Summary
In dit werk, wordt een protocol voor signaal verhoging van de nanosonde gebaseerde biosensing gepresenteerd. Het protocol is gebaseerd op de vermindering van chloroauric zuur op het oppervlak van de bestaande nanoprobes die bestaan uit goud, zilver, siliciumdioxide of ijzer-oxide nanodeeltjes.
Abstract
Het gebruik van nanoprobes zoals goud, zilver, siliciumdioxide of ijzer-oxide nanodeeltjes als detectie reagentia in bioanalytical testen kunnen hoge gevoeligheid en handige colorimetrische uitlezing. Hoge dichtheden van nanodeeltjes zijn echter meestal nodig voor de detectie. De protocollen beschikbaar synthese gebaseerde verbetering zijn ofwel beperkt tot goud en zilver-nanodeeltjes of vertrouwen op enzymatische controle en optimalisatie. Hier presenteren we een protocol ter verbetering van de colorimetrische uitlezing van goud, zilver, silica en ijzeroxide nanoprobes. Er werd opgemerkt dat de colorimetrische signaal kan worden verbeterd door tot een 10000-fold factor. De basis voor dergelijke signaal versterking strategieën is de chemische reductie van Au3 + op Au0. Er zijn verschillende chemische reacties waarmee de vermindering van Au3 + op Au0. In het protocol, goede buffers en H2O2 worden gebruikt en het is mogelijk om de gunst van de afzetting van Au0 op het oppervlak van de bestaande nanoprobes, in het nadeel van de vorming van nieuwe gouden nanodeeltjes. Het protocol bestaat uit de incubatie van de microarray met een oplossing die bestaat uit chloroauric zuur en H2O2 in 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zure pH 6 buffer na de bepaling van de nanosonde gebaseerde detectie. De verhoging van de oplossing kan worden toegepast op papier en op basis van glas sensoren. Bovendien, het kan worden gebruikt in de handel verkrijgbare immunoassay, zoals blijkt uit de toepassing van de methode op een commerciële allergeen microarray. De signaal-ontwikkeling vergt minder dan 5 min van incubatie met de verhoging van de oplossing en de uitlezing kan worden geëvalueerd door het blote oog of low-end afbeelding overname apparaten zoals een tafelblad scanner of een digitale camera.
Introduction
Het gebruik van nanomaterialen zoals gouden nanodeeltjes (AuNPs) of ijzeroxide nanodeeltjes (IONPs) heeft de toepassingen toegestaan in biosensing met verbeterde gevoeligheid en veelzijdigheid. 1 de overvloed van methodes ontwikkeld voor de decoratie van het oppervlak van nanodeeltjes met verschillende liganden, te profiteren van hun hoge oppervlakte volumeverhouding, heeft het ontwerp van de sensoren met verbeterde gevoeligheid. 2 niettemin een biosensing hulpmiddel is afhankelijk van het aantal nanoprobes vereist om een opspoorbaar signaal. Bijvoorbeeld, in het geval van 40 nm AuNPs, te verwerven van een signaal via UV-vis-spectroscopie, ongeveer 90 × 106 nanoprobes is noodzakelijk effectief het detecteren van de doelstelling van belang. 3 deze nanosonde dichtheid beperking kan worden omzeild door het gebruik van signaal versterking. Dergelijke strategieën4 kan worden gebaseerd op interparticle aggregatie of agglomeratie, waar de dichtheid van de eerste nanoprobes wordt verhoogd door de accumulatie van een tweede reeks van nanoprobes bij de eerste. 5 toename van nanodeeltjes op een bepaalde locatie op een sensoroppervlak kan visual of UV-vis signaal overname. De gevoeligheid van de test worden echter inherent gekoppeld aan de gerichte capaciteit van de tweede reeks van nanodeeltjes op de weg naar de eerste reeks van nanoprobes. Andere strategieën, is afhankelijk van de kleuring van ofwel gouden en zilveren nanoprobes. 6 , 7 de kleuring wordt bereikt door de vermindering van de zilver-ionen op het oppervlak van de nanodeeltjes, waardoor een visuele of UV-vis-detectie. 8 deze methoden verbeteren het signaal van de bestaande gouden of zilveren nanoprobes door potentiating van de plasmon oppervlakte resonantie signaal, niet afhankelijk is van secundaire targeting evenementen zoals interparticle agglomeratie methoden. Zilveren kleuring methoden zijn echter alleen met gebruik van goud- of zilverkleurig nanoprobes gemeld. 8 , 9
In 2005, Zayats et al. 10 gemeld de vermindering van de Au ionen op het oppervlak van goud nanoprobes te vergroten het oppervlak plasmon resonantie signaal. In dit enzym-afhankelijke werk, werd waterstofperoxide geproduceerd door glucose oxidase katalyse en samen met cetyltrimethylammonium chloride, de vermindering van chloroauric zuur toestond.
