Summary
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Signal-Verbesserung der Nanoprobe-basierte Biosensoren vorgestellt. Das Protokoll basiert auf die Reduzierung der Chlorogoldsäure auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden, die aus Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln bestehen.
Abstract
Die Verwendung von Nanosonden wie Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln als Nachweisreagenzen in bioanalytischen Assays können hohe Empfindlichkeit und bequeme farbmetrischen auslesen. Jedoch sind hohe Dichten von Nanopartikeln in der Regel für die Erkennung benötigt. Die verfügbaren Synthese-basierten Verbesserung Protokolle sind entweder beschränkt sich auf gold und Silber-Nanopartikel oder verlassen Sie sich auf präzise enzymatische Steuerung und Optimierung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das farbmetrische Auslesen von Gold, Silber, Kieselsäure und Eisenoxid Nanosonden zu verbessern. Es wurde beobachtet, dass die farbmetrische Signal von bis zu einem 10000-fold Faktor verbessert werden kann. Die Grundlage für solche Signal-Verbesserung-Strategien ist die chemische Reduktion von Au3 + Au0. Es gibt mehrere chemische Reaktionen, die es die Reduzierung der Au3 + Au0 ermöglichen. Im Protokoll gut Puffer und H2O2 dienen und es ist möglich, die Ablagerung von Au0 auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden in Nachteil der Bildung von neuen gold-Nanopartikeln zu bevorzugen. Das Protokoll besteht aus der Inkubation der Microarray mit einer Lösung bestehend aus Chlorogoldsäure und H2O2 in 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure pH 6 Puffer nach der Nanoprobe-basierte Erkennung-Assay. Die Verbesserung Lösung kann auf Papier und Glas-basierten Sensoren angewendet werden. Darüber hinaus kann in kommerziell erhältlichen Immunoassays verwendet werden, wie durch die Anwendung der Methode auf einen kommerziellen Allergen Microarray gezeigt. Die Signal-Entwicklung erfordert weniger als 5 min Inkubation mit Verbesserung Lösung und das Auslesen von bloßem Auge oder Low-End-Bild Erwerb Geräte wie eine Tischplatte Scanner oder eine Digitalkamera beurteilt werden kann.
Introduction
Die Verwendung von Nanomaterialien wie gold-Nanopartikeln (AuNPs) oder Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) hat die Anwendungen in Biosensoren mit verbesserte Empfindlichkeit und Vielseitigkeit erlaubt. 1 die Fülle der Methoden für die Dekoration der Oberfläche von Nanopartikeln mit verschiedenen Liganden, ihre hohe Fläche zum Volumenverhältnis, nutzen haben das Design der Sensoren mit verbesserter Empfindlichkeit ermöglicht. 2 doch ist ein Biosensoren Werkzeug hängt von der Anzahl der Nanosonden erforderlich um ein nachweisbares Signal zu erzielen. Z. B. bei 40 nm AuNPs ein Signal durch UV-Vis-Spektroskopie, ca. 90 × 106 Nanosonden zu erwerben ist erforderlich, um effektiv das Ziel von Interesse zu erkennen. 3 diese Nanoprobe Dichte Einschränkung kann durch den Einsatz von Signalverstärkung umgangen werden. Solche Strategien4 können anhand Oberflächenkräfte Aggregation oder Agglomeration, wo die Dichte der ersten Nanosonden erhöht wird, durch die Anhäufung einer zweiten Reihe von Nanosonden auf den ersten. 5 die Zahl der Nanopartikel an einer bestimmten Position auf einer Sensorfläche ermöglicht, Seh- oder UV-Vis-Signalerfassung. Die Empfindlichkeit des Tests wird jedoch von Natur aus mit targeting Kapazität des zweiten Satzes von Nanopartikeln in Richtung der Anfangssatz von Nanosonden verknüpft werden. Andere Strategien verlassen sich auf die Färbung der entweder gold und Silber Nanosonden. 6 , 7 die Färbung entsteht durch den Abbau von Silber-Ionen auf die Oberfläche der Nanopartikel, ermöglicht eine visuelle oder UV-Vis-Erkennung. 8 diese Methoden verbessern das Signal des bestehenden gold oder silberne Nanosonden von potenzierende Oberfläche Resonanz Plasmon-signal, nicht abhängig von sekundären targeting Ereignissen wie Oberflächenkräfte Agglomeration Methoden. Silberne Färbung Methoden sind jedoch nur mit Verwendung von gold oder Silber Nanosonden berichtet worden. 8 , 9
Im Jahr 2005 Zayats Et Al. 10 berichtet die Reduzierung der Au-Ionen auf die Oberfläche des gold Nanosonden um Oberflächen Plasmon Resonanzsignal zu erhöhen. In diesem Enzym-abhängige Arbeit wurde Wasserstoffperoxid durch Glukose-Oxidase-Katalyse und zusammen mit Cetyltrimethylammonium-Chlorid erlaubt die Reduzierung der Chlorogoldsäure generiert.
