieti 大学 "G. d ' Annunzio" 医学、口头和生物技术科学系对研究费用的部分捐款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
