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Chemistry

सीटू गोल्ड Nanoparticle संश्लेषण में तेजी से Nanoprobe संकेत बढोतरी

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/57297
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Division of Proteomics and Nanobiotechnology, Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, 2Global Research and Development, Thermo Fisher Scientific IDD

Summary

इस काम में, nanoprobe आधारित संवेदना के संकेत संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल मौजूदा nanoprobes कि सोने, चांदी, सिलिका या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों से मिलकर की सतह पर chloroauric एसिड की कमी पर आधारित है ।

Abstract

nanoprobes के उपयोग जैसे सोना, चांदी, सिलिका या आयरन-ऑक्साइड नैनोकणों के रूप में विश्लेषण परख में पहचान रिएजेंट के रूप में उच्च संवेदनशीलता और सुविधाजनक वर्णमिति readout सक्षम कर सकते हैं । हालांकि, नैनोकणों के उच्च घनत्व आम तौर पर पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । उपलब्ध संश्लेषण आधारित वृद्धि प्रोटोकॉल या तो सोने और चांदी नैनोकणों तक ही सीमित है या सटीक एंजाइमी नियंत्रण और अनुकूलन पर भरोसा करते हैं । यहां, हम सोने, चांदी, सिलिका, और आयरन ऑक्साइड nanoprobes के वर्णमिति readout को बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह देखा गया कि वर्णमिति संकेत एक 10000 गुना कारक तक सुधार किया जा सकता है । इस तरह के संकेत वृद्धि रणनीतियों के लिए आधार au3 + को au0के रासायनिक कमी है । वहां कई रासायनिक प्रतिक्रियाओं कि au3 + के लिए au0की कमी को सक्षम कर रहे हैं । प्रोटोकॉल में है, अच्छा बफ़र्स और एच2हे2 का उपयोग किया जाता है और यह मौजूदा nanoprobes की सतह पर Au0 के जमाव एहसान, नई गोल्ड नैनोकणों के गठन की हानि में संभव है । प्रोटोकॉल chloroauric एसिड और 2 में एच2ओ2 से मिलकर समाधान के साथ microarray की मशीन के होते हैं-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड पीएच 6 बफर nanoprobe आधारित जांच परख के बाद । वृद्धि समाधान कागज और कांच आधारित सेंसर करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध immunoassays में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में एक वाणिज्यिक एलर्जी microarray के लिए विधि के आवेदन द्वारा प्रदर्शन किया । संकेत विकास वृद्धि समाधान और readout नग्न आंखों या कम अंत छवि अधिग्रहण उपकरणों जैसे कि एक टेबल टॉप स्कैनर या एक डिजिटल कैमरा के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ कम 5 से अधिक गर्मी की आवश्यकता है ।

Introduction

गोल्ड नैनोकणों (AuNPs) या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONPs) जैसे मैटीरियल्स के प्रयोग ने बेहतर संवेदनशीलता और बहुमुखी प्रतिभा के साथ इस तरह के आवेदनों को संवेदना में अनुमति दी है । 1 विभिन्न लाइगैंडों के साथ नैनोकणों की सतह की सजावट के लिए विकसित तरीकों के ढेर सारे, मात्रा अनुपात करने के लिए अपने उच्च सतह का लाभ लेने के लिए के रूप में, बेहतर संवेदनशीलता के साथ सेंसर के डिजाइन सक्षम है. 2 फिर भी, एक संवेदन उपकरण एक जासूस संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक nanoprobes की संख्या पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, 40 एनएम AuNPs के मामले में, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से एक संकेत प्राप्त करने के लिए, लगभग 90 × 106 nanoprobes के लिए प्रभावी रूप से ब्याज के लक्ष्य का पता लगाने के लिए आवश्यक है । 3 इस nanoprobe घनत्व सीमा संकेत प्रवर्धन के उपयोग के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है । ऐसी रणनीतियों4 कण एकत्रीकरण या ढेर के आधार पर किया जा सकता है, जहां प्रारंभिक nanoprobes के घनत्व पहले पर nanoprobes का एक दूसरा सेट जमा द्वारा वृद्धि हुई है । 5 एक सेंसर सतह पर एक दिए गए स्थान पर नैनोकणों की संख्या में वृद्धि दृश्य या यूवी विज़ संकेत अधिग्रहण की अनुमति देता है । हालांकि, परख की संवेदनशीलता स्वाभाविक nanoprobes के प्रारंभिक सेट की ओर नैनोकणों के दूसरे सेट की लक्ष्यीकरण क्षमता से जुड़ा होगा । अंय रणनीतियों या तो सोने और चांदी nanoprobes के दाग पर भरोसा करते हैं । ६ , 7 धुंधला नैनोकणों की सतह पर चांदी आयनों की कमी के माध्यम से हासिल की है, एक दृश्य या यूवी की तुलना का पता लगाने को सक्षम करने से । 8 ये विधियां मौजूदा गोल्ड या सिल्वर nanoprobes के सिग्नल को potentiating करके सतह अनुनाद plasmon सिग्नल को बढ़ाती हैं, जो कि पार्टिकल ढेर तरीकों के अनुसार द्वितीयक लक्ष्यीकरण घटनाओं पर निर्भर नहीं करती हैं । हालांकि, चांदी धुंधला तरीकों केवल सोने या चांदी nanoprobes के उपयोग के साथ सूचित किया गया है । 8 , 9