Meer recentelijk Wang et al.. een methode van de verbetering waar een gouden laag wordt geproduceerd op het oppervlak van de bestaande nanoprobes gemeld. 11 deze uitgebreide nanoprobes weergegeven peroxidase-achtige katalytische activiteit tegen het substraat 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) waardoor de visualisatie van een helder blauwe kleur met blote oog.
Stevens et al. de ontwikkeling van een Enterprise ELISA gebaseerde assay gemeld. 12 na de detectie van een prostaat-specifiek antigen (PSA) door middel van een traditionele ELISA-strategie, werd een secundair antilichaam aangeduid met katalase geïncubeerd met de sensor waarna de sensor werd ondergedompeld in een oplossing met waterstofperoxide en chloroauric zuur. De aanwezigheid van het secundaire katalase gemodificeerde antilichaam (positieve uitslag) zou de bevordering van de consumptie van waterstofperoxide, chloroauric zuur vermindering vertragen en opbrengst van semi-sferische monodispersed AuNPs met een rode kleur. Het ontbreken van het katalase-bewerkt antilichaam (negatief) mag de concentratie waterstof-peroxide te blijven intact, dus het bevorderen van de vermindering van de snelle chloroauric en AuNPs opbrengst met onduidelijke morphologies die verantwoordelijk zijn voor een blauw/paarse kleur . De concentratie van waterstofperoxide, bepaald door de activiteit van katalase, bleek te worden gecorreleerd aan de concentratie van de analyt van belang. De behoefte aan een katalase gemodificeerde secundair antilichaam en de controle van de voorwaarden voor de katalytische activiteit zijn twee factoren die een belemmering vormen voor de universaliteit van deze methode. Bovendien kan de vorming van gouden clusters, onafhankelijk van de bestaande AuNPs, achtergrond lawaai kennismaken met de strategie van de versterking.
De bovengenoemde technieken, als ook verscheidene anderen13,14,15, hebben het mogelijk gemaakt voor nanosonde gebaseerde biosensoren om detectiegrenzen op gelijke voet met de traditionele technieken.
Hier, een nieuwe gouden verbetering methode is aangetoond, waar het signaal van een bestaande nanosonde wordt versterkt door versterkend of invoering van een oppervlakte plasmon resonantie signaal. Na de detectie wordt uitgevoerd met het gebruik van goud, zilver, siliciumdioxide of ijzeroxide nanodeeltjes, de sensor is toegestaan om te broeden met een oplossing van een mengsel van waterstof peroxide en chloroauric zuur in 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) pH 6 buffer. De concentraties van de componenten in de verhoging van de oplossing werden geoptimaliseerd om de gunst van de afzetting van Au0 op het oppervlak van de bestaande nanoprobes. Alle bestudeerde nanosonde typen, dwz. AuNPs, zilver-nanodeeltjes (AgNPs), siliciumdioxide nanodeeltjes (SiNPs) en IONPs, de vorming van een onoverzienbare laag opgeleverd of vergrote de verstrooiing van licht, wat in een detecteerbare of verhoogde zichtbaar signaal resulteerde. Een verhoging van het signaal met een factor van de 100-fold versterking werd bereikt voor nanoprobes in het papier en glas gebaseerde microarrays en het proces duurt minder dan 5 min te verwerven van een signaal. De overname van het signaal kan worden gedaan door het blote oog, UV-vis-spectroscopie of imaging low-end hulpmiddelen zoals een digitale camera of een scanner tafelblad. Bovendien werd aangetoond dat dit protocol verbetering gemakkelijk kan worden toegepast in een diagnostische test van verkrijgbare anti zonder specifieke optimalisatie.
Protocol
Menselijk serummonsters werden verkregen in overeenstemming met de wettelijke en ethische voorschriften van het land van herkomst, dwz. met de goedkeuring van een ethische Commissie (of soortgelijke) en met schriftelijke toestemming van de donor.
1. verbetering oplossing voorbereiding:
- Bereiden van een buffer van 10 mM MES pH 6 door schorsing van MES natriumzout in gedeïoniseerd water. Breng de pH op 6 met behulp van een 4 M NaOH-oplossing.
- Bereid een 5 mM HAuCl4 oplossing in 10 mM MES pH 6 buffer (oplossing 1).
- Bereid een 1.027 M H2O2 oplossing in 10 mM MES pH 6 buffer (oplossing 2).
Opmerking: De hoeveelheid oplossing 1 én oplossing 2 afhankelijk van het aantal en de grootte van microarrays worden versterkt. Bijvoorbeeld, vereist een microarray van 10 x 10 mm 100 μl totaalvolume (oplossing 1 + oplossing 2) om ervoor te zorgen dat het microarray-gebied is in contact met de verhoging van de oplossing. Na verdunning, moeten de H2O2 binnen ongeveer 30-45 dagen worden gebruikt.
2. nanodeeltjes voorbereiding:
- Bereiden van 40 nm AuNPs zoals beschreven door Bastús et al. 1 mL van waterige 25 mM HAuCl4 voorloper 16 kort, injecteren in een kokend oplossing van 2.2 mM Natriumcitraat (149 mL). Wacht totdat een rode-wijn-kleur wordt waargenomen. Gebruik deze oplossing van nanodeeltjes als zaden voor zaad-groei stappen.
- Injecteren bij 90 ° C, 1 mL van 60 mM Natriumcitraat gevolgd door 1 mL van 25 mM HAuCl4 in het zaad met oplossing. Na 30 min is de reactie voltooid. Herhaal de zaad-groei stap vijf keer tot 40 nm nanodeeltjes worden verkregen, zoals beschreven door Bastús et al. 16
- Meet de extinctie van de UV-vis van de eindoplossing van nanodeeltjes voor het bepalen van de grootte van de nanodeeltjes. 17 ook transmission electron microfoto (TEM) kunnen worden verkregen en gebruikt voor het bepalen van de grootte van de nanodeeltjes.
- Bereiden van 90 nm AgNPs zoals beschreven door Rivero et al. Dimethylaminoborane (DMAB) 18 kort, toevoegen aan een krachtig stirred oplossing van poly (acrylzuur, natriumzout) (PAA) en AgNO3. Het uiteindelijke volume van de oplossing is 50 mL en de uiteindelijke concentratie van DMAB, PAA en AgNO3 zijn 1,6 mM, 10 mM en 3,33 mM, respectievelijk.
Opmerking: 100 nm IONPs gewijzigd met carboxylgroepen en 50 nm SiNPs gewijzigd met carboxylgroepen werden aangekocht. - Functionalize de AuNPs met antilichamen na het protocol beschreven door Puertas et al. 19 kort, 1 mg COOH-PEG-SH (5000 g·mol−1) toevoegen aan een oplossing van 1.2x10-9 M AuNPs (10 optische dichtheid, OD). Breng de pH op 12 met een oplossing van 4 M NaOH.
- Laat de oplossing na een nacht, bebroeden bij kamertemperatuur (~ 22 ° C), onder milde roeren voorwaarden.
- Verwijder de overmaat van PEG door centrifugeren van de oplossing bij 13800 x g gedurende 15 minuten.
- Resuspendeer de pellet met 500 μL van gedeïoniseerd water.
- Incubeer de PEG gemodificeerde AuNPs met 5 μmol van N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide-hydrochloride (EDC) en 7,5 μmol N-hydroxysulfosuccinimide natrium zout (sulfo-NHS) in 10 mM MES pH 6 buffer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder de overmaat van EDC en sulfo-NHS door centrifugeren van de oplossing bij 13800 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de pellet in 500 µL van 10 mM MES pH 6 buffer en voeg 100 g·mL-1 van antilichaam. Laat de oplossing Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Verwijder de overmaat van antilichaam door centrifugeren van de oplossing bij 13800 x g gedurende 10 minuten tweemaal en resuspendeer de pellet in 500 μL van 10 mM natriumfosfaat pH 7.5, 0,3 M NaCl buffer. Laat de oplossing Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder het aspecifieke afhankelijke antilichaam door centrifugeren van de oplossing bij 13800 x g gedurende 10 minuten tweemaal en resuspendeer de pellet in 500 μL van 1% bovien serumalbumine (BSA) in 10 mM MES pH 6 buffer. Incubeer de monsters bij 4 ° C's nachts.
- De overdaad aan BSA wassen door centrifugeren van de oplossing bij 13800 x g gedurende 10 minuten twee keer, en resuspending van de pellet in 500 μL van 10 mM MES pH 6 buffer.
- Volg de stappen 2.5.1 via 2.5.9 voor de wijziging van 5 M AgNPs, IONPS 0,5 mg en 0,5 mg van SiNPs met antilichaam, de hoeveelheden EDC en sulfo-NHS dienovereenkomstig aan te passen.
3. verticale flow papier gebaseerde testen:
- Bereiden de microarrays door nederlegging van een kleurovergang concentratie van eiwitten G op nitrocellulose papier membraan met een robotachtige printer. Laat na het afdrukken de microarrays droge overnachting bij kamertemperatuur (~ 22 ° C).
- De verticale flow bepaling met het membraan die is ingesloten in een filterhouder uitvoeren. Stromen van een 8 M oplossing van IgG-gewijzigd AuNPs met behulp van een ultra-spuitpomp met een snelheid van 1 mL·min−1. Herhaal deze stap met een oplossing van 17 M IgG-gewijzigd AgNPs, 0,1 mg·mL−1 IgG gemodificeerde SiNPs en 0,1 mg·mL−1 IgG gemodificeerde IONPs.
- Laat de microarrays drogen bij kamertemperatuur (~ 22 ° C) gedurende 30 minuten en scannen ze in een flatbed-scanner op een resolutie van 4800 dpi. De afbeeldingen opslaan als TIFF-bestanden met 24-bits kleuren.
4. verwijst naar commerciële glas gebaseerde testen:
- Twee glas-dia's gedurende 120 minuten voor detectie van allergeen componenten met 4 verschillende menselijk serummonsters bij kamertemperatuur incuberen.
- Spoel de microarrays met gedeïoniseerd water.
- Incubate één dia met een TL-geconjugeerde anti-menselijke IgE antilichaam bij kamertemperatuur (~ 22 ° C) voor 30 min. Incubate de tweede dia met anti-menselijke IgE antilichaam gemodificeerde AuNPs gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de microarrays met gedeïoniseerd water.
- Meet de intensiteit van de fluorescentie van de microarray die was geïncubeerd met het fluorescerende anti-menselijke IgE antilichaam met een laser scannen apparatuur. Digitaliseren de microarray die was geïncubeerd met de anti-menselijke IgE antilichaam gemodificeerde AuNPs met een tafelblad scanner voor colorimetrische signaal overname.
- Incubeer de microarray met de verhoging van de oplossing op kamertemperatuur (~ 22° C) voor 5 min na digitalisering.
- Spoel de sensor met gedeïoniseerd water en laat ze drogen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (~ 22 ° C).
- De microarray digitaliseren met een tafelblad scanner op een resolutie van 4800 dpi voor colorimetrische signaal overname. De afbeeldingen opslaan als 16-bits grayscale TIFF-bestanden.
5. Microarray incubatie met verhoging van de oplossing:
- Vooraf Meng de dezelfde hoeveelheid oplossing 1 en oplossing 2 of meng ze direct op het oppervlak van de sensor, en ervoor zorgen dat het gebied van de rente op de microarray met het mengsel van de oplossing bedekt is.
- Laat de sensor Incubeer bij kamertemperatuur met de verhoging van de oplossing voor up naar 5 min. langer incubatie tijd kan opleveren verbeterde gevoeligheden, alsmede hogere ruis/signaalverhouding, vooral voor papier gebaseerde microarrays.
- Wassen van de microarray door dompelen het in gedeïoniseerd water eenmaal voor 5 s. laat het drogen bij kamertemperatuur.
Opmerking: De tijd van de drogen stap hangt af van het materiaal van de microarray. Voor een papieren microarray vereist het drogen stap ongeveer 30 min. Voor een microarray op basis van glas vereist het drogen stap ongeveer 5-10 min.
6. imaging analyse:
- Het analyseren van de intensiteit van de fluorescentie met softwarehulpprogramma. Alle resultaten die gelijk of hoger zijn dan 0.3 Isac normaliseren-eenheden (ISU), volgens de aanwijzingen van gebruik (DfU) van de fabrikant van de sensor in overweging.
- Analyseer de colorimetrische intensiteiten met behulp van een softwaretool. Omkeren van de afbeeldingsbestanden, de intensiteit van elke vlek meten en berekenen van de gemiddelde pixel-intensiteit. De waarden van de drievoudige spots gebruiken voor het berekenen van de waarde van de laatste signaal als een gemiddelde van de drie gemiddelde plek pixel intensiteiten.
Representative Results
Na een test wordt uitgevoerd, met behulp van nanoprobes als gemachtigden van de opsporing, kan de sensor detectie gebied worden gevuld met nanoprobes (Figuur 1een). Als het aantal nanoprobes lager dan de limiet voor een visuele opsporing is, de detectie van de analyt zal worden, in eerste instantie als negatief beschouwd. Met behulp van het protocol gepresenteerd hier (Figuur 1b), is het signaal van de nanoprobes versterkt door de invoering van een onoverzienbare laag van Au (Figuur 1c).
Een papieren immunoassay ontworpen voor de detectie van eiwit G werd uitgevoerd over het demonstreren van de effectiviteit van het protocol van de verbetering (Figuur 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs en IONPs werden bewerkt met IgG antilichamen en gebruikt en detectie agenten. Papier microarrays werden voorbereid over het hebben van een verloop van een aantal eiwitten G moleculen per plek.
Nadat de bepaling was uitgevoerd, werd naar voren gebracht die IgG gemodificeerde AuNPs (IgG-AuNPs) waren in staat om op te sporen zo laag als 2 × 105 moleculen per plek (Figuur 2een), IgG gemodificeerde AgNPs (IgG-AgNPs) waren in staat om op te sporen zo laag als 2 × 10-4 moleculen per plek (Figuur 2c), IgG bewerkt IONPs (IgG-IONPs) waren in staat om op te sporen zo laag als 2 × 107 moleculen per (Figuur 2e spot) en IgG gewijzigd SiNPs (IgG-SiNPs) waren niet in staat om een visueel signaal ( Figuur 2g).
Door de microarrays met de verhoging van de oplossing aan het broeden, was het mogelijk om het verhogen van het signaal door 100-fold over alle soorten van nanodeeltjes gebruikt. In het geval van SiNPs, de verhoging van de oplossing het mogelijk gemaakt om te observeren van een signaal waar geen visueel signaal is geconstateerd zonder de verhoging van de oplossing (Figuur 2b, 2d, 2f en 2 h).
De mogelijkheid van toepassing van de methode op een bestaande commerciële immunoassay werd geëvalueerd. De verhoging werd uitgevoerd op een allergeen glas gebaseerde component microarray immunoassay. Een set van 4 gevalideerde en gekenmerkt serum monsters van allergische patiënten werden geëvalueerd met de microarray (monsters werden aangemerkt als a, b, c en d). De standaard fluorimetrische detectie van deze bepaling werd vergeleken met de kleuring met anti-IgE label AuNPs gevolgd door de verhoging van de signaal (Figuur 3). Voorafgaand aan de uitbreiding, werden geen vlekken ontdekt op de microarrays waar de opsporing werd uitgevoerd met anti-IgE AuNPs label. Na verhoging, verschillende plekken waren door het blote oog zichtbaar en hun intensiteit werd geregistreerd door afbeelding digitalisering (Figuur 3). Met de fluorescentie-detectie, allerlei plekken werden aangetroffen (Figuur 3).
Figuur 1 . Illustratie van de stappen een microspot ondergaat van detectie van de analyt op verbeterde signaal. (een) twee antilichaam gemodificeerde nanoprobes na de detectie van een analyt geïmmobiliseerd op een microspot, (b) incubatie van de microarray met het enhancement-protocol en latere zaad-groei van de antilichaam-gewijzigd nanoprobes en () c) microspot waar de grootte van de nanoprobes verhoogd na 5 min met de verhoging van de oplossing aan het broeden. Dit cijfer is dapted van Dias et al.geweest. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Gedigitaliseerde afbeelding van microarrays voor de detectie van eiwit G. Aan de linkerkant van elke microarray zijn de waargenomen microspots voorafgaand aan de verbetering van de opsporing uitgevoerd met (een) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs en (g) IgG-SiNPs. Aan de rechterkant van elke microarray zijn de microspots na verhoging van de (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs en (h) IgG-SiNPs. Elke concentratie van eiwitten G werd gestort op de microarray in drievoud. Een berekening van het aantal eiwitten die g werd gedaan op basis van de concentratie van het eiwit in elke microspot gedrukt. Dit percentage is aangepast van Dias et al.zijn. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Correlatie tussen fluorescerende intensiteit en colorimetrische intensiteit verkregen voor de testen die zijn uitgevoerd met de diagnostische bepaling van commerciële anti. Intensiteit van de fluorescentie (MFI) betekenen en betekenen colorimetrische intensiteit (MCI) gemeten voor de detectie van allergenen in de voorbeelden a, b, c en d. inzetstukken zijn de 10 getransformeerd logboekgegevens tijdens de pauzes waar een lineaire correlatie tussen beide methoden werd waargenomen. De intensiteit van de microspots waargenomen voor de detectie op basis van het antilichaam fluorophore gemodificeerde (Fluorophore-Ab) is de fluorescentie emissie. De helderheid van de waargenomen voor de detectie op basis van de bepaling van de Ab-AuNPs microspots werd verkregen na digitalisering de microarray en omkeren van de afbeelding met beeldbewerkingssoftware. Microarrays zijn geconstrueerd zijn dat het hebben van verticale triplicates met positieve controles voor fluorescentie detectie op de bodem van de extreem-rechtse. De andere drie hoeken worden gebruikt voor de evaluatie van de software. Beelden werden geanalyseerd in 16-bits grijstinten. Dit percentage is aangepast van Dias et al.zijn. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| R2 voorafgaande toebehoren | R2 na verbetering | |
| IgG-AuNPs | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| IgG-AgNPs | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| IgG-IONPs | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| IgG-SiNPs | - | 8.50E-01 |
Tabel 1. R2 waarden voor de detectie van eiwit G, vooraf en na verhoging, met behulp van verschillende sets van nanodeeltjes. De R-2 waarden werden verkregen na de intensiteit van de vlekken te correleren met de concentratie van de analyt gemeten.
Discussion
Op dit moment signaal versterking technieken voor het testen met nanosonde gebaseerde detectie zijn beide enzym gebaseerde12, dat vereist een tweede reeks van nanodeeltjes tot doel de detectie nanoprobes21 of, in het geval van kleuring technieken, zijn beperkt tot het gebruik van AuNPs of AgNPs als detectie sondes. 22 hier is een eenvoudige, snelle en enzym-vrije methode beschreven voor signaal verhoging van nanosonde detectie gebaseerde tests. Met deze methode, was het mogelijk om het verbeteren van de colorimetrische signaal geboden door 4 soorten nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs en SiNPs.
De factor van de waargenomen versterking voor elke set van nanoprobes was van 100-fold, met uitzondering van de SiNPs waar kwantificering van de verhoging van de factor niet mogelijk wegens gebrek aan de verhoging van de pre-signalen was. Deze verhoging factor suggereert dat de efficiëntie van het protocol vergelijkbaar in alle soorten nanoprobes is. Bovendien, wanneer het protocol verbetering werd uitgevoerd op een papieren drager waar een verdunningsreeks van een voorraad AuNPs schorsing werd gedrukt, werd naar voren gebracht een 10000-fold versterking factor. Vorige verhoging, de zichtbare plekken met het laagste aantal AuNPs waren waar ongeveer 10000 nanodeeltjes werden gedrukt, na verbetering de plekken die minder dan 10 nanodeeltjes herbergen werd zichtbaar. 20
De voorwaarden die zijn vastgesteld voor het protocol van de verhoging van de hier aangeboden hebben laten profiteren van de vermindering van Au3 + Au,0 voor het signaal verbeteren, terwijl het handhaven van het achtergrond lawaai tot een minimum te beperken. De verbetering kan worden uitgevoerd direct nadat de test wordt uitgevoerd, alsook op microarrays die zijn opgeslagen voor tot enkele maanden na de test werd uitgevoerd. De verhoging van de oplossing bestaat uit een 1:1 mengsel van oplossing 1 en oplossing 2. Beide oplossingen kunnen direct gemengd wanneer afgepipetteerde op de microarray of eerder gemengd worden. Het verschil tussen pre-mixen of mengen direct beïnvloedt alleen de houdbaarheid van de verhoging van de oplossing. Wanneer vooraf gemengde de houdbaarheid is van 5-7 dagen verhogen tot 30-45 dagen als niet vooraf gemengd.
Verdere analyse van de resultaten is gebleken dat de verhoging van de methode niet met de kwantitatieve analyse van de biosensor interfereert. Een lineaire correlatie tussen de intensiteit waargenomen en de concentratie van de analyt bleef (tabel 1). De gegevens die zijn verkregen voor 4 vooraf gekarakteriseerd klinische monsters met behulp van de op basis van glas allergeen component microarray immunoassay, met standaard fluorescentie detectie en colorimetrische detectie, bleek een goede overeenstemming tussen de twee detectiemethoden. Vergelijken van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI's) en de gemiddelde colorimetrische intensiteit (MCI), een gemiddelde R2 = 0.79 +/-0,08 is verkregen, wanneer de gegevens op beide assen 10-aangemeld. Dit experiment toonde aan dat de verhoging van de methode kan worden toegepast op een commerciële kit als het gebruikt van de nanoprobes voor detectie of aangepast voor nanosonde gebaseerde detectie worden kan.
De doeltreffendheid van de methode verbetering is gebaseerd op twee essentiële aspecten. Het is belangrijk om te verzekeren dat het mengsel van oplossing 1 en oplossing 2 is homogeen. Zonder een homogene menging, zal de sensor zijn in contact met breuken van de verhoging van de oplossing waar oplossing 1 of 2 is overheersend ten opzichte van de andere. Dat zal het verminderen van de efficiëntie van de verlaging van Au3 + op Au0, dus het beschadigen van de efficiëntie van de verhoging. Het is ook belangrijk dat het gehele gebied van belang voor de microarray in contact met de verhoging van de oplossing tijdens de incubatieperiode.
Om te bereiken verbetering van de ultrasensitive van een signaal, zal een langere incubatietijd (ongeveer 5 min) met de verbetering oplossing nodig zijn. Te voorkomen dat de ontwikkeling van achtergrondgeluiden die met het signaal overname interfereren kan, moet het oppervlak van microarray eerder geblokkeerde (bijvoorbeeld BSA, PEG) om te voorkomen dat snelle aspecifieke afzetting van Au0 en daaruit voortvloeiende vorming van een goud laag.
Een beperking aan de verhoging van de methode is de intrinsieke effectiviteit van de bepaling. De bepaling vereist met negatieve en positieve controles zodanig dat de signaal-verhoging waargenomen kan worden toegeschreven aan true-positieve resultaten. Als er een niet-specifieke interactie van de nanoprobes met de doelgroep, signalen verworven na verhoging niet geldig zullen zijn.
Andere toebehoren technieken zijn gebaseerd op de samenvoeging van beide nanoparticle of kleuring van de nanodeeltjes met een materiaal waarmee verbeterde signaal overname. Door de bevordering van het verzamelen van het aantal nanodeeltjes op de plaats van de opsporing, de signaal overname kunnen ofwel visueel of UV-Vis metingen. 5 deze signaal versterking technieken vertrouwen op een detectiesysteem in twee fasen, de eerste detectie van de analyt van belang en een tweede stap waarbij de verslaggever is vereist om te binden aan de eerste detectie construct. Dergelijke strategieën ontbreken universaliteit als gevolg van de eis van specifieke toebehoren protocolverbetering voor elk type van test.
De kleuring versterking technieken, zoals zilver kleuring, veel zoals het protocol hier gepresenteerd, laat de directe verbetering van het signaal detectie constructies. Echter, in tegenstelling tot het protocol dat wordt hier weergegeven, zilveren kleuring alleen gebleken op AuNPs of AgNPs toe te passen. 6 , 7 , 8 , 9
De toepasselijkheid van deze methode kan waarschijnlijk elke bepaling die gebruikmaakt van AuNPs, AgNPs, IONPs of SiNPs als detectie gemachtigden beslaan. Verder werk wordt uitgevoerd aan het bestuderen van de toepassing van de methode in sensoren bestaande uit andere materialen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering van de Europese Onderzoeksraad onder het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP/2007-2013) / ERC Grant overeenkomst nr. 615458, de Zweedse Onderzoeksraad en Pronova excellence center voor eiwit-technologie (VINNOVA - Zweeds Gouvernementele agentschap voor innovatiesystemen) wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
