Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/57289
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 1, 2, 4, 1,2
1SS Annunziata University Hospital, Unit of Clinical Molecular Biology and Predictive Medicine, University of Chieti, 2Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, University of Chieti, 3Department of Biotechnological and Applied Clinical Sciences, University of L'Aquila, 4CNR - Institute of Molecular Genetics, Section of Chieti

Summary

בהווה לומדים, נתאר מתודולוגיה לניתוח של גנוטיפ C924T. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים: הפקת דנ א, ההגברה ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), וניתוח של ההגבלה שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל.

Abstract

הגן לקולטן (TBXA2R) thromboxane A2 הוא חבר של superfamily G-חלבון בשילוב עם אזורים transmembrane-7. זה מעורב atherogenesis התקדמות, איסכמיה, אוטם שריר הלב. כאן אנו מציגים מתודולוגיה של החולה genotyping לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3' של הגן הקולטן TBXA2. שיטה זו מתבססת על מיצוי DNA מדם שלם, פולימראז הגברה תגובת שרשרת (PCR) של החלק ג'ין TBXA2 שמכילה מוטציה C924T, וזיהוי של פראי סוג ו/או מוטציה אחרים באמצעות ניתוח תקציר ההגבלה, באופן ספציפי הגבלת שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל. בנוסף, התוצאות שאושרו על-ידי קביעת רצף הגן TBXA2R. שיטה זו כוללת מספר יתרונות פוטנציאליים, כגון יעילות גבוהה, זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T על ידי ה-PCR וניתוח אנזים הגבלה. גישה זו מאפשרת ניבוי מחקר על היווצרות הפלאק והתקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח החולה אחרים עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. יישום השיטה הזאת יש את היכולת לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, במקצועות מסוים בקבוצת סיכון גבוה, שטופלו אספירין.

Introduction

TBXA2R הוא חבר של superfamily G-חלבון בשילוב עם אזורים 7-transmembrane, אשר הביע נרחב ו לשפות אחרות או על קרום התא או על מבנים תאיים1,2. מסלול איתות TBXA2R מעורב תהליכי טרשת עורקים מתקדמת3. ביטוי מוגבר של הקולטן TBXA2 הפגינו במהלך ההתקדמות atherogenesis, ומחקרים קליניים, ניסיוני מחקרים הראו תפקידה הרלוונטיים איסכמיה, אוטם שריר הלב4. C924T, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (הסנ פ) של הגן TBXA2R, הוכרו פולימורפיזם פונקציונלי מתנדבים בריאים, נקשר הפרעות קליניות5. יתר על כן, המחקר הקודם שלנו6 הפגינו פולימורפיזם C924T של הגן TBXA2R עוסקת התעתיק יציבות; באופן ספציפי, יש יציבות מוגברת של תמליל סוג מוטציה (TT) ביחס לסוג הפרוע (CC). בנוסף, מספר גירויים כגון אדנוזין diphosphate (ADP), אפינפרין, קולגן בריכוזים שונים המושרה צבירה טסיות פחות יעילים עבור סוג המוטציה (TT). . זה עקבי. עם היווצרות כגון מופחת, hemostasis. לפיכך, את חוסר היציבות של התעתיק. TBXA2R וצמצום המשויך של טסיות מצבור שעשויים להיות מקושרים עם תפקיד המגן גנוטיפ TBXA2R TT נגד atherothrombosis וסיבוכים שלה בחולים בסיכון גבוה שטופלו אספירין6 .

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה genotyping המטופל לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3' של הגן הקולטן TBXA2. שיטה זו מתבססת על השלבים הבאים: (1) DNA החילוץ של דם, (2) PCR הגברה של החלק ג'ין TBXA2R המכיל את המוטציה C924T, וזיהוי (3) פראי סוג ו/או מוטציה אחרים באמצעות הגבלת אורך קטע פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל. RFLP היא טכניקה המנצלת וריאציות של רצפי DNA הומולוגי7. יישום זה נעשה שימוש כדי לאתר את ה-DNA פולימורפיזמים, במיוחד SNPs, וכדי למצוא ולשייך רלוונטיות ביולוגי וריאציות גנטיות8. פולימורפיזם מנותח בפעם הראשונה באמצעות RFLP-PCR בבני אדם היה דם ABO9. השיטה RFLP-PCR מאפשרת הניתוח של מוטציות גנטיות רצפי DNA הומולוגי המעריכה את הנוכחות של שברי באורכים שונים לאחר עיכול הדנ א באמצעות הגבלת ספציפי מאוד endonucleases10.