2005 में, Zayats एट अल। 10 गोल्ड nanoprobes की सतह पर Au आयनों की कमी की सूचना के लिए सतह plasmon अनुनाद संकेत वृद्धि हुई है । इस एंजाइम पर निर्भर काम में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड ग्लूकोज oxidase catalysis द्वारा उत्पंन किया गया था और साथ में cetyltrimethylammonium क्लोराइड chloroauric एसिड की कमी की अनुमति दी ।

हाल ही में वांग एट अल. एक वृद्धि विधि जहां एक सोने की परत मौजूदा nanoprobes की सतह पर उत्पादन किया है की सूचना दी । 11 इन बढ़े nanoprobes सब्सट्रेट 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) नग्न आंखों से एक चमकदार नीले रंग के दृश्य को सक्षम करने के खिलाफ उत्प्रेरक गतिविधि की तरह प्रदर्शित peroxidase ।

स्टीवंस एट अल. एक plasmonic एलिसा आधारित परख के विकास की सूचना दी । 12 एक पारंपरिक एलिसा रणनीति के माध्यम से एक प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) का पता लगाने के बाद, catalase के साथ लेबल एक माध्यमिक एंटीबॉडी सेंसर के साथ तैयार किया गया था जिसके बाद सेंसर हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त समाधान में डूब गया था और chloroauric अम्ल. माध्यमिक catalase-संशोधित एंटीबॉडी की उपस्थिति (सकारात्मक परिणाम) हाइड्रोजन पेरोक्साइड की खपत को बढ़ावा देने, chloroauric एसिड की कमी को धीमा और एक लाल रंग के साथ अर्ध-गोलाकार monodispersed AuNPs उपज होगा । catalase के अभाव-संशोधित एंटीबॉडी (नकारात्मक परिणाम) हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता बरकरार रहने की अनुमति दी, इस प्रकार तेजी से chloroauric कमी को बढ़ावा देने और बीमार परिभाषित एक नीले रंग के लिए जिंमेदार morphologies के साथ AuNPs उपज/ . हाइड्रोजन पेरोक्साइड, catalase की गतिविधि द्वारा निर्धारित की एकाग्रता, ब्याज की analyte की एकाग्रता के लिए संबंधित होना करने के लिए दिखाया गया था । एक catalase संशोधित माध्यमिक एंटीबॉडी और उत्प्रेरक गतिविधि की शर्तों के नियंत्रण के लिए की जरूरत है कि इस पद्धति की सार्वभौमिकता में बाधा दो कारक हैं । इसके अलावा, सोने के समूहों के गठन, मौजूदा AuNPs से स्वतंत्र, प्रवर्धन रणनीति के लिए पृष्ठभूमि शोर मुद्दों को लागू कर सकते हैं ।

उपर्युक्त तकनीकों, के रूप में अच्छी तरह से कई दूसरों को13,14,15, यह संभव nanoprobe आधारित के लिए बनाया है के लिए पारंपरिक तकनीक के साथ सममूल्य पर पता लगाने की सीमा प्राप्त करने के लिए ।

यहां, एक उपंयास सोने की वृद्धि विधि का प्रदर्शन किया है, जहां एक मौजूदा nanoprobe के संकेत potentiating द्वारा परिलक्षित होता है या एक सतह plasmon अनुनाद संकेत शुरू । पता लगाने के बाद सोने, चांदी, सिलिका या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के उपयोग के साथ किया जाता है, सेंसर 2 में हाइड्रोजन पेरोक्साइड और chloroauric एसिड का एक मिश्रण का एक समाधान के साथ मशीन करने के लिए अनुमति दी है-(N-Morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) पीएच 6 बफर. वृद्धि समाधान में घटकों की सांद्रता मौजूदा nanoprobes की सतह पर Au0 के जमाव के पक्ष के लिए अनुकूलित किया गया । सभी अध्ययन के लिए nanoprobe प्रकार, यानी AuNPs, सिल्वर नैनोकणों (AgNPs), सिलिका नैनोकणों (SiNPs) और IONPs, एक बीमार परिभाषित परत के गठन की उपज या प्रकाश के बिखरने संवर्धित जो एक जासूसी या वृद्धि दिखाई संकेत के परिणामस्वरूप । एक 100 गुना प्रवर्धन कारक के साथ एक संकेत वृद्धि कागज और कांच आधारित microarrays में nanoprobes के लिए प्राप्त किया गया था और इस प्रक्रिया को एक संकेत प्राप्त करने के लिए 5 से कम मिनट लगते हैं । संकेत अधिग्रहण नग्न आंख द्वारा किया जा सकता है, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी या इमेजिंग कम अंत उपकरण जैसे एक डिजिटल कैमरा या एक टेबल टॉप स्कैनर । इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस वृद्धि प्रोटोकॉल आसानी से विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता के बिना एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलर्जी निदान परख में लागू किया जा सकता है ।

Protocol

मानव सीरम के नमूनों को संग्रह के देश की कानूनी और नैतिक आवश्यकताओं के अनुसार प्राप्त किया गया था । एक आचार समिति के अनुमोदन के साथ (या इसी तरह) और दाता से लिखित सहमति के साथ ।

1. वृद्धि समाधान तैयारी:

  1. एक 10 मिमी एमईएस पीएच 6 बफर को पानी में एमईएस सोडियम नमक निलंबित द्वारा तैयार करें । 6 एक 4 मीटर NaOH समाधान का उपयोग कर पीएच समायोजित करें ।
  2. 10 मिमी एमईएस पीएच 6 बफर (समाधान 1) में एक 5 मिमी HAuCl4 समाधान तैयार करें ।
  3. 10 मिमी एमईएस पीएच 6 बफर (समाधान 2) में एक १.०२७ एम एच2ओ2 समाधान तैयार करें ।
    नोट: दोनों समाधान 1 और समाधान 2 का वॉल्यूम बढ़ाया जा करने के लिए microarrays की संख्या और आकार पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, microarray 10 x 10 मिमी की आवश्यकता होती है 100 μL कुल खंड (समाधान 1 + समाधान 2) यह सुनिश्चित करने के लिए कि microarray क्षेत्र वृद्धि समाधान के साथ संपर्क में है । कमजोर पड़ने के बाद, एच2ओ2 लगभग 30-45 दिनों के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

2. नैनोकणों तैयारी:

  1. Bastús एट अलद्वारा बताए गए अनुसार 40 एनएम AuNPs तैयार करें । 16 संक्षेप में, 2.2 मिमी सोडियम साइट्रेट (149 एमएल) के एक उबलते समाधान में जलीय 25 मिमी HAuCl4 अग्रदूत की 1 मिलीलीटर सुई । रुको जब तक एक लाल शराब का रंग मनाया जाता है । बीज के लिए बीज विकास कदम के रूप में नैनोकणों के इस समाधान का उपयोग करें ।
  2. 90 ° c पर, 60 मिमी सोडियम साइट्रेट के 1 मिलीलीटर सुई 25 मिमी HAuCl4 के समाधान युक्त बीज में 1 एमएल द्वारा पीछा किया । 30 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया पूरी हो गई है । बीज वृद्धि कदम पांच बार 40 एनएम नैनोकणों जब तक दोहराएं प्राप्त कर रहे हैं, के रूप में Bastús एट अलद्वारा वर्णित है । 16
  3. नैनोकणों के आकार का निर्धारण करने के लिए नैनोकणों के अंतिम समाधान के यूवी की तुलना अवशोषक को मापने । 17 वैकल्पिक रूप से, पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (उनि) का अधिग्रहण किया जा सकता है और नैनोकणों के आकार का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया ।
  4. Rivero एट अलद्वारा बताए गए अनुसार 90 एनएम AgNPs तैयार करें । 18 संक्षेप में, पाली (एक्रिलिक एसिड, सोडियम नमक) (पा) और AgNO3के एक जोरदार उभार समाधान करने के लिए dimethylaminoborane (DMAB) जोड़ें । समाधान की अंतिम मात्रा 50 मिलीलीटर और DMAB की अंतिम एकाग्रता, पा और AgNO3 है 1.6 मिमी, 10 मिमी और 3.33 मिमी, क्रमशः ।
    नोट: 100 एनएम IONPs carboxyl समूहों के साथ संशोधित और 50 एनएम carboxyl समूहों के साथ संशोधित SiNPs खरीदा गया ।
  5. Functionalize Puertas एट अलद्वारा वर्णित प्रोटोकॉल निंनलिखित एंटीबॉडी के साथ AuNPs । 19 संक्षेप में, 1 मिलीग्राम जोड़ें COOH-खूंटी-एसएच (5000 g · मोल− 1) 1.2 x10 के समाधान के लिए-9 एम AuNPs (10 ऑप्टिकल घनत्व, आयुध डिपो) । 4 एम NaOH का एक समाधान के साथ पीएच 12 को समायोजित करें ।
    1. चलो समाधान गर्मी रात भर, कमरे के तापमान पर (~ 22 डिग्री सेल्सियस), हल्के सरगर्मी शर्तों के तहत ।
    2. 15 मिनट के लिए १३८०० x g पर समाधान केंद्रापसारक द्वारा खूंटी के अतिरिक्त निकालें ।
    3. जल के 500 μL के साथ गोली reसस्पेंड ।
    4. n-(3-Dimethylaminopropyl) के 5 μmol के साथ खूंटी संशोधित AuNPs-N'-ethylcarbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) और 7.5 μmol के एन-hydroxysulfosuccinimide सोडियम नमक (sulfo-एन एच एम) में 10 मिमी एमईएस पीएच 6 में 37 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए बफर ।
    5. 5 मिनट के लिए १३८०० x g पर समाधान केंद्रापसारक द्वारा EDC और sulfo-एन एच एस के अतिरिक्त निकालें ।
    6. 10 मिमी एमईएस पीएच 6 बफर के 500 µ एल में गोली reसस्पेंड और एंटीबॉडी के 100 ग्राम · एमएल-1 जोड़ें । 2 एच 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान के लिए मशीन चलो ।
    7. 10 मिनट के लिए दो बार १३८०० x g पर समाधान केंद्रापसारक द्वारा एंटीबॉडी के अतिरिक्त निकालें और 10 मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच 7.5, 0.3 M NaCl बफर के 500 μL में गोली reसस्पेंड । 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए समाधान की मशीन चलो ।
    8. 10 मिनट के लिए दो बार १३८०० x g पर समाधान केंद्रापसारक द्वारा विशिष्ट बाध्य एंटीबॉडी निकालें और 10 मिमी एमईएस पीएच 6 बफर में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के 500 μL में गोली reसस्पेंड । 4 ° c रातोंरात पर नमूनों की मशीन ।
    9. 10 मिनट के लिए दो बार १३८०० x g पर समाधान केंद्रापसारक द्वारा BSA के अतिरिक्त धो लो, और 10 मिमी एमईएस पीएच 6 बफर के 500 μL में गोली reसस्पैंड ।
    10. 5 एम AgNPs के संशोधन के लिए 2.5.9 के माध्यम से 2.5.1 चरणों का पालन करें, 0.5 मिलीग्राम IONPS और SiNPs के 0.5 मिलीग्राम एंटीबॉडी के साथ, EDC और sulfo-एन एच एस की मात्रा के अनुसार समायोजन ।

3. कार्यक्षेत्र फ्लो कागज आधारित परख:

  1. एक रोबोट प्रिंटर के साथ nitrocellulose कागज झिल्ली पर प्रोटीन जी का एक ढाल एकाग्रता जमा करके microarrays तैयार करते हैं । मुद्रण के बाद, microarrays कमरे के तापमान (~ 22 डिग्री सेल्सियस) पर रातोंरात सूखी चलो ।
  2. एक फिल्टर धारक में संलग्न झिल्ली के साथ कार्यक्षेत्र प्रवाह परख बाहर ले । 1 मिलीलीटर · min− 1की दर से एक अल्ट्रा-सिरिंज पंप का उपयोग कर आईजीजी-संशोधित AuNPs का एक 8 मीटर समाधान प्रवाह. 17 मीटर के समाधान के साथ इस कदम को दोहराएँ आईजीजी-संशोधित AgNPs, 0.1 mg · एमएल− 1 आईजीजी-संशोधित SiNPs और 0.1 mg · मब− 1 आईजीजी-संशोधित IONPs.
  3. microarrays 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (~ 22 डिग्री सेल्सियस) पर शुष्क और एक flatbed स्कैनर में उंहें एक 4800-डीपीआई संकल्प पर स्कैन करते हैं । 24-बिट रंग TIFF फ़ाइलों के रूप में छवियों को सहेजें ।

4. संदर्भ वाणिज्यिक ग्लास-परख आधारित:

  1. कमरे के तापमान पर 4 अलग मानव सीरम नमूनों के साथ एलर्जी घटकों का पता लगाने के लिए 120 मिनट के लिए दो गिलास स्लाइड ।
  2. microarrays को पानी से धो लें ।
  3. एक फ्लोरोसेंट के साथ एक स्लाइड-संयुग्मित विरोधी मानव IgE एंटीबॉडी कमरे के तापमान पर (~ 22 डिग्री सेल्सियस) 30 मिनट के लिए विरोधी के साथ दूसरी स्लाइड मशीन-मानव IgE एंटीबॉडी-संशोधित AuNPs कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
  4. microarrays को पानी से धो लें ।
  5. microarray कि फ्लोरोसेंट विरोधी मानव IgE एक लेज़र उपकरण स्कैनिंग के साथ एंटीबॉडी के साथ मशीन था की प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय । Digitalize microarray कि विरोधी मानव IgE एंटीबॉडी-AuNPs संकेत अधिग्रहण के लिए एक तालिका टॉप स्कैनर के साथ संशोधित वर्णमिति के साथ मशीन था ।
  6. डिजिटलाईजेशन के बाद, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (~ 22 डिग्री सेल्सियस) में वृद्धि समाधान के साथ microarray की मशीन ।
  7. पानी के साथ सेंसर कुल्ला और यह कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति (~ 22 डिग्री सेल्सियस) ।
  8. Digitalize microarray वर्णमिति संकेत प्राप्ति के लिए एक 4800-dpi रिज़ॉल्यूशन पर कोई तालिका-शीर्ष स्कैनर के साथ । 16-बिट ग्रेस्केल TIFF फ़ाइलों के रूप में छवियाँ सहेजें ।

वृद्धि समाधान के साथ 5. Microarray गर्मी:

  1. समाधान 1 और समाधान 2 की एक ही राशि के पूर्व मिश्रण या उंहें सीधे सेंसर की सतह पर मिश्रण, और सुनिश्चित करें कि microarray पर ब्याज के क्षेत्र समाधान के मिश्रण के साथ कवर किया जाता है ।
  2. 5 मिनट तक के लिए वृद्धि समाधान के साथ कमरे के तापमान पर सेंसर मशीन चलो. अब मशीन समय संवेदनशीलता सुधार के रूप में अच्छी तरह से उच्च शोर/संकेत अनुपात, विशेष रूप से कागज आधारित microarrays के लिए उपज सकते हैं ।
  3. 5 s. इसे कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए छोड़ दो एक बार पानी में यह विलय द्वारा microarray धो लो ।
    नोट: सुखाने कदम के समय microarray की सामग्री पर निर्भर करता है । एक कागज के लिए आधारित microarray, सुखाने कदम लगभग 30 मिनट की आवश्यकता है । एक गिलास के लिए आधारित microarray, सुखाने कदम लगभग 5-10 मिनट की आवश्यकता है ।

6. इमेजिंग विश्लेषण:

  1. सॉफ्टवेयर उपकरण के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण । सभी परिणाम है कि समान है या अधिक से अधिक 0.3 िसाक मानकीकरण इकाइयों (इसु), सेंसर निर्माता का उपयोग (DfU) के निर्देशों का पालन पर विचार करें ।
  2. एक सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर वर्णमिति तीव्रता का विश्लेषण । छवि फ़ाइलों को पलटना, प्रत्येक स्थान की तीव्रता को मापने और मतलब पिक्सेल तीव्रता की गणना । तीन मतलब स्पॉट पिक्सेल तीव्रता के एक मतलब के रूप में अंतिम संकेत मूल्य की गणना करने के लिए तपसिल धब्बे के मूल्यों का प्रयोग करें ।

Representative Results

एक परख किया जाता है के बाद, का उपयोग कर पता लगाने के एजेंटों के रूप में nanoprobes, सेंसर का पता लगाने क्षेत्र nanoprobes (चित्रा 1ए) के साथ आबादी हो सकती है । यदि nanoprobes की संख्या एक दृश्य का पता लगाने के लिए सीमा के नीचे है, analyte का पता लगाने, शुरू में, नकारात्मक माना जाएगा । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रयोग (चित्रा 1बी), nanoprobes के संकेत Au के एक बीमार परिभाषित परत (चित्रा 1सी) शुरू करने से potentiated है ।

एक कागज आधारित immunoassay प्रोटीन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया था के रूप में वृद्धि प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता प्रदर्शित करने के लिए (चित्रा 2) । AuNPs, AgNPs, SiNPs, और IONPs आईजीजी एंटीबॉडी और इस्तेमाल किया और जांच एजेंटों के साथ संशोधित किए गए थे । कागज microarrays के रूप में तैयार किया गया के लिए जगह प्रति प्रोटीन जी अणुओं की एक संख्या का ढाल है ।

परख किए जाने के बाद यह देखा गया कि आईजीजी संशोधित AuNPs (आईजीजी-AuNPs) के रूप में कम के रूप में पता लगाने में सक्षम थे के रूप में 2 × 105 स्थान प्रति अणुओं (चित्रा 2ए), आईजीजी संशोधित AgNPs (आईजीजी-AgNPs) के रूप में कम पता लगाने में सक्षम थे 2 × 104 हाजिर प्रति अणुओं (चित्रा 2सी), आईजीजी संशोधित IONPs (आईजीजी-IONPs) के रूप में कम के रूप में पता लगाने में सक्षम थे 2 के रूप में 107 स्थान प्रति अणुओं (चित्रा 2ई) और आईजीजी संशोधित SiNPs (आईजीजी-SiNPs) एक दृश्य संकेत प्रदान करने में सक्षम नहीं थे ( चित्रा 2जी).

वृद्धि समाधान के साथ microarrays मशीन द्वारा, यह 100 द्वारा संकेत बढ़ाने के लिए संभव था-नैनोकणों इस्तेमाल के सभी प्रकार भर में गुना । SiNPs के मामले में, वृद्धि समाधान यह एक संकेत है जहां कोई दृश्य संकेत वृद्धि समाधान के बिना मनाया गया निरीक्षण करने के लिए संभव बनाया (चित्रा 2बी, 2d, 2f और 2h).

एक मौजूदा वाणिज्यिक immunoassay करने के लिए विधि के आवेदन की संभावना का मूल्यांकन किया गया था । वृद्धि एक गिलास आधारित एलर्जी घटक microarray immunoassay पर किया गया था । एलर्जी रोगियों से 4 मांय और विशेषता सीरम नमूने का एक सेट microarray के साथ मूल्यांकन किया गया (नमूने ए, बी, सी और डी के रूप में नामित किया गया था) । इस परख के मानक fluorometric का पता लगाने के विरोधी के साथ दाग की तुलना में था IgE लेबल AuNPs संकेत की वृद्धि (चित्रा 3) के बाद । वृद्धि करने से पहले, microarrays जहां पता लगाना विरोधी IgE लेबल AuNPs के साथ किया गया था पर कोई धब्बे का पता लगाया गया । वृद्धि के बाद, कई स्थानों नग्न आंखों से दिखाई दे रहे थे और उनकी तीव्रता छवि डिजिटलाईजेशन (चित्रा 3) द्वारा पंजीकृत किया गया था । प्रतिदीप्ति पता लगाने के साथ, धब्बे की एक किस्म का पता लगाया गया था (चित्रा 3).

Figure 1
चित्र 1 . एक microspot analyte डिटेक्शन से बढ़ाया संकेत करने के लिए चरणों का चित्रण है । (क) दो एंटीबॉडी-संशोधित nanoprobes पर एक analyte मैटीरियल का पता लगाने के बाद microspot, (ख) microarray की वृद्धि प्रोटोकॉल और बाद में बीज-वृद्धि के साथ एंटीबॉडी-संशोधित nanoprobes और ( ग) microspot जहां nanoprobes के आकार वृद्धि समाधान के साथ 5 मिनट की मशीनिंग के बाद वृद्धि हुई है । यह आंकड़ा डायस एट अलसे dapted गया है । 20 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . प्रोटीन जी का पता लगाने के लिए microarrays की डिजीटल इमेज । प्रत्येक microarray के बाईं ओर (a) आईजीजी-AuNPs, (c) आईजीजी-AgNPs, (e) आईजीजी-IONPs और (g) आईजीजी-SiNPs के साथ किए गए पता लगाने की वृद्धि करने से पहले मनाया microspots हैं । प्रत्येक microarray के अधिकार पर (ख) आईजीजी-AuNPs, (घ) आईजीजी-AgNPS, (च) आईजीजी-IONPs और (ज) आईजीजी-SiNPs की बढोतरी के बाद microspots हैं । प्रोटीन जी की प्रत्येक एकाग्रता तपसिल में microarray पर जमा किया गया था । प्रोटीन जी की संख्या की एक गणना प्रत्येक microspot में छपी प्रोटीन की एकाग्रता के आधार पर किया गया था । यह आंकड़ा डायस एट अलसे अनुकूलित किया गया है । 20 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . फ्लोरोसेंट तीव्रता और वर्णमिति तीव्रता के बीच सहसंबंध वाणिज्यिक एलर्जी नैदानिक परख के साथ बाहर किए गए परख के लिए प्राप्त की । मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) और वर्णमिति तीव्रता (एमसीआई) नमूनों में एलर्जी का पता लगाने के लिए मापा मतलब ए, बी, सी, और घ. presets के अंतराल में जहां दोनों तरीकों के बीच एक रैखिक सहसंबंध देखा गया था लॉग 10 बदल डेटा रहे हैं. fluorophore-संशोधित एंटीबॉडी (fluorophore-Ab) के आधार पर पता लगाने के लिए मनाया microspots की तीव्रता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है । अटल-AuNPs परख पर आधारित पता लगाने के लिए मनाया microspots की चमक microarray digitalizing और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ छवि पलटने के बाद प्राप्त किया गया था । Microarrays के रूप में दूर सही नीचे पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के साथ ऊर्ध्वाधर triplicates है डिजाइन किए हैं । अंय तीन कोनों सॉफ्टवेयर मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है । छवियां 16-बिट ग्रेस्केल में विश्लेषित की गईं । यह आंकड़ा डायस एट अलसे अनुकूलित किया गया है । 20 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आर2 पूर्व संवर्धन आर2 के बाद वृद्धि
आईजीजी-AuNPs 8.70 ई-01 7.80 ई-01
आईजीजी-AgNPs 9.10 ई-01 9.60 ई-01
आईजीजी-IONPs 9.17 ई-01 9.30 ई-01
आईजीजी-SiNPs - सांय ई-01

तालिका 1. आर2 प्रोटीन का पता लगाने के लिए मान, पहले और वृद्धि के बाद, नैनोकणों के विभिन्न सेट का उपयोग कर. आर2 मूल्यों analyte मापा की एकाग्रता के साथ धब्बों की तीव्रता correlating के बाद प्राप्त किया गया ।

Discussion

वर्तमान में, nanoprobe के साथ परख के लिए संकेत वृद्धि तकनीक आधारित पहचान या तो एंजाइम आधारित है12, नैनोकणों के एक दूसरे सेट की आवश्यकता का पता लगाने nanoprobes21 लक्ष्य या, धुंधला तकनीक के मामले में, करने के लिए सीमित कर रहे है डिटेक्शन जांच के रूप में AuNPs या AgNPs का उपयोग । 22 यहां, एक सरल, तेजी से और एंजाइम मुक्त विधि nanoprobe का पता लगाने के संकेत वृद्धि आधारित परख के लिए वर्णित है । इस विधि के साथ, यह nanoprobes के 4 प्रकार: AuNPs, AgNPs, IONPs और SiNPs द्वारा प्रदान की वर्णमिति संकेत को बढ़ाने के लिए संभव था.

nanoprobes के प्रत्येक सेट के लिए मनाया प्रवर्धन कारक 100 गुना का था, SiNPs के लिए छोड़कर जहां ठहराव वृद्धि कारक के पूर्व वृद्धि संकेतों की कमी के कारण संभव नहीं था । इस वृद्धि कारक पता चलता है कि प्रोटोकॉल की क्षमता nanoprobes के सभी प्रकार के पार समान है । इसके अलावा, जब वृद्धि प्रोटोकॉल बाहर एक कागज समर्थन पर किया गया था, जहां एक शेयर AuNPs निलंबन की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला मुद्रित किया गया था, यह एक 10000 गुना प्रवर्धन कारक मनाया गया । वृद्धि करने के लिए पिछले, AuNPs की सबसे कम संख्या के साथ दिखाई धब्बे थे, जहां लगभग 10000 नैनोकणों मुद्रित किए गए थे, वृद्धि के बाद स्पॉट बंदरगाह से कम 10 नैनोकणों दृश्य बन गया । 20

वृद्धि प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत के लिए स्थापित शर्तों au3 + की कमी का लाभ लेने के संकेत के लिए au0 की अनुमति दी है, जबकि एक ंयूनतम करने के लिए पृष्ठभूमि शोर को बनाए रखने । वृद्धि सही किया जा सकता है परख के बाद प्रदर्शन के रूप में अच्छी तरह के रूप में microarrays पर है कि कई महीनों तक के लिए संग्रहीत किया गया है के बाद परख प्रदर्शन किया गया है । वृद्धि समाधान 1 समाधान और समाधान 2 के एक 1:1 मिश्रण के होते हैं । दोनों समाधान पहले मिलाया जा सकता है या सीधे मिलाया जब microarray पर pipetted । पूर्व मिश्रण या प्रत्यक्ष मिश्रण के बीच अंतर केवल शेल्फ-वृद्धि समाधान के जीवन को प्रभावित करता है । जब पूर्व मिश्रित शेल्फ-जीवन 5-7 दिनों के 30-45 दिनों में वृद्धि की है अगर नहीं पूर्व मिश्रित ।

इसके अलावा परिणामों के विश्लेषण से पता चला है कि वृद्धि विधि का मात्रात्मक विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । तीव्रता के बीच एक रैखिक सहसंबंध मनाया गया और analyte की एकाग्रता बनाए रखा गया था (तालिका 1) । ग्लास आधारित एलर्जी घटक microarray immunoassay का उपयोग कर 4 पूर्व विशेषता नैदानिक नमूनों के लिए प्राप्त डेटा, मानक प्रतिदीप्ति पता लगाने और वर्णमिति पता लगाने के साथ, दो का पता लगाने के तरीकों के बीच एक अच्छा सामंजस्य दिखाया. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) और मतलब वर्णमिति तीव्रता (एमसीआई) की तुलना, एक औसत आर2 = ०.७९ +/0.08 प्राप्त किया गया था जब डेटा 10-दोनों अक्षों पर लॉग इन है । इस प्रयोग से पता चला कि वृद्धि विधि एक वाणिज्यिक किट के लिए लागू किया जा सकता है अगर यह पता लगाने के लिए nanoprobes का उपयोग करता है या nanoprobe आधारित पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

वृद्धि विधि प्रभावकारिता दो महत्वपूर्ण पहलुओं पर निर्भर करता है । यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि समाधान 1 और समाधान 2 का मिश्रण समरूप है । एक समरूप मिश्रण के बिना, सेंसर वृद्धि समाधान के अंश के साथ संपर्क में हो जाएगा, जहां समाधान 1 या 2 प्रधान दूसरे के सापेक्ष है । कि au3 + au0की कमी की दक्षता कम हो जाएगा, इस प्रकार वृद्धि की क्षमता को नुकसान पहुँचाए । यह भी गर्मी की अवधि के दौरान वृद्धि समाधान के साथ संपर्क में microarray के हित के पूरे क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण है ।

एक संकेत के ultrasensitive वृद्धि को प्राप्त करने के लिए, एक लंबी गर्मी समय (लगभग 5 मिनट) वृद्धि समाधान के साथ की आवश्यकता होगी । पृष्ठभूमि शोर है कि संकेत अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप कर सकते है के विकास से बचने के लिए, microarray सतह पहले अवरुद्ध किया जाना चाहिए (जैसे BSA, खूंटी) Au0 और एक सोने के फलस्वरूप गठन के तेजी से विशिष्ट जमाव को रोकने के लिए परत.

वृद्धि विधि के लिए एक सीमा परख की आंतरिक प्रभावकारिता है । परख नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सुनिश्चित करने के लिए कि संकेत वृद्धि मनाया सच सकारात्मक परिणाम के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है की आवश्यकता है । यदि लक्ष्य के साथ nanoprobes की एक गैर विशिष्ट बातचीत है, तो वृद्धि के बाद अधिग्रहण किए गए सिग्नल मान्य नहीं होंगे ।

अंय वृद्धि तकनीक या तो nanoparticle एकत्रीकरण या एक सामग्री है कि सुधार संकेत अधिग्रहण की अनुमति देता है के साथ नैनोकणों के धुंधला पर आधारित हैं । पता लगाने साइट पर नैनोकणों की संख्या की सभा को बढ़ावा देने के द्वारा, संकेत अधिग्रहण या तो नेत्रहीन या यूवी विज़ माप संभव हो जाएगा । 5 ये सिग्नल वृद्धि तकनीक दो-चरणीय डिटेक्शन सिस्टम पर निर्भर करती है, ब्याज की analyte का प्रारंभिक पता लगाना और एक दूसरा चरण जहां रिपोर्टर को प्रारंभिक खोज का निर्माण करने के लिए बाइंड करना आवश्यक है । इस तरह की रणनीतियों परख के प्रत्येक प्रकार के लिए विशिष्ट वृद्धि प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता के कारण सार्वभौमिकता की कमी है ।

इस तरह के चांदी धुंधला के रूप में धुंधला बढ़ाने तकनीक, बहुत यहां प्रोटोकॉल की तरह प्रस्तुत की, संकेत का पता लगाने के निर्माण के प्रत्यक्ष वृद्धि की अनुमति । हालांकि, प्रोटोकॉल है कि यहां दिखाया गया है के विपरीत, चांदी धुंधला ही या तो AuNPs या AgNPs के लिए लागू किया जा दिखाया गया है । ६ , 7 , 8 , 9

इस विधि की प्रयोज्यता की संभावना किसी भी परख कि AuNPs का उपयोग करता है अवधि सकता है, AgNPs, IONPs या SiNPs का पता लगाने के एजेंटों के रूप में । इसके अलावा काम करने के लिए अंय सामग्री से मिलकर सेंसर में विधि के आवेदन का अध्ययन किया जा रहा है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (एफ पी/2007-2013)/ERC अनुदान समझौते No ६१५४५८, स्वीडिश अनुसंधान परिषद और प्रोटीन प्रौद्योगिकी के लिए इनोवा उत्कृष्टता केंद्र के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन (VINNOVA-स्वीडिश सरकारी एजेंसी नवाचार प्रणालियों के लिए) आभार स्वीकार किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroauric acid Sigma-Aldrich 254169 ALDRICH
Sodium citrate Sigma-Aldrich S4641 SIGMA-ALDRICH
Dimethylaminoborane  Sigma-Aldrich 476668 ALDRICH
Poly(acrylic acid, sodium salt)  Sigma-Aldrich 416037 ALDRICH
Silver nitrate Sigma-Aldrich 204390 ALDRICH
100 nm magnetic nanoparticles Ademtech 021111
50 nm silica nanoparticles Corposcular 140510-10
COOH-PEG-SH  RAPP Polymere 135000-4-32
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462 EMD MILLIPORE
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 SIGMA
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt  Sigma-Aldrich 56485 ALDRICH
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 95313 SIGMA-ALDRICH
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250 SIGMA
IgG antibody Abcam
Sodium phosphate  Sigma-Aldrich 342483 ALDRICH
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Bovine serum albumin VWR  422351S
Protein G Thermo Scientific 21193
Nitrocellulose paper membrane Whatman 10402096
Nanoplotter 2.1 robotic printer GeSIM
Filter holder Merck XX3001200
PhD2000 Ultrasyring pump Harvard
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II Cannon
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs  Thermofisher
Laser scanning LuxScan 10/K Capital Bio
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro Epson
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 Thermofisher 81-1011-01
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody  Thermofisher 81-1011-01
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4  Thermofisher

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References

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रसायन विज्ञान अंक 133 संकेत वृद्धि सोने नैनोकणों immunoassay nanoprobe microarray कागज आधारित परख ग्लास आधारित परख ऊर्ध्वाधर प्रवाह परख पार्श्व प्रवाह परख
सीटू गोल्ड Nanoparticle संश्लेषण <em>में</em> तेजी से Nanoprobe संकेत बढोतरी
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Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis. J. Vis. Exp. (133), e57297, doi:10.3791/57297 (2018).

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