Summary
I detta arbete presenteras ett protokoll för signal förbättring av nanoprobe-baserade biosensing. Protokollet är baserat på en minskning av chloroauric syra på ytan av befintliga nanoprober som består av guld-, silver-, kisel- eller järn-oxid nanopartiklar.
Abstract
Användning av nanoprober såsom guld-, silver-, kisel- eller järn-oxid nanopartiklar som upptäckt reagenser i bioanalytisk analyser kan aktivera hög känslighet och bekväm kolorimetriska avläsning. Dock behövs vanligen höga tätheter av nanopartiklar för upptäckt. Protokollen finns syntes-baserade förbättring är antingen begränsat till guld och silver nanopartiklar eller lita på enzymatisk precisionskontroll och optimering. Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra den kolorimetriska avläsningen av guld, silver, kiseldioxid och järnoxid nanoprober. Det observerades att den kolorimetriska signalen kan förbättras genom upp till en 10000-fold faktor. Grunden för sådan signal enhancement strategier är det kemisk reduktion av Au3 + Au0. I området i närheten finns det flera kemiska reaktioner som gör att en minskning av Au3 + Au0. I protokollet, Goods buffertar och H2O2 används och det är möjligt att gynna nedfall av Au0 på ytan av befintliga nanoprober, på bekostnad av bildandet av nya guld nanopartiklar. Protokollet består av inkubering av microarray med en lösning bestående av chloroauric syra och H2O2 i 2-(N-morpholino) ethanesulfonic surt pH 6 bufferten efter nanoprobe-baserad detektion analysen. Enhancement lösningen kan tillämpas på papper och glas-baserade sensorer. Dessutom kan den användas i kommersiellt tillgängliga immunoanalyser framgår av tillämpningen av metoden på en kommersiell allergen microarray. Signal utvecklingen kräver mindre än 5 minuters inkubation med lösningen förbättring och utslaget kan bedömas av blotta ögat eller low-end bild förvärv enheter såsom en bordsskiva skanner eller en digitalkamera.
Introduction
Användningen av nanomaterial som Guldnanopartiklar (AuNPs) eller järnoxid nanopartiklar (IONPs) har tillåtna program i biosensing med förbättrad känslighet och mångsidighet. 1 uppsjö av metoder som utvecklats för dekoration av ytan av nanopartiklar med olika ligander, att dra nytta av deras höga yta volym förhållande, har aktiverat utformningen av sensorer med förbättrad känslighet. 2 dock ett biosensing verktyg är beroende av antalet nanoprober som krävs för att uppnå en detekterbara signal. Till exempel när det gäller 40 nm AuNPs, att förvärva en signal via UV-vis spektroskopi, cirka 90 × 106 nanoprober krävs för att effektivt upptäcka föremål för intresse. 3 denna nanoprobe densitet begränsning kan kringgås med hjälp av signal förstärkning. Sådana strategier4 kan baseras på interparticle aggregering eller tätbebyggelse, där tätheten av inledande nanoprober ökas genom att ackumulera en andra uppsättning nanoprober vid först. 5 öka antalet nanopartiklar på en given plats på en sensor yta tillåter visuell eller UV-vis signal förvärv. Dock kommer att analysens känslighet vara förknippad med inriktning kapaciteten i den andra uppsättningen av nanopartiklar mot den ursprungliga uppsättningen nanoprober. Andra strategier är beroende av färgningen av antingen guld och silver nanoprober. 6 , 7 färgningen uppnås genom minskning av silverjoner på ytan av de nanopartiklar, möjliggör en visuell eller UV-vis-detektion. 8 dessa metoder öka signalen av befintliga guld eller silver nanoprober av potentierande ytan resonans plasmon signal, inte beroende på sekundär målgrupp händelser som i interparticle gytter metoder. Silver färgning metoder har emellertid endast rapporterats med användning av guld eller silver nanoprober. 8 , 9
I 2005, Zayats et al. 10 rapporterade en minskning av Au joner på ytan av guld nanoprober att öka ytan plasmon resonans signalen. I detta enzym-beroende arbete genererades väteperoxid av glukos oxidas katalys och tillsammans med cetyltrimethylammonium klorid tillåtna minskning av chloroauric syra.
Mer nyligen Wang et al. rapporterade en förbättring metod där ett guld lager produceras på ytan av befintliga nanoprober. 11 dessa utvidgade nanoprober visas peroxidas-liknande katalytiska aktivitet mot de substrat 3′, 5, 5 '-tetrametylbensidin (TMB) möjliggör visualisering av en ljust blå färg för blotta ögat.