בהשנים האחרונות, למתודולוגיות הבאים כבר נעזרו הסנ פ ניתוח באמצעות טכניקת ה-PCR: הכלאה של קצר אלל ספציפי oligonucleotides11, אלל ספציפי PCR12, הארכת תחל ב DNA מיקרו-מערכים13, מצדו oligonucleotide assay14, ישיר DNA רצף עבור מיקום ספציפי נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים מזהה15, שיטת Taqman16, מיצוי (Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה17, ו- GeneChips18. טכניקות אלה אינם פשוטים לשימוש, מחייבים ציוד יקר. לעומת זאת, בשיטת PCR-RFLP זולה, פשוטה לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה, ומאפשר זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. בנוסף, אנחנו אישר את התוצאות על-ידי קביעת רצף הגן TBXA2R באמצעות שיטת סנגר ה15.

גישה זו מאפשרת מחקר חזוי של היווצרות הפלאק והתקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח החולה אחרים עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. שיטה זו יכולה לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, בפרט אלו בקרב חולים בסיכון גבוה, שטופלו אספירין.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה במחקר הרפואי של האוניברסיטה של Chieti.

1. מגיב ההתקנה

  1. הכנת המאגר טריס-EDTA (TE) (pH 8.0). להוסיף 200 µL של EDTA 0.5 M ו 1 מ"ל של Cl-טריס 1 מ' בתוך ולהביא 100 מ ל מים סטריליים. הריכוז הסופי של מאגר טה: 10 מ מ טריס-קלרנית, 1 מ"מ EDTA. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
  2. להכין 1 ליטר של 10 x פתרון מניות אלקטרופורזה מאגר (TBE). להמיס 108 גרם של טריס בסיס 55 גר' חומצת בור, 40 מ של EDTA 0.5 M (pH 8) לתוך גביע, ולהביא בנפח 1 ליטר מים סטריליים. החנות RT.
  3. הכינו את הג'ל בטעינת צבע. להמיס 0.25 g של bromophenol כחול, 0.25 g של קסילן cyanol FF, 50 גרם של גליצרול, 1 מ מ EDTA (pH 8) ב 60 מ ל יונים או מים מזוקקים, ולהביא נפח של 100 מ ל מים סטריליים. לאחסן ב 4 ° C (במשך כמה חודשים) או ב-20 ° C (שנים)
  4. להכין 200 מ של 2% agarose ג'ל. שימוש זה טרי או, לחילופין, לאחסן פני השטח למוצק-RT עבור עד מספר שבועות.
    1. להמיס 4 g של agarose ב 200 מ של מאגר x TBE 1 ב גביע 600 מ. מערבבים בעזרת מערבל מגנטי במשך כ- 5 דקות עד agarose מושעית לחלוטין.
    2. מחממים את הפתרון agarose 2% מים רותחים או על פלטה חמה (במשך כ 10 דקות, עד agarose זה התפרקה לחלוטין). שימו לב כי. הספל עם הג'ל agarose חייב להיות מכוסה ברדיד אלומיניום. לחלופין, מחממים את הספל חשפו במיקרוגל בטמפרטורה גבוהה למשך כ 3-5 דקות.
    3. מערבולת הפתרון 2% agarose באמצעות מערבל מגנטי, בודק agarose היא התפרקה לחלוטין.
      הערה: חלקיקי agarose מופיעים גם שקוף לפני התפרקות מוחלטת. יתכן צורך לחמם חלקיקים למשך מספר דקות (כ 5-10 דקות).
    4. אם חלק מאוחסנת של הג'ל agarose משמש, מחממים את הספל, מכוסה ברדיד אלומיניום, באמבט מים חמים (כ 60 מעלות צלזיוס) עד agarose מחוסלת. להסיר עם פיפטה פסטר "עקבות" של agarose הקרושה מפני השטח לפני לשפוך.

