Summary
Dans la présente étude, les auteurs décrivent une méthode pour analyser le génotype C924T. Le protocole comprend trois phases : l’extraction d’ADN, amplification en chaîne par polymérase (PCR) et analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) sur gel d’agarose.
Abstract
Le gène du récepteur (TBXA2R) de thromboxane A2 est un membre de la superfamille des protéines G couplées avec les régions sept domaines transmembranaires. Il est impliqué dans la progression de l’athérogenèse, ischémie et infarctus du myocarde. Nous présentons ici une méthodologie de génotypage patient pour étudier le rôle post-transcriptionnelle du polymorphisme C924T (rs4523) situé dans la région 3' du gène du récepteur TBXA2. Cette méthode repose sur l’extraction de l’ADN du sang total, l’amplification de la polymérase chain reaction (PCR) de la portion de gène de TBXA2 contenant la mutation C924T et l’identification du type sauvage ou génotypes mutants à l’aide d’une analyse de restriction digest, plus précisément un RFLP (RFLP) sur agarose gel. En outre, les résultats ont été confirmés en séquençant le gène TBXA2R. Cette méthode présente plusieurs avantages potentiels, tels que le rendement élevé et l’identification rapide du polymorphisme C924T par analyse PCR et les enzymes de restriction. Cette approche permet une étude prévisionnelle pour la formation de plaques et de la progression de l’athérosclérose en analysant les patients génotypes pour le polymorphisme TBXA2R C924T. Application de cette méthode a le potentiel d’identifier les sujets qui sont plus vulnérables aux phénomènes d’athérothrombotiques, dans différentes disciplines dans un groupe à haut risque, traités à l’aspirine.
Introduction
TBXA2R est un membre de la superfamille des protéines G couplées avec des régions sept domaines transmembranaires, qui sont largement exprimés et localisé sur les membranes cellulaires ou sur des structures intracellulaires1,2. La voie de signalisation de TBXA2R est impliquée dans le processus athérosclérotique avancée3. Augmentation de l’expression du récepteur TBXA2 a été démontrée au cours de la progression de l’athérogenèse et cliniques et des études expérimentales ont montré son rôle pertinent à l’ischémie et infarctus du myocarde4. C924T, un polymorphisme de nucléotides simples (SNP) du gène TBXA2R, a été reconnu comme un polymorphisme fonctionnel chez des volontaires sains et a été liée à des troubles cliniques5. De plus, notre étude précédente6 ont démontré que le polymorphisme C924T du gène TBXA2R est impliqué dans la stabilité de la transcription ; plus précisément, il y a une instabilité accrue de la transcription de type mutante (TT) en ce qui concerne le type sauvage (CC). En outre, plusieurs stimuli comme l’adénosine diphosphate (ADP), l’épinéphrine et collagène à différentes concentrations induit une agrégation plaquettaire moins efficace pour le type de mutant (TT). Cela est compatible avec une formation de thrombus réduite et l’hémostase. Ainsi, l’instabilité de la transcription de TBXA2R et la réduction connexe de l’agrégation plaquettaire peuvent être associés à un rôle protecteur pour le génotype TT TBXA2R contre athérothrombose et ses complications chez les patients traités par aspirine à haut risque6 .
Nous décrivons ici une méthodologie pour le génotypage de patient étudier le rôle post-transcriptionnelle du polymorphisme C924T (rs4523) situé dans la région 3' du gène du récepteur TBXA2. Cette méthode repose sur les étapes suivantes : extraction de l’ADN (1) du sang total, amplification PCR (2) de la portion de gène de TBXA2R contenant les C924T mutation et (3) l’identification du type sauvage ou génotypes mutants à l’aide de longueur de fragment de restriction polymorphisme sur gel d’agarose. RFLP est une technique qui exploite les variations de séquences ADN homologues7. Cette application a été utilisée pour détecter des polymorphismes de l’ADN, en particulier les SNP, trouver et associer la pertinence biologique en variations génétiques8. Le polymorphisme analysé pour la première fois à l’aide de la PCR-RFLP chez l’être humain a été l’ABO sang9. La méthode de PCR-RFLP permet l’analyse des mutations génétiques dans des séquences d’ADN homologues en évaluant la présence de fragments de différentes longueurs après la digestion de l’ADN en utilisant des endonucléases de restriction hautement spécifique10.