Vor kurzem Wang Et Al. eine Erweiterungsmethode wo eine Goldschicht entsteht berichtet auf der Oberfläche des bestehenden Nanosonden. 11 diese erweiterten Nanosonden angezeigt Peroxidase-ähnliche katalytische Aktivität gegen das Substrat 3′, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) ermöglicht die Visualisierung von eine leuchtend blaue Farbe mit bloßem Auge.
Stevens Et al. die Entwicklung eines plasmonische ELISA basierende Assays berichtet. 12 nach der Erkennung von einer Prostata-spezifischen Antigens (PSA) durch eine traditionelle ELISA-Strategie, wurde ein sekundärer Antikörper mit Katalase beschriftet mit dem Sensor nach dem der Sensor war eingebettet in eine Lösung mit Wasserstoffperoxid inkubiert und Chlorogoldsäure. Das Vorhandensein von der Katalase-modifizierte Sekundärantikörper (positives Ergebnis) würde die Förderung des Verbrauchs von Wasserstoffperoxid, Verlangsamung Chloroauric Säure Reduktion und nachgiebig quasi-sphärische Prozess AuNPs mit einer roten Farbe. Das Fehlen der Katalase-modifizierte Antikörper (negativ) erlaubt die Wasserstoffperoxid-Konzentration zu bleiben intakt, fördert damit die rasche Chloroauric Reduktion und nachgiebig AuNPs mit unklaren Morphologien verantwortlich für eine blau/lila Farbe . Die Konzentration von Wasserstoffperoxid, bestimmt durch die Aktivität der Katalase, wurde gezeigt, um die Konzentration des Analyten von Interesse korreliert werden. Die Notwendigkeit einer Katalase-modifizierte Sekundärantikörper und die Kontrolle über die Bedingungen der katalytischen Aktivität sind zwei Faktoren, die die Universalität dieser Methode zu behindern. Darüber hinaus kann die Bildung von Goldclustern, unabhängig von den bestehenden AuNPs Hintergrund Lärmprobleme Verstärkung Strategie vorstellen.
Die oben genannten Techniken, wie auch mehrere andere13,14,15, haben es möglich gemacht für Nanoprobe-basierte Biosensoren, Nachweisgrenzen auf Augenhöhe mit traditionellen Techniken zu erreichen.