2. טיהור DNA

  1. בצע את הפעולות הבאות לפני שמתחילים את הטיהור:
    1. השתמש דגימות דם אדם שלם טרי, או להפשיר דם קפוא דגימות מהר (במשך כ 2-3 דקות) באמבט מים (ב 37 מעלות צלזיוס) החלת של עצבנות קלה, ואז equilibrate כדי RT לפני השימוש.
    2. מערבבים דגימות דם טרי או המופשרים היפוך הצינורות מספר פעמים.
  2. להתחיל את הליך טיהור על ידי ביצוע של הספק פרוטוקולים עבור 100 µL של • תנאי האחסון.
  3. לכמת ולחשב את הטוהר של DNA מדידה את ספיגת-260, 280 ו- 320 ננומטר.
    1. להשתמש במים סטריליים כדי לדלל את הדגימות לכייל את ספקטרופוטומטרים.
    2. להחיל את הנוסחה הבאה, על מנת לחשב את הריכוז של דנ א = 50 µg/mL x (260 − A320) x פקטור דילול והטוהר של ה-DNA = (של260 − A320) / (280 − A320), עם יחס מקובל בין 1.7 1.9.

3. PCR הגברה של דגימות די אן איי

  1. להכין µL 25 תערובת התגובה בשפופרת מיקרו-הגברה 0.2 מ"ל, כפי שמוצג בטבלה 1.
  2. לבצע את ה-PCR-הגברה של דגימות ה-DNA מטוהרים באמצעות הצנטרפוגה תרמי אוטומטי, בעקבות התוכנית הגברה שמוצג בטבלה 2.
  3. בסוף הגברה PCR, לעצור את תגובות PCR על ידי השארת דגימות ה-DNA ב 4 º C.

4. RFLP של מוצרי ה-PCR

  1. מכינים 22.5 µL של מאסטר-מיקס פתרון עבור כל דגימה, כך אנזים הגבלה שנבחר מעכל את המוצרים PCR, כפי שמוצג בטבלה3.
  2. העברת µL 2.5 של מוצר ה-PCR צינור PCR עבור כל דגימה, באמצעות פיפטה וטיפים מסנן.
  3. להוסיף µL 22.5 של עיכול מאסטר-מיקס פתרון הצינורות המכילים המוצר PCR של כל דגימה, באמצעות פיפטה וטיפים מסנן.
  4. דגירה תערובת התגובה (מאסטר-מיקס הפתרון והמוצר PCR) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.

5. ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של ה-PCR-RFLP דגימות

  1. הכתמים ג'ל agarose על-ידי הוספת אתידיום ברומיד (EtBr) ב- 0.5 µg/mL הג'ל במשך 10 דקות EtBr נקשר ל- DNA, אשר ניתן לאבחן מתחת לאור אולטרה סגול (UV).
    שים לב: חשוב להשתמש בכפפות והתקני הגנה אחרים במהלך הטיפול, אחסון, סילוק של EtBr, כי זה מוטגן עם פוטנציאל carcinogenicity.
  2. יוצקים את הג'ל agarose מוכן לתוך מגש ג'ל עם המסרק טוב במקום, והמתן עד זה הינו פני השטח למוצק.
  3. מקם את הג'ל agarose הקרושה לתוך התיבה ג'ל (אלקטרופורזה יחידה).
  4. למלא את התיבה ג'ל עם 1 x TBE עד הג'ל מכוסה.
  5. בעזרת פיפטה והעצות מסנן, טען µL 6 של התקציר מוגבר DNA (במיוחד, טען 5 µL של כל דגימה ו- µL 1 של ג'ל טעינת צבען) לתוך הבארות של הג'ל agarose. הוספת סמן גודל ה-DNA נפרדת היטב במקביל הדגימות.
  6. הפעל את ג'ל למשך 20-30 דקות ב- 100 וולט.
  7. עם UV-transilluminator, דמיינו שברי DNA cleaved או המוצרים PCR מעוכל, השוואת שברים עם דנ א גודל סמן, ויש לרשום את התוצאות על-ידי צילום ההוראות של היצרן.
    התראה: שימוש התקני הגנה (בטיחות משקפיים או מסיכת פנים) סביב מקורות אור UV.