Dans ces dernières années, les méthodes suivantes ont été utilisées pour l’analyse SNP en utilisant la technique PCR : l’hybridation des oligonucléotides spécifiques allèle courts11, allèle spécifique PCR12, extension d’amorce le DNA microarrays13, ligature de l’oligonucléotide assay14, Direct ADN ordonnançant pour identification polymorphismes mononucléotidiques position spécifique15, Taqman méthode16, extraction () Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation Time-Of-Flight MALDI-TOF) spectrométrie de masse à17et18de la GeneChips. Ces techniques ne sont pas simples à utiliser et peuvent nécessiter des équipements coûteux. À l’inverse, la méthode de PCR-RFLP est peu coûteux, facile à utiliser, pratique, a un rendement élevé et permet une identification rapide du polymorphisme C924T. En outre, nous avons confirmé les résultats en séquençant le gène de la TBXA2R à l’aide de la méthode de Sanger15.
Cette approche permet une étude prévisionnelle de la formation de plaques et de la progression de l’athérosclérose en analysant les patients génotypes pour le polymorphisme TBXA2R C924T. Cette méthode pourrait identifier des sujets plus vulnérables aux phénomènes d’athérothrombotiques, en particulier ceux chez les patients à haut risque, traités à l’aspirine.
Protocol
Le protocole suit les directives de la Medical Research Ethics Committee de l’Université de Chieti.
1. réactif Setup
- Préparer le tampon Tris-EDTA (TE) (pH 8,0). Ajouter 200 µL d’EDTA 0,5 M et 1 mL de Tris-Cl 1 M dans un bécher et amener à 100 mL avec de l’eau stérile. Concentration finale de tampon TE : 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Conserver à température ambiante (RT).
- Préparer 1 L de la solution mère électrophorèse mémoire tampon 10 x (TBE). Dissoudre les 108 g de Tris Base, 55 g d’acide borique et 40 mL d’EDTA 0,5 M (pH 8) dans un bécher et porter au volume de 1 L avec de l’eau stérile. Magasin à température ambiante.
- Préparer le gel colorant de chargement. Dissoudre 0,25 g de bromophénol bleu, 0,25 g de 50 g de glycérol, 1 mM d’EDTA (pH 8) de 60 mL de xylène cyanol FF, déionisée ou distillée et porter à un volume de 100 mL avec de l’eau stérile. Stocker à 4 ° C (pendant quelques mois) ou à-20 ° C (pour les années)
-
Préparez 200 mL de gel d’agarose à 2 %. Utilisation il frais ou, à défaut, stocker solidifié à RT pour jusqu'à plusieurs semaines.
- Dissoudre 4 g d’agarose dans 200 mL de 1 tampon de x TBE dans un bécher de 600 mL. Remuer à l’aide d’un agitateur magnétique pendant environ 5 min jusqu'à ce que l’agarose est totalement suspendu.
- Chauffer la solution d’agarose à 2 % dans l’eau bouillante ou sur une plaque chauffante (pendant environ 10 min, jusqu'à dissolution complète de l’agarose). Notez que le bécher avec le gel d’agarose doit être recouverte de papier d’aluminium. Vous pouvez également chauffer le bécher découvert dans un four à micro-ondes à température élevée pendant environ 3 à 5 min.
- Agiter la solution d’agarose à 2 % à l’aide d’un agitateur magnétique, vérifiant que l’agarose est complètement dissous.
NOTE : Les particules d’agarose figurent sous forme de grains translucides avant une dissolution complète. Il peut être nécessaire aux particules de réchauffage pendant plusieurs minutes (environ 5-10 min). - Si une partie stockée du gel d’agarose est utilisé, faire chauffer le bol, recouvert de papier d’aluminium, dans un bain d’eau chaude (à environ 60 ° C) jusqu'à ce que l’agarose est dissoute. Retirer avec une pipette Pasteur toute « trace » d’agarose solidifiée à la surface avant de couler.
2. Purification d’ADN
-
Effectuez ce qui suit avant de commencer la purification :
- Utiliser des échantillons de sang humain total frais, ou décongeler sang congelé les échantillons rapidement (pour environ 2-3 min) dans un bain d’eau (à 37 ° C) en appliquant une légère agitation et ensuite équilibrer à RT avant utilisation.
- Mélanger les échantillons de sang frais ou dégelés inversant les tubes plusieurs fois.
- Commencer la procédure de purification en suivant les protocoles du fournisseur pour 100 µL de volume d’élution.
-
Mesurer et calculer la pureté de l’ADN, mesurer l’absorbance à 260, 280 et 320 nm.
- Utiliser de l’eau stérile afin de diluer les échantillons et pour calibrer le spectrophotomètre.
- Appliquer la formule suivante, afin de calculer la concentration de l’échantillon d’ADN = 50 µg/mL x (un260 − A320) x facteur de dilution et la pureté de l’ADN = (un260 − A320) / (un280 − A320), avec un rapport acceptable entre 1,7 et 1,9.
3. PCR Amplification d’échantillons d’ADN
- Préparer 25 µL du mélange réactionnel dans un tube de micro-amplification de 0,2 mL, comme indiqué dans le tableau 1.
- Procéder à une amplification par PCR des échantillons ADN purifiés à l’aide d’un thermocycleur automatisé, suivant le programme d’amplification figurant au tableau 2.
- À la fin de l’amplification par PCR, arrêter les réactions de PCR en laissant les échantillons d’ADN à 4 ° C.
4. RFLP des produits PCR
- Préparer les 22,5 µL de solution de mélange réactionnel pour chaque échantillon, afin que l’enzyme de restriction sélectionné digère les produits PCR, comme indiqué dans le tableau 3.
- Transférer 2,5 µL du produit PCR dans un nouveau tube PCR pour chaque échantillon, à l’aide d’une pipette et bouts filtrants.
- Ajouter 22,5 µL de solution de digestion master-mix pour les tubes contenant le produit PCR de chaque échantillon, à l’aide d’une pipette et bouts filtrants.
- Incuber le mélange réactionnel (solution de mélange réactionnel et produit de PCR) à 37 ° C pendant 4 h.
5. gel électrophorèse analyse d’échantillons de PCR-RFLP
- Coloration du gel d’agarose en ajoutant le bromure d’éthidium (EtBr) à 0,5 µg/mL pour le gel pendant 10 min. de bromure d’éthidium se lie à l’ADN, qui peut être visualisée sous lumière ultraviolette (UV).
Attention : Il est important d’utiliser des gants et autres dispositifs de protection au cours de la manutention, le stockage et l’élimination du bromure d’éthidium, parce que c’est un agent mutagène avec potentiel cancérigène. - Verser le gel d’agarose préparés dans un bac de gel avec le peigne bien en place et attendre jusqu'à ce qu’il est solidifié.
- Placer le gel d’agarose solidifiée dans la boîte de gel (appareil d’électrophorèse).
- Remplir la boîte gel avec 1 x TBE jusqu'à ce que le gel est couvert.
- Avec une pipette et bouts filtrants, charger 6 µL du digest amplifié ADN (plus précisément, charge 5 µL de chaque échantillon et 1 µL de gel colorant de chargement) dans les puits du gel d’agarose. Ajouter un marqueur de taille d’ADN dans un autre bien et en parallèle avec les échantillons.
- Exécutez le gel pendant 20 à 30 min à 100 V.
- Avec un transilluminateur UV-, visualiser les fragments d’ADN clivés ou les produits PCR non digérés, comparant les fragments avec le marqueur de taille d’ADN et inscrire les résultats en suivant les instructions du fabricant de la photographie.
Attention : Utiliser des dispositifs de protection (lunettes de sécurité ou un masque facial) autour des sources lumineuses UV.
Representative Results
L’objectif de cette méthode consiste à évaluer le génotype de récepteur du Thromboxane A2 en ce qui concerne le polymorphisme du C924T. Le gène humain de TBXA2R se trouve sur 19p13.3, s’étend sur 15 KPB et se compose de trois exons séparés par deux introns. Les C924T de polymorphismes du gène TBXA2R (de 539 bp) a été amplifié en utilisant les amorces PCR illustrés à la Figure 1, qui ont été bien conçus pour amplifier une région spécifique de l’ADN, mais pas un orthologue ou paralogue région non spécifique. En outre, une analyse RFLP, utilisant une enzyme de restriction RsaI (Figure 1) sur les produits PCR a été réalisée et les résultats sont visualisés sur gel d’agarose, afin de caractériser le SNP spécifique étudié.
Basée sur la présence de longueurs différentes fragment après digestion de l’ADN, il est possible de discriminer le génotype du patient pour le polymorphisme du C924T. En effet, comme indiqué sur la Figure 2, l’homozygotie de l’allèle majeur (CC) affiche deux bandes (bp 395 et 144), parce que l’enzyme de restriction coupe précisément la partie du gène TBXA2R sur le site de polymorphisme C924T. L’homozygotie de l’allèle mineur (TT) est démontrée par une seule bande (539 bp), parce que la coupe de l’enzyme de restriction ne se produit pas. L’allèle (CT) hétérozygote montre trois bandes (539, 395 et 144 bp). Comme illustré à la Figure 2, le polymorphisme C924T, défini par la digestion de la RsaI sur produit de PCR, a été confirmé par analyse de la séquence.
| Composant | Volume (µL) | Concentration finale |
| 10 x tampon PCR Tween-20 (MgCl de 15 M2) | 0.25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| mélange dNTP (10 mM) | 1 | 200 ΜM |
| Apprêt (avant) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Apprêt (inverse) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| TAQ polymérase (5 U/µL) | 0,2 | 1 U/ΜL |
| Échantillon d’ADN (42 ng/µL) | 1 | 42 ng/µL |
| DNase-eau libre | 20.55 | |
| Total | 25 |
Tableau 1 : Installation d’amplification PCR. Un mélange de maître-mélange réactionnel de 25 µL mis en place dans un tube PCR de 0,2 mL à amplifier un seul échantillon d’ADN.
| PCR standard | |||
| Première étape d’activation | 5 min | 95 ° C | |
| 3-étape cyclisme | |||
| Dénaturation | 30 s | 94 ° C | |
| Recuit | 60 s | 55 ° C | |
| Extension | 60 s | 72 ° C | |
| Nombre de cycles | 30 cycles | ||
| Extension finale | 8 min | 72 ° C | |
Tableau 2 : Programme d’amplification PCR. Mettre en place un thermocycleur automatisé afin de réaliser la PCR et amplifier le modèle ADN. Les réactions de PCR sont arrêtées par le froid à 4 ° C.
| Composant | Volume (µL) (n = 1) | Volume (µL) (n = 10) * |
| 10 x tampon enzymatique | 2.5 | 27,5 |
| Enzyme de restriction (5 U/µL) | 0,5 | 5.5 |
| DNase-eau libre | 19,5 | 214,5 |
| Total | 22,5 | 247,5 |
Tableau 3 : Enzyme de Restriction digestion des produits PCR. Préparer une solution de mélange réactionnel afin que l’enzyme de restriction sélectionné digère les produits PCR. * : Pour mettre en place une solution de mélange réactionnel pour 10 échantillons, ajouter 10 % de plus, enfin rattraper le 11 échantillons.
Figure 1 : PCR amorces et enzyme de restriction RsaI. Les amorces et inverses conçus pour amplifier la portion de gène de TBXA2R de 539 bp contenant le polymorphisme du C924T. RsaI est l’enzyme de restriction choisie pour reconnaître les sites GTAC. ˅ : site de découpe de l’enzyme RsaI. C(/T) : C924T polymorphisme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse de séquences de l’ADN et le profil électrophorétique. (A) la C924T génotype est reconnu par le PLFR modèle après digestion par l’enzyme RsaI spécifique. Analyse des séquences ADN (B) : les résultats obtenus par RFLP après digestion avec l’enzyme RsaI ont été confirmés à l’aide d’analyse de la séquence montrant le polymorphisme du C924T. Ce chiffre a été modifié De Iuliis et coll., prostaglandines & autres médiateurs lipidiques6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Dans la présente étude, nous avons décrit une méthodologie qui permet de génotypage patient afin d’enquêter sur le rôle post-transcriptionnelle du polymorphisme C924T (rs4523) situé dans la région 3' du gène TBXA2R. Tout d’abord, cette méthode repose sur l’extraction de l’ADN du sang total. En particulier, ce premier processus consistant en une purification de l’ADN humain total, génomique et mitochondriale, provenant d’échantillons de sang entier frais ou congelés, traités avec de l’EDTA (citrate ou héparine). Pour le stockage à court terme d’échantillons de sang total, conserver entre 2 et 8 ° C pendant 10 jours. Pour le stockage de plus de 10 jours, conserver les échantillons à-70 ° C. Le processus de purification automatique comprend 4 étapes : lyse, lier, laver et éluer. Deuxièmement, la méthode repose sur l’amplification par PCR de la portion de gène de TBXA2R contenant la mutation C924T. Enfin, l’identification de la souche sauvage et/ou génotype mutant en utilisant une analyse de l’enzyme de restriction (RFLP) sur gel d’agarose est effectuée.
Des étapes cruciales dans le protocole sont les suivants : (i) dans le cas où une partie du gel d’agarose stockée à RT est utilisé, l’agarose solidifié peut être re-dissous dans un bain d’eau bouillante (à 60 ° C pendant environ 15-20 min) ou dans un four à micro-ondes (3-5 min) avant de couler. Remarque : desserrer le bouchon quand la refusion d’agarose dans une bouteille. (ii), par ailleurs, lorsque le réchauffage d’agarose, évaporation provoque une augmentation de sa concentration. Pour cette raison, il pourrait être utile compenser en ajoutant un petit volume d’eau. (iii) fragments d’ADN de moins de 1 000 bp ont été différenciées en gel d’agarose et tampon TBE est recommandé afin d’obtenir la meilleure séparation possible. (iv) nous préférons utiliser un gel d’agarose, plutôt qu’un gel de polyacrylamide, parce que la préparation de ce dernier est plus difficile, et il faut beaucoup plus de temps à mettre en place. (v) le choix de la durée de l’électrophorèse de gel dépend de la taille attendue des produits d’amplification. Basé sur ce protocole, il suffit d’effectuer une électrophorèse pendant 20-30 min à 100 V en gel d’agarose à 2 %, étant donné que la taille de la PCR des fragments varie de 100 à 500 BP. (vi) il est obligatoire pour l’obtention de 10 à 50 ng d’un modèle de bonne qualité ADN extrait d’échantillons humains . Pour cette raison, nous préférons utiliser une purification d’ADN automatisée et non semi-automatique ou manuelle. (vii) Prepare la réaction du mélange réactionnel pour l’amplification PCR et la solution de mélange réactionnel pour la digestion de produits PCR, ajouter 10 % de plus (pour tenir compte des pertes de liquide pendant le pipetage) au volume calculé multiplié par le nombre d’échantillons pour le volume nécessaire pour un échantillon d’ADN.
L’écueil le plus fréquent de la méthode est la présence de produits d’amplification supplémentaire en raison d’un programme incorrect thermocycleur, une préparation du mélange réactionnel amplification incorrect ou une contamination de modèle de l’ADN. En outre, l’absence de produits PCR peut-être dû à inactivé Taq polymérase ou un thermocycleur incorrect exécuté. En outre, la présence de fragments inattendus peut être en raison de la contamination des produits PCR ou à une digestion incomplète d’une enzyme inactivée, trop peu de volume de l’enzyme de restriction ou un temps d’incubation trop court.
Dans les dernières années, les méthodes suivantes ont été utilisées pour l’analyse SNP en utilisant la technique PCR : l’hybridation des oligonucléotides spécifiques allèle courts11, allèle spécifique PCR12, extension d’amorce sur puces à ADN13 , ligature de l’oligonucléotide assay14, diriger le séquençage de l’ADN pour l’identification des polymorphismes mononucléotidiques position spécifique-15Taqman méthode16, extraction Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation De spectrométrie de masse à temps de vol (MALDI-TOF)17et18de la GeneChips. Ces méthodes ne sont pas idéales, car elles ne sont pas simples à utiliser ou à exiger des équipements coûteux. À l’inverse, la méthode de PCR-RFLP décrite dans la présente étude est peu coûteux, facile à utiliser, pratique, a un rendement élevé et permet une identification rapide du polymorphisme C924T. Une limitation à la méthode actuelle est qu’il peut uniquement être utilisé pour un petit nombre de SNP et quelques échantillons dans une session de travail.
Pour de futures applications, cette méthode peut être utilisée pour des études prédictives concernant la formation de plaques et de la progression de l’athérosclérose en analysant les patients génotypes pour le polymorphisme TBXA2R C924T. En outre, cette méthode pourrait identifier des sujets plus vulnérables aux phénomènes d’athérothrombotiques, en particulier, les patients à haut risque traitement avec l’aspirine. Enfin, cette méthode pourrait être appliquée à l’étude des autres polymorphismes impliqués en médecine personnalisée pour des médicaments spécifiques (par exemple, des anticoagulants et des anticonvulsivants) afin de comprendre le dosage approprié des médicaments et l’individu pharmacologique et réponse clinique de chaque patient avant de commencer un traitement et d’éviter les effets indésirables.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé en partie par 60 % Ateneo accorde de Ministero dell'Università, Italie, S.M., et E.T. Nous avons également reçu des contributions partielles à la recherche des charges par le Department of Medical, Oral et biotechnologiques, Université de Chieti « G. d’Annunzio ».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
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