Hier eine neuartige gold Erweiterungsmethode gezeigt hat, wo das Signal von einer vorhandenen Nanoprobe wird durch potenzierende oder Einführung ein Surface Plasmon-Resonanz-Signal verstärkt. Nach der Erkennung mit dem Einsatz von Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid-Nanopartikeln erfolgt, darf der Sensor mit einer Lösung aus einer Mischung von Wasserstoffperoxid und Chlorogoldsäure in 2-(N-Morpholino) inkubieren Ethanesulfonic Säure (MES) pH 6-Puffer. Die Konzentrationen der Komponenten in die Verbesserung Lösung wurden optimiert, um die Ablagerung von Au0 auf der Oberfläche des bestehenden Nanosonden begünstigen. Für alle untersuchten Nanoprobe Arten, dh. AuNPs, silberne-Nanopartikeln (AgNPs), Silica-Nanopartikel (SiNPs) und IONPs, die Bildung einer vagen Schicht ergab oder ergänzt die Streuung von Licht nachweisbar oder erhöhte sichtbares Zeichen geführt. Eine Erhöhung der Signal mit einem 100-fold Verstärkungsfaktor für Nanosonden in Papier und Glas-basierten Microarrays erreicht wurde und der Vorgang dauert weniger als 5 min, ein Signal zu erwerben. Die Signalerfassung getan werden könnte, mit bloßem Auge, UV-Vis Spektroskopie oder Low-End-Tools wie z. B. eine Digitalkamera oder einen Scanner Tischplatte imaging. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Erweiterung Protokoll ohne weiteres in einem handelsüblichen Allergie-Diagnostik-Assay angewendet werden kann, ohne gezielte Optimierung.
Protocol
Humanem Serumproben wurden in Übereinstimmung mit den rechtlichen und ethischen Anforderungen des Landes, Sammlung, dherhalten. mit der Zustimmung einer Ethikkommission (oder ähnlich) und mit schriftlicher Einwilligung des Spenders.
1. Verbesserung Vorbereitung der Lösung:
- Bereiten Sie einen 10 mM MES pH 6 Puffer die Aussetzung von MES Natriumsalz in entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6 mit einem 4 M NaOH-Lösung.
- Bereiten Sie eine 5 mM HAuCl4 Lösung in 10 mM MES pH 6 Puffer (Lösung 1).
- Bereiten Sie eine 1,027 M H2O2 Lösung in 10 mM MES pH 6 Puffer (Lösung 2).
Hinweis: Die Volumen der Lösung 1 und Lösung 2 richtet sich nach der Anzahl und Größe der Microarrays verbessert werden. Beispielsweise erfordert ein Microarray von 10 x 10 mm 100 μl Gesamtvolumen (Lösung 1 + 2-Lösung) um sicherzustellen, dass die Microarray befindet sich in Kontakt mit der Verbesserung Lösung. Nach Verdünnung sollte H2O2 innerhalb von ca. 30-45 Tagen verwendet werden.
(2) Nanopartikel Zubereitung:
- Bereiten Sie 40 nm AuNPs wie von Bastús Et al.beschrieben. Spritzen Sie 16 kurz, 1 mL wässerige 25 mM HAuCl4 Vorläufer in einer kochenden Lösung von 2,2 mM Natriumcitrat (149 mL). Warten Sie, bis eine Rotwein Farbe beobachtet wird. Verwenden Sie diese Lösung von Nanopartikeln als Samen für Samen Wachstumsschritte.
- Spritzen Sie bei 90 ° C 1 mL 60 mM Natriumcitrat gefolgt von 1 mL 25 mM HAuCl4 in den Samen, die Lösung enthalten. Nach 30 min ist die Reaktion abgeschlossen. Wiederholen Sie den Samen-Wachstum Schritt fünf Mal bis 40 nm Nanopartikel erhalten werden, wie von Bastús Et al.beschrieben. 16
- Messen Sie die Absorption von UV-Vis der endgültigen Lösung der Nanopartikel zur Bestimmung der Größe der Nanopartikel. 17 Alternativ Transmission Electron Mikrographen (TEM) erworben und verwendet werden können zur Bestimmung der Größe der Nanopartikel.
- Bereiten Sie 90 nm AgNPs wie von Rivero Et al.beschrieben. 18 kurz, Dimethylaminoborane (DMAB) einer kräftig gerührt Projektmappe hinzufügen von Poly (Acrylsäure, Natriumsalz) (PAA) und AgNO3. Der letzte Band der Lösung ist, 50 mL und die Endkonzentration von DMAB, PAA und AgNO3 sind 1,6 mM, 10 mM und 3,33 mM bzw..