Representative Results

מטרת שיטה זו היא להעריך את גנוטיפ קולטן Thromboxane A2 ביחס פולימורפיזם C924T. הגן האנושי TBXA2R ממוקם על 19p13.3, משתרע על פני 15 kbp, והיא מורכבת exons שלושה המופרדות על-ידי שני אינטרונים. C924T פולימורפיזמים של הגן TBXA2R (של 539 bp) היה מוגבר באמצעות תחל PCR שמוצג באיור 1, אשר היו מהונדסים כדי להגביר את אזור ה-DNA מסוים אבל לא של orthologous או אזור ספציפי paralogous. בנוסף, בוצע ניתוח RFLP באמצעות אנזים ההגבלה RsaI (איור 1) על המוצרים PCR, התוצאות היו דמיינו על ג'ל agarose, על מנת לאפיין את הסנ פ למדה ספציפיים.

בהתבסס על הנוכחות של אורכי קטעים שונים לאחר עיכול של ה-DNA, זה אפשרי להפלות גנוטיפ של החולה על פולימורפיזם C924T. למעשה, בדומה למוצג באיור 2, homozygosity של אלל הגדולות (CC) מציג שתי להקות (395, 144 bp), כי אנזים הגבלה בדיוק חותך את החלק ג'ין TBXA2R ב אתר פולימורפיזם C924T. Homozygosity של אלל מינור (TT) מומחש להקה יחיד (539 bp), מפני חיתוך אנזים הגבלה לא יתרחש. אלל (CT) משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מציג שלוש להקות (539 395, 144 bp). כפי שמוצג באיור2, פולימורפיזם C924T, שהוגדרו על-ידי RsaI עיכול על מוצר ה-PCR, אושרה על ידי ניתוח רצף.

רכיב נפח (µL) ריכוז סופי
10 x PCR מאגר Tween-20 (15 מ' MgCl2) 0.25 1.5 MgCl2 mmol/L...
מיקס dNTP (10 מ מ) 1 מיקרומטר 200
תחל (קדימה) (10 pmol/מיקרומטר) 1 מיקרומטר 0.4/ΜL
תחל (הפוכה) (10 pmol/מיקרומטר) 1 מיקרומטר 0.4/ΜL
. אנזימים (U 5/µL) 0.2 U 1/ΜL
לטעום את ה-DNA (42 ng/µL) 1 42 ng/µL
DNase-חינם-מים 20.55
סה 25

טבלה 1: PCR הגברה ההתקנה. תערובת התגובה מאסטר-מיקס 25 µL להגדיר 0.2 מ ל PCR צינור כדי להגביר את דגימת DNA בודד.

תקן ה-PCR
צעד ראשוני הפעלת 5 דקות 95 ° C
3-צעד רכיבה על אופניים
דנטורציה 30 s 94 ° C
חישול 60 s 55 ° C
סיומת 60 s 72 ° C
מספר מחזורי מחזורים
סיומת הסופי 8 דקות 72 ° C

בטבלה 2: PCR הגברה התוכנית. בצע כיוונון של הצנטרפוגה תרמי אוטומטי כדי לבצע PCR ומגבירים את תבנית ה-DNA. תגובות PCR מופסקים על ידי מצמרר על 4 מעלות צלזיוס.

רכיב נפח (µL) (n = 1) נפח (µL) (n = 10) *
10 x מאגר אנזים 2.5 27.5
אנזים הגבלה (U 5/µL) 0.5 5.5
DNase-חינם-מים 19.5 214.5
סה 22.5 247.5

טבלה 3: העיכול אנזים הגבלה של מוצרי ה-PCR- פתרון מאסטר-מיקס הינו מוכן כך אנזים הגבלה שנבחר מעכל את המוצרים ה-PCR. *: כדי להגדיר את פתרון מאסטר-מיקס 10 דוגמאות, להוסיף 10% יותר, ולבסוף ממציאה דגימות 11.