Stevens et al. redovisas utvecklingen av en plasmoniska ELISA-baserad analys. 12 efter upptäckt av ett prostataspecifikt antigen (PSA) genom en traditionell ELISA strategi, var en sekundär antikropp märkt med katalas inkuberas med sensorn varefter sensorn var nedsänkt i en lösning som innehåller väteperoxid och chloroauric syra. Förekomst av sekundära katalas-modifierade antikroppen (positivt resultat) skulle främja konsumtionen av väteperoxid, sakta chloroauric syra sänkning och ger nästan sfärisk monodispersed AuNPs med en röd färg. Avsaknad av katalas-modifierade antikroppen (negativa resultat) tillåtna koncentrationen i väteperoxid att förbli intakt, vilket främjar snabb chloroauric minskning och ger AuNPs med oklara morfologier ansvarar för en blå/lila färg . Koncentrationen av väteperoxid, bestäms av aktiviteten av katalas, visades vara korrelerade till koncentrationen av analyten sevärdheter. Behovet av en katalas-modifierade sekundär antikropp och kontroll av villkoren för den katalytiska aktiviteten är två faktorer som hindrar denna metod universalitet. Dessutom införa bildandet av guld kluster, oberoende av den befintliga AuNPs, bakgrund bullerproblem till strategin förstärkning.
De ovan nämnda teknikerna, som också flera andra13,14,15, har gjort det möjligt för nanoprobe-baserade biosensorer att nå detektionsgränser i paritet med traditionella tekniker.
Här, en roman guld förbättring metod demonstreras, där signalen från en befintlig nanoprobe förstärks av potentierande eller införa en ytan plasmon resonans signal. Efter identifieringen genomförs med användning av guld-, silver-, kisel- eller järnoxid nanopartiklar, sensorn är tillåtet att Inkubera med en lösning av en blandning av väteperoxid och chloroauric syra i 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syra (MES) pH 6 buffert. Koncentrationerna av komponenterna i enhancement lösningen var optimerad för att gynna nedfall av Au0 på ytan av befintliga nanoprober. För alla studerade nanoprobe typer, dvs. AuNPs, Silvernanopartiklar (AgNPs), kiseldioxid nanopartiklar (SiNPs) och IONPs, bildandet av en dåligt definierad lager gav eller augmented spridningen av ljuset vilket resulterade i en detekterbar eller ökad synlig signal. En signal ökning med en 100-faldig förstärkningsfaktor uppnåddes för nanoprober i papper och glas-baserade microarrays och processen tar mindre än 5 min att förvärva en signal. Förvärvet signal skulle kunna göras för blotta ögat, UV-vis spektroskopi eller imaging low-end verktyg såsom en digitalkamera eller en skanner i bordsskivan. Det visades dessutom att denna förbättring protokoll kan lätt tillämpas i ett kommersiellt tillgängliga allergi diagnostiska test utan att kräva specifika optimering.
Protocol
Humant serumprover erhölls i enlighet med de juridiska och etiska krav i landet där samlingen, dvs. med godkännande av en etikkommitté (eller liknande) och med skriftligt medgivande från givaren.
1. förbättring lösning beredning:
- Förbereda en 10 mM MES pH 6 buffert genom att avbryta MES natriumsalt i avjoniserat vatten. Justera pH till 6 med en 4 M NaOH-lösning.
- Förbereda en 5 mM HAuCl4 lösning i 10 mM MES pH 6 buffert (lösning 1).
- Bered en 1.027 M H2O2 i 10 mM MES pH 6 buffert (lösning 2).
Obs: Volymerna av både lösning 1 och lösning 2 beror på antalet och storleken på microarrays förbättras. En microarray 10 x 10 mm kräver exempelvis 100 μL totala volym (lösning 1 + lösning 2) att säkerställa att området microarray är i kontakt med den förbättring lösningen. Efter utspädning, bör H2O2 användas inom cirka 30-45 dagar.
2. nanopartiklar beredning:
- Förbereda 40 nm AuNPs som beskrivs av Bastús et al. 16 injicera kort, 1 mL vattenlösning 25 mM HAuCl4 föregångare i en kokande lösning av 2,2 mM natriumcitrat (149 mL). Vänta tills en rödvin färg observeras. Använd denna lösning av nanopartiklar som frön för utsäde-tillväxten steg.