Hinweis: 100 nm IONPs modifiziert mit Carboxylgruppen und 50 nm SiNPs mit Carboxylgruppen modifiziert wurden gekauft. - Funktionalisieren Sie die AuNPs mit Antikörpern nach dem Protokoll von Puertas Et al.beschrieben. 19 kurz, 1 mg COOH-PEG-SH (5000 G·mol−1) einer Projektmappe hinzufügen der 1.2x10-9 M AuNPs (10 optische Dichte, OD). Stellen Sie den pH-Wert auf 12 mit einer Lösung von 4 M NaOH.
- Lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur (~ 22 ° C), brüten unter milden Bedingungen rühren.
- Entfernen Sie das überschüssige PEG durch die Lösung bei 13800 X g für 15 min zentrifugieren.
- Das Pellet mit 500 μL deionisiertes Wasser Aufschwemmen.
- Inkubieren der PEG-modifizierte AuNPs mit 5 μmol N-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-Ethylcarbodiimide-Hydrochlorid (EDC) und 7,5 μmol von N-Hydroxysulfosuccinimide-Natriumsalz (Sulfo-NHS) in 10 mM MES pH 6 Puffer für 30 min bei 37 ° C.
- Entfernen Sie das überschüssige EDC und Sulfo-NHS durch die Lösung bei 13800 X g für 5 min zentrifugieren.
- Das Pellet in 500 µL 10 mM MES pH 6 Puffer Aufschwemmen und 100 G·mL-1 des Antikörpers hinzufügen. Lassen Sie die Lösung für 2 h bei 37 ° c inkubieren
- Entfernen Sie das überschüssige Antikörper durch zweimal die Lösung bei 13800 X g für 10 min Zentrifugieren und aufzuwirbeln Sie das Pellet in 500 μl 10 mM Natriumphosphat pH 7.5, 0,3 M NaCl Puffer. Lassen Sie die Lösung für 30 min bei 37 ° c inkubieren
- Entfernen des unspezifischen gebundenen Antikörpers durch Zentrifugieren die Lösung bei 13800 X g für 10 min. zweimal und das Pellet in 500 μl 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mM MES pH 6 Puffer aufzuwirbeln. Über Nacht inkubieren Sie die Proben bei 4 ° C.
- Waschen Sie den Überschuss der BSA zweimal die Lösung bei 13800 X g für 10 min Zentrifugieren und das Pellet in 500 μl 10 mM MES pH 6 Puffer resuspending.
- Folgen Sie den Schritten 2.5.1 durch 2.5.9 für die Modifikation von 5 M AgNPs, 0,5 mg IONPS und 0,5 mg SiNPs mit Antikörper, die Mengen an EDC und Sulfo-NHS entsprechend anpassen.
3. vertikale Strömung papierbasierte Tests:
- Bereiten Sie die Microarrays durch die Hinterlegung einer Gradienten Konzentration des Proteins G auf Nitrozellulose-Papier-Membran mit einem Roboter-Drucker. Lassen Sie nach dem Drucken der Microarrays über Nacht trocknen bei Raumtemperatur (~ 22 ° C).
- Führen Sie die vertikale Strömung Assay mit der Membran eingeschlossen in einen Filterhalter. Fließen Sie eine 8 M Lösung von IgG-modifizierte AuNPs mit einer Ultra-Spritze-Pumpe mit einer Rate von 1 mL·min−1. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer Lösung aus 17 M IgG-modifizierte AgNPs, 0,1 Mg·mL−1 IgG-modifizierte SiNPs und 0,1 Mg·mL−1 IgG-modifizierte IONPs.
- Lassen Sie die Microarrays für 30 min bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) trocknen und in einen Flachbett-Scanner mit 4800 dpi Auflösung scannen. Speichern Sie die Bilder als 24-Bit-Farbe-TIFF-Dateien.
4. verweisen Sie kommerzielle Glas basierende Assays:
- Inkubieren Sie zwei Glas-Objektträger für 120 min. für die Erkennung von Allergenkomponenten mit 4 verschiedenen menschlichen Serumproben bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Microarrays mit entionisiertem Wasser.
- Inkubation eine Folie mit einer fluoreszierenden konjugiert Anti-Human-IgE-Antikörper bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) für 30 min Inkubation der zweiten Folie mit Anti-Human-IgE Antikörper veränderte AuNPs für 30 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Microarrays mit entionisiertem Wasser.
- Messen der Fluoreszenzintensität von Microarray, die mit einem Laser-scanning-Apparat mit dem fluoreszierenden Anti-Human-IgE-Antikörper inkubiert wurde. Digitalisieren Sie die Microarray, die mit der Anti-Human IgE Antikörper-modifizierte AuNPs mit einem Table-Top-Scanner für farbmetrische Signalerfassung inkubiert wurde.
- Inkubieren Sie nach der Digitalisierung Microarray mit Verbesserung Lösung bei Raumtemperatur (~ 22° C) für 5 Minuten.
- Den Sensor mit entionisiertem Wasser spülen und für 10 min bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) trocknen lassen.
- Die Microarray mit einer Tischplatte Scanner mit 4800 dpi Auflösung für farbmetrische Signalerfassung zu digitalisieren. Speichern Sie die Bilder als 16-Bit-Graustufen TIFF-Dateien.
(5) Microarray Inkubation mit Verbesserung Lösung:
- Mischen Sie die gleiche Menge an Lösung 1 und Lösung 2 oder mischen sie direkt auf der Oberfläche des Sensors, und sicherzustellen Sie, dass die Fläche des Interesses auf dem Microarray mit der Mischung der Lösung bedeckt ist.
- Lassen Sie den Sensor Inkubation bei Raumtemperatur mit der Erweiterung-Lösung für bis zu 5 min. länger Inkubation Zeit verbesserte Empfindlichkeiten sowie höhere Rausch-/Signalverhältnis, vor allem für papierbasierte Microarrays Ausbeute kann.
- Waschen Sie die Microarray durch Eintauchen in entionisiertem Wasser einmal für 5 s. bei Raumtemperatur trocknen lassen.
Hinweis: Die Zeit der Trocknung hängt das Material der Microarray. Für eine Papier-basierte Microarray erfordert den Trocknungsschritt ca. 30 min. Für ein Glas-basierte Microarray erfordert dem Trocknungsschritt ca. 5-10min.
6. Bildgebung Analyse:
- Die Fluoreszenz-Intensitäten mit Software-Tool zu analysieren. Betrachten Sie alle Ergebnisse, die gleich oder größer als 0,3 Isac standardisieren Einheiten (ISU), folgen Sie den Hinweisen der Nutzung (DfU) der Sensorhersteller sind.
- Analysieren Sie die farbmetrischen Intensitäten mit einem Softwaretool. Invertieren Sie die Bilddateien, Messen Sie die Intensität von jedem Fleck und berechnen Sie die mittlere Pixel-Intensität. Verwenden Sie die Werte der dreifacher Spots um den Schlusssignal Wert als Mittelwert der drei mittleren Ort Pixelintensität zu berechnen.
Representative Results
Nachdem ein Test durchgeführt wird, mit Nanosonden stellvertretend Erkennung kann der Sensor-Erfassungsbereich mit Nanosonden (Abbildung 1(eine) aufgefüllt werden. Die Anzahl der Nanosonden unter dem Grenzwert für eine visuelle Erkennung ist, wird die Erkennung des Analyten zunächst negative berücksichtigt. Über das Protokoll hier vorgestellten (Abbildung 1b), ist das Signal von der Nanosonden potenzierte durch die Einführung einer vagen Schicht von Au (Abbildung 1c).
Ein Papier-basierten Immunoassay zur Detektion von Protein G erfolgte hinsichtlich die Wirksamkeit der Erweiterung Protokoll (Abbildung 2) zu präsentieren. AuNPs, AgNPs, SiNPs und IONPs wurden geändert mit IgG-Antikörper und verwendet und Erkennung Agenten. Papier-Microarrays waren bereit, einen Verlauf einer Reihe von G-Protein-Moleküle pro Spot haben.
Nachdem der Test durchgeführt wurde, es wurde beobachtet, dass IgG modifizierte AuNPs (IgG-AuNPs) konnten so niedrig wie 2 × 105 Moleküle pro Spot (Abbildung 2eine) erkennen, IgG modifizierte AgNPs (IgG-AgNPs) in der Lage waren zu erkennen, so niedrig wie 2 × 104 Moleküle pro Spot (Abbildung 2c), IgG geändert IONPs (IgG-IONPs) waren in der Lage zu erkennen, so niedrig wie 2 × 107 Moleküle pro (Abb. 2e Spot) und IgG geändert SiNPs (IgG-SiNPs) waren nicht in der Lage, ein optisches Signal ( Abbildung 2g).
Durch Inkubation der Microarrays mit Verbesserung Lösung, war es möglich, das Signal von 100fach erhöht für alle Arten von Nanopartikeln verwendet. Im Falle von SiNPs, Verbesserung Lösung machte es möglich, ein Signal zu beobachten, wo kein optisches Signal ohne Verbesserung Lösung beobachtet wurde (Abbildung 2b, 2d, 2f und 2 h).
Die Möglichkeit der Anwendung der Methode zu einem vorhandenen kommerziellen Immunoassay wurde bewertet. Die Verbesserung wurde auf ein Glas basiert Allergen Komponente Microarray Immunoassay durchgeführt. Ein Satz von 4 validiert und Serum Proben von allergischen Patienten mit der Microarray wurden gekennzeichnet (Proben wurden gekennzeichnet als a, b, c und d). Die standard fluorometrisch Erkennung des Assays wurde im Vergleich zu beflecken mit Anti-IgE beschriftet AuNPs gefolgt von der Verstärkung des Signals (Abbildung 3). Vor der Verbesserung waren keine Flecken auf der Microarrays erkannt wo die Erkennung mit Anti-IgE beschriftet AuNPs durchgeführt wurde. Nach Verbesserung mehrere Spots waren mit bloßem Auge sichtbar und ihre Intensität durch die Bild-Digitalisierung (Abbildung 3) registriert wurde. Mit der Fluoreszenz-Detektion, eine Vielzahl von Flecken waren erkannt (Abbildung 3).
Abbildung 1 . Abbildung der Schritte durchläuft ein Microspot von Analyten Erkennung auf verstärkte Signal. (ein) zwei Antikörper-modifizierten Nanosonden nach der Erkennung eines Analyten unbeweglich auf einem Microspot, (b) Inkubation von Microarray mit dem Enhancement-Protokoll und das anschließende Saatgut-Wachstum der Antikörper-modifizierten Nanosonden und () ( c) Microspot wo die Nanosonden vergrößert nach Inkubation 5 min mit der Erweiterung-Lösung. Diese Zahl wurde Dapted von Dias Et Al. 20 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Digitalisierte Bild von Microarrays zur Detektion von Protein G. Auf der linken Seite der einzelnen Microarray sind die beobachteten Microspots vor Verbesserung der Erkennung durchgeführt mit (einem) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs und (g) IgG-SiNPs. Auf der rechten Seite der einzelnen Microarray sind die Microspots nach Verbesserung der (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs und (h) IgG-SiNPs. Jede Konzentration des Proteins G wurde auf die Microarray in dreifacher Ausfertigung hinterlegt. Eine Berechnung der Anzahl an Protein, die G erfolgte anhand der Konzentration des Proteins in jeder Microspot gedruckt. Diese Zahl wurde angepasst von Dias Et Al. 20 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Korrelation zwischen Fluoreszenz Intensität und farbmetrischen Intensität erhalten für die Tests durchgeführt mit der kommerziellen Allergie diagnostischen Test. Meine Fluoreszenzintensität (MFI) und meine farbmetrischen Intensität (MCI) gemessen zum Nachweis von Allergenen in den Proben a, b, c und d. Einsätze sind die 10 umgestaltet Protokolldaten in den Pausen, in denen eine lineare Korrelation zwischen beiden Methoden beobachtet wurde. Die Intensität der Microspots beobachtet für den Nachweis anhand der Fluorophor-modifizierte Antikörper (Fluorophor-Ab) ist Fluoreszenzemission. Die Helligkeit der Microspots beobachtet für den Nachweis anhand der Ab-AuNPs-Assay wurde nach der Digitalisierung der Microarray und invertieren das Bild mit imaging-Software erhalten. Microarrays sind so ausgelegt, dass vertikale Triplicates mit Positivkontrollen für Fluoreszenz-Detektion auf der rechten Unterseite haben. Die anderen drei Ecken dienen zur Software-Evaluation. Bilder wurden in 16-Bit-Graustufen ausgewertet. Diese Zahl wurde angepasst von Dias Et Al. 20 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| R2 vorherige Verbesserung | R2 nach Verbesserung | |
| IgG-AuNPs | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| IgG-AgNPs | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| IgG-IONPs | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| IgG-SiNPs | - | 8.50E-01 |
Tabelle 1. R2 Werte für die Erkennung von Protein G, vor und nach Verbesserung, mit unterschiedlichen Sätzen von Nanopartikeln. R2 Werte stammen nach korrelieren die Intensität der Flecken mit der Konzentration des Analyten gemessen.
Discussion
Derzeit Signal Verbesserung Techniken für Assays mit Nanoprobe-basierte Erkennung sind entweder Enzymbasis12, erfordern eine zweite Reihe von Nanopartikeln auf die Erkennung Nanosonden21 oder, im Falle der Färbetechniken, sind beschränkt auf die Verwendung von AuNPs oder AgNPs als Erkennung Sonden. 22 , wird hier eine einfache, schnelle und Enzym-freie Methode für Signal-Verbesserung der Nanoprobe Erkennung basierende Assays bezeichnet. Mit dieser Methode war es möglich, das farbmetrische Signal von 4 Arten von Nanosonden zu erweitern: AuNPs, AgNPs, IONPs und SiNPs.
Die beobachteten Verstärkungsfaktor für jeden Satz von Nanosonden war 100fach, mit Ausnahme der SiNPs wo Quantifizierung des Faktors Erweiterung nicht möglich, da Mangel an Pre-Erweiterung Signale war. Diese Verstärkung Faktor legt nahe, dass die Effizienz des Protokolls über alle Arten von Nanosonden ähnlich ist. Wenn die Erweiterung Protokoll auf einem Papierträger durchgeführt wurde wo eine Verdünnungsreihe einer Aktie AuNPs Suspension gedruckt wurde, wurde darüber hinaus ein 10000-fold Verstärkungsfaktor beobachtet. Vorherigen zur Verbesserung, die sichtbaren Flecken mit der niedrigsten Anzahl von AuNPs wurden, wo etwa 10000 Nanopartikel gedruckt wurden, wurde nach Verbesserung die Plätze beherbergen weniger als 10 Nanopartikel sichtbar. 20
Die Bedingungen für die Erweiterung Protokoll hier vorgestellt haben erlaubt, unter Ausnutzung der Verringerung der Au3 + Au0 für das Signal verbessern und gleichzeitig die Geräuschkulisse auf ein Minimum. Die Verstärkung kann durchgeführt werden, gleich nachdem der Test durchgeführt wird, sowie auf Microarrays, die für gespeichert wurden, bis zu mehrere Monate nach der Test durchgeführt wurde. Die Verbesserung Lösung besteht aus einer 1:1 Mischung der Lösung 1 und Lösung 2. Beide Lösungen können zuvor gemischt oder direkt gemischt, wenn auf die Microarray pipettiert werden. Der Unterschied zwischen Vormischen oder direkte Vermischung betrifft nur die Haltbarkeit der Verbesserung Lösung. Bei vorgemischten die Haltbarkeit von 5-7 Tagen Erhöhung auf 30-45 Tage, wenn nicht vorgemischt.
Weitere Analysen der Ergebnisse hat gezeigt, dass die Quantitative Analyse der Biosensor der Erweiterungsmethode nicht stört. Eine lineare Korrelation zwischen der Intensität beobachtet und die Konzentration des Analyten konnte gehalten werden (Tabelle 1). Die Daten für 4 Pre charakterisierten klinischen Proben mit der Glas-basiert Allergen Komponente Microarray Immunoassay mit standard Fluoreszenz-Detektion und farbmetrische Erkennung, zeigte eine gute Übereinstimmung zwischen zwei Nachweismethoden. Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) und die mittlere farbmetrischen Intensität (MCI), eine durchschnittliche R2 = 0,79 + 0,08 / wurde erreicht, wenn die Daten auf beiden Achsen 10 angemeldet. Dieses Experiment hat gezeigt, dass der Erweiterungsmethode zu einem kommerziellen Kit angewendet werden kann, wenn es die Nanosonden zur Erkennung nutzt oder für Nanoprobe-basierte Erkennung angepasst werden kann.
Die Erweiterung Methode Wirksamkeit stützt sich auf zwei wichtige Aspekte. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Mischung der Lösung 1 und Lösung 2 ist homogen. Ohne eine homogene Mischung wird der Sensor, in Kontakt mit Bruchteilen von Verbesserung Lösung wo ist Lösung 1 oder 2 vorherrschende relativ zu den anderen. Das verringert die Leistung der Verringerung der Au3 + Au0, damit eine Beschädigung der Effizienz der Erweiterung. Es ist auch wichtig, das gesamte Gebiet des Interesses der Microarray in Kontakt mit der Verbesserung Lösung während der Inkubationszeit zu haben.
Um Gromer Verstärkung eines Signals zu erreichen, wird eine längere Inkubationszeit (ca. 5 min) mit der Verbesserung Lösung erforderlich sein. Um die Entwicklung von Hintergrundgeräuschen zu vermeiden, die die Signalerfassung stören können, sollte die Microarray Oberfläche zuvor blockierte (z.B. BSA, PEG), schnelle unspezifische Ablagerung von Au0 und daraus resultierende Bildung von Gold zu verhindern Schicht.
Eine Einschränkung der Erweiterungsmethode ist die innere Wirksamkeit des Assays. Der Test erfordert mit negativen und positiven Kontrollen sicherzustellen, dass die Signal-Verbesserung beobachtet wahr-Positive Ergebnisse zugeordnet werden kann. Wenn es eine unspezifische Interaktion von der Nanosonden mit dem Ziel, erworben Signale nach der Erweiterung nicht gültig werden.
Weitere Verbesserung Techniken sind basierend auf entweder Nanopartikel Aggregation oder Färbung der Nanopartikel mit einem Material, das verbesserte Signalerfassung ermöglicht. Durch die Förderung der Versammlung der Anzahl von Nanopartikeln bei der Erkennung, der Signalerfassung werden entweder visuell oder UV-Vis-Messungen. 5 diese Signal-Verbesserung-Techniken beruhen auf ein zweistufiges Detection System, der ersten Erkennung des Analyten von Interesse und in einem zweiten Schritt, wo die Reporter erforderlich ist, um an der ersten Erkennung Konstrukt zu binden. Solche Strategien fehlen Universalität aufgrund des spezifischen Erweiterung Protokoll Optimierung für jede Art von Test.
Die Färbung Verbesserung Techniken wie Silber-Färbung, viel wie das Protokoll hier dargestellt, ermöglichen die direkte Verbesserung des Signal-Erkennung-Konstrukte. Jedoch anders als das Protokoll, das hier gezeigt wird, silberne Färbung nur nachweislich auf AuNPs oder AgNPs angewendet werden. 6 , 7 , 8 , 9
Die Anwendbarkeit dieser Methode könnte wahrscheinlich jeder Assay erstrecken, die AuNPs, AgNPs, IONPs oder SiNPs als Erkennung Agenten verwendet. Weitere Arbeit wird durchgeführt, um die Anwendung der Methode in Sensoren bestehend aus anderen Materialien zu studieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat unter dem siebten Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC-Grant Agreement Nr. 615458, der schwedischen Forschungsrat und Pronova Excellence center für Proteintechnologie (VINNOVA - Schwedisch Staatliche Agentur für Innovationssysteme) ist dankbar anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