Figure 1
איור 1: PCR תחל, אנזים הגבלה RsaI. תחל ואחורה תוכנן עבור הגברה של חלק ג'ין TBXA2R 539 bp המכיל את פולימורפיזם C924T. RsaI הוא האנזים הגבלת שנבחרו כדי לזהות את האתרים GTAC. ˅: אתר חיתוך של האנזים RsaI. C(/T): C924T פולימורפיזם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דפוס Electrophoretic ו- DNA רצף ניתוח. (א) C924T גנוטיפ מזוהה על-ידי RFLP התבנית לאחר עיכול עם האנזים RsaI ספציפיים. (B) DNA רצף ניתוח: התוצאות המתקבלות על-ידי RFLP לאחר עיכול עם האנזים הגבלת RsaI אומתו באמצעות ניתוח רצף מציג את פולימורפיזם C924T. איור זה השתנה מ דה Iuliis. et al., פרוסטגלנדינים & אחרים השומנים מגשרים6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

במחקר הנוכחי, תארנו מתודולוגיה המאפשרת genotyping המטופל על מנת לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3' של הגן TBXA2R. ראשית, שיטה זו מסתמכת על מיצוי הדנ א של דם מלא. בפרט, התהליך הראשון מורכב הוא לטיהור סה כ- dna אנושי, גנומית, מיטוכונדריאלי, מדגימות דם טרי או קפוא, מטופלים עם EDTA (ציטראט או הפארין). לאחסון לטווח קצר של דגימות דם, לאחסן ב 2-8 ° C עד 10 ימים. עבור אחסון לאחסן מעל 10 ימים, דגימות ב-70 מעלות צלזיוס. תהליך טיהור אוטומטיות כולל 4 שלבים: lyse לאגד, לשטוף, elute. שנית, השיטה מסתמכת על PCR הגברה של החלק ג'ין TBXA2R המכיל את המוטציה C924T. לבסוף, מתבצע זיהוי פראי סוג ו/או מוטציה גנוטיפ באמצעות ניתוח אנזים הגבלה (RFLP) על agarose ג'ל.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם הבאים: (i) במקרה שבו חלק של הג'ל agarose המאוחסן ב- RT משמש, agarose הקרושה יכול להיות מחדש מומס מעל אמבט מים רותחים (ב 60 מעלות צלזיוס במשך כ- 15-20 דקות) או בתנור מיקרוגל (3-5 דקות) לפני לשפוך. הערה: שחרר את הכובע כאשר מחדש נמס agarose בבקבוק. (ii), יתר על כן, כאשר חימום מחדש agarose, אידוי תגרום להגדלת הריכוז שלו. מסיבה זו, זה יכול להיות שימושי לפצות על-ידי הוספת נפח קטן של מים. (iii) DNA שברי פחות מ-1,000 bp היו מובחנת על ידי ג'ל agarose, מאגר TBE מומלץ על מנת לקבל את ההפרדה האפשרי הטוב ביותר. (iv) אנו מעדיפים להשתמש עם ג'ל agarose ולא ג'ל לזיהוי כי ההכנה של האחרונים קשה יותר, וזה לוקח הרבה זמן כדי להגדיר. (v) הבחירה של. משך בג'ל מסתמך על הגודל הצפוי של מוצרי הגברה. בהתבסס על פרוטוקול זה, זה מספיק לבצע אלקטרופורזה של 20-30 דקות ב- 100 וולט ב- 2% agarose ג'ל, כיוון הגודל של ה-PCR שברים נע בין 100-500 bp. (vi) היא חובה כדי לקבל 10 עד 50 ng של תבנית באיכות טובה שחולצו מן האדם דגימות ה-DNA . מסיבה זו, אנו מעדיפים להשתמש טיהור DNA אוטומטית במקום אחד חצי אוטומטית או ידנית. (vii) הכנת התגובה מאסטר-mix עבור הגברה PCR והפתרון מאסטר-מיקס לעיכול מוצרי ה-PCR, הוספת 10% יותר (לקחת בחשבון אובדן נוזלים במהלך pipetting) עוצמת הקול מחושב מוכפל במספר הדגימות עבור אמצעי האחסון הנדרש עבור אחד. דנ א.

מהמלכודת בתדירות הגבוהה ביותר של השיטה היא הנוכחות של מוצרי הגברה נוספת עקב תוכנית של שגוי הצנטרפוגה תרמי, הכנה מאסטר-מיקס של שגוי הגברה או זיהום תבנית ה-DNA. יתר על כן, העדר של מוצרי ה-PCR יכול להיות בגלל . אנזימים מוחלש או הצנטרפוגה תרמי שגוי של רוץ. בנוסף, הנוכחות של קטעים לא צפוי יכול להיות עקב זיהום מוצר ה-PCR או עיכול לא שלם של אנזים מוחלש, כמות קטנה מדי של אנזים הגבלה נפח, או זמן דגירה קצר מדי.