- Vid 90 ° C, injicera 1 mL 60 mM natriumcitrat följt av 1 mL 25 mM HAuCl4 i utsädet innehållande lösning. Efter 30 min är reaktionen klar. Upprepa detta utsäde-tillväxt fem gånger tills 40 nm nanopartiklar erhålls, som beskrivs av Bastús et al. 16
- Mät UV-vis absorbansen av finallösningen av nanopartiklar för att fastställa storleken på nanopartiklarna. 17 alternativt överföring elektronmikrografier (TEM) kan vara förvärvat och används för att fastställa storleken på nanopartiklarna.
- Förbereda 90 nm AgNPs som beskrivs av Rivero et al. 18 kort, lägga till dimethylaminoborane (DMAB) i en kraftfullt rörs lösning av poly (akrylsyra, natriumsalt) (PAA) och AgNO3. Den slutliga volymen av lösningen är 50 mL och DMAB, PAA slutliga koncentration och AgNO3 är 1,6 mM, 10 mM och 3.33 mM, respektive.
Obs: 100 nm IONPs modifierad med carboxyl grupper och 50 nm SiNPs modifierad med carboxyl grupper köptes. - Functionalize AuNPs med antikroppar mot protokollet beskrivs av Puertas et al. 19 kort, lägga till 1 mg COOH-PEG-SH (5000 g·mol−1) i en lösning av 1.2x10-9 M AuNPs (10 optiska densitet, OD). Justera pH till 12 med en lösning av 4 M NaOH.
- Låt lösningen Inkubera över natten, vid rumstemperatur (~ 22 ° C), under milda omrörning förhållanden.
- Ta bort överskottet av PEG genom centrifugering lösningen vid 13800 x g i 15 min.
- Återsuspendera pelleten med 500 μL av avjoniserat vatten.
- Inkubera i PEG-modified AuNPs med 5 μmol av N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC) och 7,5 μmol av N-hydroxysulfosuccinimide natriumsalt (sulfo-NHS) i 10 mM MES pH 6 buffert under 30 minuter vid 37 ° C.
- Ta bort överskottet av EDC och sulfo-NHS genom centrifugering lösningen vid 13800 x g i 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 500 µL 10 mM MES pH 6 buffert och tillsätt 100 g·mL-1 antikroppar. Låt lösningen Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Ta bort överskottet av antikropp genom centrifugering lösningen vid 13800 x g under 10 minuter två gånger och återsuspendera pelleten i 500 μL 10 mM natriumfosfat pH 7.5, 0,3 M NaCl buffert. Låt lösningen Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Avlägsna ospecifikt bundna antikroppen genom centrifugering lösningen vid 13800 x g under 10 minuter två gånger och återsuspendera pelleten i 500 μL av 1% bovint serumalbumin (BSA) i 10 mM MES pH 6 buffert. Inkubera proverna vid 4 ° C över natten.
- Tvätta överskottet av BSA genom centrifugering lösningen vid 13800 x g under 10 minuter två gånger, och omblandning pelleten i 500 μL 10 mM MES pH 6 buffert.
- Följ stegen 2.5.1 genom 2.5.9 om ändring av 5 M AgNPs, 0,5 mg IONPS och 0,5 mg av SiNPs med antikropp, justera kvantiteterna EDC och sulfo-NHS med detta.
3. vertikala flödet pappersbaserade analyser:
- Förbereda microarrays genom att deponera en lutning koncentration av protein G på nitrocellulosa papper membran med en robotic skrivare. Efter utskrift, låt den microarrays torka över natten i rumstemperatur (~ 22 ° C).
- Utföra vertikal flow analysen med membran inneslutna i en filterhållare. Flöda en 8 M lösning av IgG-modifierat AuNPs använder en ultra-sprutpumpen med en hastighet av 1 mL·min−1. Upprepa detta steg med en lösning av 17 M IgG-modifierade AgNPs, 0,1 mg·mL−1 IgG-modifierat SiNPs och 0,1 mg·mL−1 IgG-modifierat IONPs.
- Låt microarrays torka vid rumstemperatur (~ 22 ° C) i 30 min och skanna dem i en flatbäddsskanner med 4800 dpi upplösning. Spara bilderna som 24-bitars färg TIFF-filer.
4. referens kommersiella glas-baserade analyser:
- Inkubera två glasskivor för 120 min för detektion av allergen komponenter med 4 olika humant serumprov vid rumstemperatur.
- Skölj microarrays med avjoniserat vatten.
- Inkubera en bild med en fluorescerande-konjugerad antihuman IgE-antikroppar vid rumstemperatur (~ 22 ° C) för 30 min. Inkubera den andra bilden med anti-humant IgE antikroppar-modifierat AuNPs för 30 min i rumstemperatur.
- Skölj microarrays med avjoniserat vatten.
- Mät fluorescensintensiteten hos den microarray som var inkuberas med den fluorescerande antihuman IgE-antikroppen med en laserscanning apparater. Digitalisera den microarray som var inkuberas med den anti-humant IgE antikroppar-modifierat AuNPs med en bordsskiva scanner för kolorimetrisk signal förvärv.
- Efter digitaliseringen, inkubera i microarray med förbättring lösning vid rumstemperatur (~ 22° C) under 5 minuter.
- Skölj sensorn med avjoniserat vatten och låt det torka i 10 minuter vid rumstemperatur (~ 22 ° C).
- Digitalisera microarray med en bordsskiva scanner 4800 dpi upplösning för kolorimetrisk signal förvärv. Spara bilderna som 16-bitars gråskala TIFF-filer.
5. Microarray inkubation med förbättring lösning:
- Pre blanda samma mängd lösning 1 och lösning 2 eller blanda dem direkt på ytan av sensorn, och säkerställa att området av intresse på microarray är täckt med blandningen av lösning.
- Låt sensorn Inkubera vid rumstemperatur med enhancement lösningen för upp till 5 min. längre inkubation kan tid ge förbättrad känslighet samt högre brussignalen/förhållande, speciellt för pappersbaserade microarrays.
- Tvätta microarray genom att dränka det i avjoniserat vatten en gång för 5 s. lämnar den att torka i rumstemperatur.
Obs: Tiden för torkning steget beror på materialet i microarray. För en pappersbaserade microarray kräver det snabbtorkande steget cirka 30 min. För en glas-baserade microarray kräver det snabbtorkande steget cirka 5-10 min.
6. imaging analys:
- Analysera stödnivåerna som fluorescens med programvaruverktyg. Överväga alla resultat som är lika eller större än 0,3 Isac standardisera enheter (ISU), enligt anvisningarna för användning (DfU) av sensor tillverkaren.
- Analysera de kolorimetriska stödnivåer som använder ett verktyg. Invertera bildfiler, mäta intensiteten i varje plats och beräkna medelvärdet pixel intensiteten. Använd värdena för de tre exemplar ställen för att beräkna slutliga signalvärdet som ett medelvärde av tre genomsnittlig plats pixel stödnivåer.
Representative Results
Efter en analys genomförs, med nanoprober som upptäckt ombud, kan sensor detekteringsområdet fyllas med nanoprober (figur 1en). Om antalet nanoprober understiger gränsen för en visuell identifiering, detektion av analyten, inledningsvis betraktas negativt. Med hjälp av protokollet som presenteras här (figur 1b), är signalen för nanoprober förstärkte genom att införa en dåligt definierad lager av Au (figur 1c).
En pappersbaserade immunoassay avsedd för detektering av Protein G genomfördes att demonstrera effektiviteten av protokollet enhancement (figur 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs och IONPs ändrades med IgG antikroppar och används och upptäckt agenter. Papper microarrays var beredd att ha en gradient av ett antal Protein G molekyler per plats.
Efter analysen genomfördes, observerades det att IgG modifierade AuNPs (IgG-AuNPs) kunde upptäcka så lågt som 2 × 105 molekyler per plats (figur 2en), IgG modifierade AgNPs (IgG-AgNPs) kunde upptäcka så lågt som 2 × 104 molekyler per plats (figur 2c), IgG modified IONPs (IgG-IONPs) kunde upptäcka så låg som 2 × 107 molekyler per plats (figur 2e) och IgG modifierade SiNPs (IgG-SiNPs) inte har kunnat ge en visuell signal ( Figur 2g).
Ruvar microarrays med lösningen förbättring, var det möjligt att öka signalen av 100-fold över alla typer av nanopartiklar som används. När det gäller SiNPs, enhancement lösningen gjorde det möjligt att observera en signal där ingen visuell signal observerades utan förbättring lösningen (figur 2b, 2d, 2f och 2 h).
Möjligheten att tillämpningen av metoden på ett existerande kommersiella immunoassay utvärderades. Förbättrad genomfördes på en glas-baserade allergen komponent microarray immunoassay. En uppsättning 4 validerade och kännetecknas serum prover från allergiska patienter utvärderades med microarray (prover designerades som a, b, c och d). Standard fluorometric detektion av denna analys jämfördes med färgning med anti-IgE märkt AuNPs följt av förstärkningen av signalen (figur 3). Innan förbättring upptäcktes inga fläckar på den microarrays där detektion genomfördes med anti-IgE märkt AuNPs. Efter förbättring, flera ställen var synliga för blotta ögat och deras intensitet registrerades av bilden digitalisering (figur 3). Med fluorescens upptäckt, en mängd ställen var upptäckt (figur 3).
Figur 1 . Illustration av stegen en microspot genomgår från analyten upptäckt till förstärkt signal. (en) två antikropp-modifierat nanoprober efter upptäckt av en analyt orörlig på en microspot, (b) inkubering av microarray med protokollet förbättring och efterföljande utsäde-tillväxt av antikropp-modifierat nanoprober och () c) microspot där storleken på nanoprober ökade efter inkubation 5 min med enhancement lösningen. Denna siffra har varit dapted från Dias et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Digitaliserad avbildning av microarrays för detektion av protein G. Till vänster om varje microarray är den observerade microspots innan förbättring av detektering utförs med (en) IgG-AuNPs, (c), IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs och (g), IgG-SiNPs. Till höger om varje microarray är microspots efter förbättring av (b), IgG-AuNPs, (d), IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs och (h), IgG-SiNPs. Varje koncentration av protein G deponerades på microarray i tre exemplar. En beräkning av antalet protein G skedde utifrån koncentrationen av protein ut i varje microspot. Denna siffra har anpassats från Dias et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Korrelation mellan fluorescerande intensitet och kolorimetriska intensitet erhålls för analyserna som utförs med kommersiella allergi diagnostisk analys. Menar fluorescensintensiteten (MFI) och menar kolorimetriska intensitet (MCI) mätt för detektion av allergener i proverna a, b, c och d. inläggningar är 10 omvandlas loggdata i pauserna där en linjär korrelation mellan båda metoderna observerades. Intensiteten i den microspots som observerats för påvisande baserat på fluorophore modifierade antikroppen (Fluorophore-Ab) är fluorescens utsläpp. Ljusstyrkan på den microspots som observerats för påvisande baserat på Ab-AuNPs analysens erhölls efter digitalisera microarray och vända bilden med bildhanteringsprogram. Microarrays är konstruerade att ha vertikala exemplar med positiva kontroller för fluorescens upptäckt längst längst till höger. De andra tre hörnen används för utvärdering av programvara. Bilderna analyseras i 16-bitars gråskala. Denna siffra har anpassats från Dias et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| R2 tidigare enhancement | R2 efter förbättring | |
| IgG-AuNPs | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| IgG-AgNPs | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| IgG-IONPs | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| IgG-SiNPs | - | 8.50E-01 |
Tabell 1. R2 värden för detektion av protein G, före och efter förbättring, använder olika uppsättningar av nanopartiklar. De R2 värdena erhölls efter korrelera intensiteten av fläckarna med koncentrationen av analyten mätt.
Discussion
För närvarande signal förstärkningstekniker för analyser med nanoprobe-baserad detektion är antingen enzym-baserade12, kräva en andra uppsättning nanopartiklar att rikta de Upptäck nanoprober21 eller, när det gäller färgningsteknik, är begränsade till användning av AuNPs eller AgNPs som upptäckt sonder. 22 här, en enkel, snabb och enzym-fri metod beskrivs signal förbättring av nanoprobe upptäckt-baserade analyser. Med denna metod, var det möjligt att förbättra kolorimetriska signalen som tillhandahålls av 4 typer av nanoprober: AuNPs, AgNPs, IONPs och SiNPs.
Den observerade förstärkningsfaktor för varje uppsättning nanoprober var av 100-fold, utom den SiNPs där kvantifiering av enhancement faktorn inte var möjligt på grund brist före enhancement signaler. Denna förbättring faktor antyder att effektiviteten i protokollet är liknande för alla typer av nanoprober. Dessutom när protokollet enhancement genomfördes på ett pappersstöd där en utspädning serie en stamlösning AuNPs trycktes, observerades en 10000-fold förstärkningsfaktor. Tidigare till förbättring, de synliga ställen med det lägsta antalet AuNPs var där cirka 10000 nanopartiklar trycktes, efter förbättring fläckarna härbärgerat mindre än 10 nanopartiklar blev synligt. 20
De villkor som fastställts för protokollet förbättring som här presenteras har tillåtit att dra nytta av en minskning av Au3 + Au0 för signalen att förbättra, bibehållen bakgrund buller till ett minimum. Förstärkningen kan utföras direkt efter analysen utförs såväl som på microarrays som har lagrats för upp till flera månader efter analysen utfördes. Enhancement lösningen består av en 1:1 blandning av lösning 1 och lösning 2. Båda lösningarna kan tidigare blandas eller direkt blandade när pipetteras till microarray. Skillnaden mellan pre blandning eller blanda direkt påverkar bara hållbarheten av enhancement lösningen. När pre-blandad hållbarhet är 5-7 dagar stiger till 30-45 dagar om inte förblandad.
Vidare analys av resultaten har visat att metoden enhancement inte stör kvantitativ analys av biosensor. En linjär korrelation mellan observerade intensiteten och koncentrationen av analyten bibehölls (tabell 1). Uppgifterna om 4 pre kännetecknas kliniska prover med glas-baserade allergen komponent microarray immunoassay, med standard fluorescens upptäckt och kolorimetriska upptäckt, visade en god överensstämmelse mellan de två identifieringsmetoder. Jämför medelvärdet fluorescensintensiteten (MFI) och genomsnittlig kolorimetriska intensiteten (MCI), en genomsnitt R2 = 0,79 +/-0,08 erhölls när data är 10-inloggad på båda axlarna. Detta experiment visade att metoden förbättring kan tillämpas på ett kommersiella kit om det använder nanoprober för detektion eller kan anpassas för nanoprobe-baserad detektion.
Förbättring metod effekten är beroende av två kritiska aspekter. Det är viktigt att säkerställa att blandningen av lösning 1 och lösning 2 är homogen. Utan en homogen blandning, kommer att sensorn vara i kontakt med bråkdelar av enhancement lösningen där lösning 1 eller 2 är dominerande i förhållande till den andra. Som kommer att minska effektiviteten i minskningen av Au3 + Au0, således skada effektiviteten i förstärkningen. Det är också viktigt att ha det hela området av intresse för microarray kontakt med enhancement lösningen under inkubationstiden.
För att uppnå ultrasensitive förbättring av en signal, kommer en längre inkubationstid (ca 5 min) med enhancement lösningen att krävas. För att undvika utveckling av bakgrund buller som kan störa signalen förvärvet, ska microarray ytan vara tidigare blockerade (t.ex. BSA, PEG) att förhindra snabb ospecifikt nedfall av Au0 och därav bildandet av guld skikt.
En begränsning till metoden förbättring är inneboende effekten av analysen. Analysen kräver att ha negativa och positiva kontroller som säkerställer att den signalen förbättringen observeras kan hänföras till sant positiva resultat. Om det finns en icke-specifik interaktion av nanoprober med målet, förvärvade signaler efter förbättring inte kommer att vara giltigt.
Andra förstärkningstekniker är baserat på antingen nanopartiklar aggregering eller färgning av nanopartiklarna med ett material som tillåter bättre signal förvärv. Genom att främja insamling av antalet nanopartiklar på webbplatsen identifiering, signal förvärvet blir möjligt antingen visuellt eller UV-Vis mätningar. 5 dessa signal förstärkningstekniker lita på ett två-stegs system för upptäckt, den inledande identifieringen av analyten av intresse och ett andra steg där reportern krävs att binda till den inledande identifiering konstruktion. Sådana strategier saknar universalitet på grund av kravet på viss förbättring protokoll optimering för varje typ av test.
De färgning förstärkningstekniker, såsom silver färgning, mycket som protocol här presenteras, tillåta en direkt förbättring av signal upptäckt konstruktioner. Men till skillnad från det protokoll som visas här, har silverfärgning bara visats tillämpas på antingen AuNPs eller AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
Tillämpligheten av denna metod kunde sannolikt spänner någon analysmetod som använder AuNPs, AgNPs, IONPs eller SiNPs som upptäckt agenter. Ytterligare arbete genomförs för att studera tillämpningen av metoden i sensorer som består av andra material.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering från Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant avtal nr 615458, Vetenskapsrådet och Pronova excellence center för protein-teknik (VINNOVA - svenska Verket för innovationssystem) är erkänt tacksamt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