בשנים האחרונות, למתודולוגיות הבאים כבר נעזרו הסנ פ ניתוח באמצעות טכניקת ה-PCR: הכלאה של קצר אלל ספציפי oligonucleotides11, אלל ספציפי PCR12, הארכת תחל ב- DNA מיקרו-מערכים13 , oligonucleotide מצדו assay14, ישיר רצפי DNA לזיהוי מיקום ספציפי נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים15, שיטת Taqman16, מיצוי Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון... ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF)17, GeneChips18. שיטות אלה אינן אידיאלי מכיוון שהם אינם פשוטים להשתמש ו/או דורשים ציוד יקר. לעומת זאת, בשיטת PCR-RFLP המתוארים במחקר זה היא זולה, פשוטה לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה ומאפשרת זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. מגבלה בשיטה הנוכחית היא כי זה יכול לשמש רק על מספר קטן של SNPs ועל כמה דוגמאות בהפעלה של עבודה.

עבור יישומים עתידיים, שיטה זו יכול לשמש ללימודי חזוי בדבר היווצרות הפלאק התקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח של אחרים החולה עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. יתר על כן, שיטה זו יכולה לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, בפרט, חולים בסיכון גבוה שטופלו עם אספירין. בסופו של דבר, יכול להיות מיושם בשיטה זו ללמוד אחרים פולימורפיזמים מעורב רפואה אישית עבור תרופות ספציפיות (לדוגמה, תרופות נגד קרישת דם, פרכוסים) על מנת להבין את המינון המתאים סמים ואת הפרט תרופתי ו תגובה קלינית עבור כל מטופל לפני תחילת הטיפול, כדי למנוע תופעות לוואי.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

הפרויקט מומן חלקית על ידי 60% Ateneo מעניקה מ Ministero dell' באיטלקית, איטליה בארקדיה, אי. טי גם קיבלנו תרומה חלקית מחקר הוצאות על ידי מחלקת הרפואה, אורלי הביו-טכנולוגיה ומדעים, אוניברסיטת Chieti "ד ' אנונציו G...".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAsymphony SP QIAGEN 937055
Spectrophotometer EPPENDORF 6131-02222
UV-transilluminator UVP 732-110
PCR tubes EPPENDORF H0030121589
PCR thermal cycler EPPENDORF 5331-03721
Pipettors and filter tips EPPENDORF H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus DIATECH PHORESIS 10 RI002-10
Dry block heater TWIN INCUBATOR DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit QIAGEN 931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) DIATECH AND TAKARA T0100 AND R0001DM
Taq polymerase TAKARA R0001DM
dNTP mixture DIATECH  pharmacogenetics NM001 dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers DIATECH  pharmacogenetics \\
Restriction enzyme RsaI New England biolabs R0167L
Restriction enzyme 10x buffer New England biolabs R0167L
Agarose Sigma A9539 DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base Sigma T6066
Boric acid Sigma B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0 Sigma E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate Sigma E3678 prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL) Sigma E8751
Bromophenol blue Sigma B0126
Xylene cyanol FF Sigma X4126
Glycerol Sigma G5516
DNA size marker DIATECH  pharmacogenetics R1002-10 Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved) DIATECH  pharmacogenetics \\

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
  2. Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
  3. Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
  4. Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
  5. Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
  6. De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
  7. Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
  8. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  9. Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
  10. Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
  11. Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
  12. Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
  13. O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
  14. Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
  15. Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
  16. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  17. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
  18. Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).

Tags

גנטיקה ניתוח אנזים הגבלה ביטוי גנים ביולוגיה מולקולרית גיליון 146 יחיד פולימורפיזם נוקלאוטיד Genotyping הצטברות של טסיות דם Atherothrombosis
שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Iuliis, V., Ursi, S., Pennelli,… More

De Iuliis, V., Ursi, S., Pennelli, A., Caruso, M., Capodifoglio, S., Marino, A., Flati, V., Vitullo, G., Toniato, E., Robuffo, I., Martinotti, S. A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene. J. Vis. Exp. (146), e57289, doi:10.3791/57289 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter