Summary
I dette arbejde præsenteres en protokol for signal forstærkning af nanoprobe-baseret biosensing. Protokollen er baseret på en reduktion af chloroauric syre på overfladen af eksisterende nanoprobes, der består af guld, sølv, silica eller jernoxid nanopartikler.
Abstract
Brugen af nanoprobes som guld, sølv, silica eller jernoxid nanopartikler som påvisning reagenser i bioanalytisk assays kan aktivere høj følsomhed og bekvemt kolorimetriske udlæsning. Høje tætheder af nanopartikler skal dog typisk til påvisning. De tilgængelige syntese-baserede enhancement protokoller er enten begrænset til guld og sølv nanopartikler eller stole på præcis enzymatisk styring og optimering. Vi præsenterer her, en protokol for at forbedre de kolorimetriske udlæsning af guld, sølv, silica og jern oxid nanoprobes. Det blev observeret, at de kolorimetriske signal kan forbedres ved op til en 10000-fold faktor. Grundlaget for sådanne signal enhancement strategier er kemisk reduktion af Au3 + til Au0. Der er flere kemiske reaktioner, der muliggør reduktion af Au3 + til Au0. I protokollen, gods buffere og H2O2 bruges og det er muligt at favorisere aflejring af Au0 på overfladen af eksisterende nanoprobes, på bekostning af dannelsen af nye guld nanopartikler. Protokollen består af inkubation af microarray med en løsning bestående af chloroauric syre og H2O2 i 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre pH 6 buffer efter nanoprobe-baseret detektion assay. Ekstraudstyr løsning kan anvendes til papir og glas-baserede sensorer. Det kan desuden bruges i kommercielt tilgængelige immunassays som påvist ved anvendelse af metoden til en kommerciel allergen microarray. Signal udvikling kræver mindre end 5 min af inkubationen med ekstraudstyr løsning og udlæsningen kan vurderes ved blotte øje eller low-end billede erhvervelse enheder som en tabel-top scanner eller et digitalt kamera.
Introduction
Brugen af nanomaterialer såsom guld nanopartikler (AuNPs) eller jernoxid nanopartikler (IONPs) har tilladt programmerne i biosensing med forbedret følsomhed og alsidighed. 1 overfloden af metoder udviklet til udsmykning af overfladen af nanopartikler med forskellige ligander, at drage fordel af deres høje overflade til volumen-forholdet, har aktiveret design af sensorer med forbedret følsomhed. 2 alligevel, en biosensing værktøj er afhængig af antallet af nanoprobes kræves for at opnå en påviselig signal. For eksempel, i tilfælde af 40 nm AuNPs, at erhverve en signal gennem UV-vis spektroskopi, ca 90 × 106 nanoprobes er påkrævet for at registrere effektivt mål af interesse. 3 denne nanoprobe tæthed begrænsning kan omgås ved hjælp af signal forstærkning. Sådanne strategier4 kan være baseret på interparticle sammenlægning eller det bymæssige område, hvor tætheden af indledende nanoprobes er øget ved at akkumulere et andet sæt af nanoprobes ved først. 5 en mangedobling af nanopartikler i en given situation på en sensoren overfladen giver visual eller UV-vis signal erhvervelse. Dog vil følsomheden af analysen i sagens natur knyttet til målretning kapaciteten af det andet sæt af nanopartikler mod det første sæt af nanoprobes. Andre strategier stole på farvning af enten guld og sølv nanoprobes. 6 , 7 farvning opnås gennem reduktion af sølv ioner på overfladen af nanopartikler, gør det muligt for en visuel eller UV-vis-detektion. 8 disse metoder øge signal af eksisterende guld eller sølv nanoprobes af forstærket overflade resonans plasmon signal, ikke afhængigt af sekundære målretning begivenheder som i interparticle byområdet metoder. Sølv farvning metoder er dog kun indberettet med brug af guld eller sølv nanoprobes. 8 , 9
I 2005, Zayats mfl. 10 rapporteret reduktion af Au-ioner på overfladen af guld nanoprobes at øge overflade plasmon resonans signal. I dette enzym-afhængige arbejde, blev hydrogenperoxid genereret af glucose stavbakterier katalyse og sammen med cetyltrimethylammonium chlorid tilladt en reduktion af chloroauric syre.
For nylig Wang mfl. rapporteret en enhancement metode hvor en guld lag er produceret på overfladen af eksisterende nanoprobes. 11 disse udvidede nanoprobes vises peroxidase-lignende katalytiske aktivitet mod underlaget 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) aktivering visualisering af en lys blå farve af blotte øje.
Stevens et al. rapporterede om udviklingen af en plasmonic ELISA-baseret analyse. 12 efter påvisning af en prostata-specifikt antigen (PSA) gennem en traditionel ELISA strategi, en sekundær antistof mærket med katalase blev inkuberet med sensoren efter som sensoren blev nedsænket i en oploesning indeholdende hydrogenperoxid og chloroauric syre. Den sekundære katalase modificerede antistof (positive resultat) ville fremme forbruget af hydrogenperoxid, aftagende chloroauric syre reduktion og eftergivende kvasi sfæriske monodispersed AuNPs med en rød farve. Fravær af katalase modificerede antistof (negativt) tilladt hydrogenperoxid koncentration at forblive intakt, således at fremme hurtig chloroauric reduktion og eftergivende AuNPs med dårligt defineret morfologier ansvarlig for en blå/lilla farve . Koncentrationen af hydrogenperoxid, bestemmes af aktiviteten af katalase, viste sig at være korreleret til koncentrationen af analysanden af interesse. Behovet for en katalase modificerede sekundær antistof og kontrol af betingelserne for den katalytiske aktivitet er to faktorer, der hindrer universel anvendelse af denne metode. Derudover kan dannelsen af guld klynger, uafhængigt af de eksisterende AuNPs, indføre baggrund støjproblemer forstærkning strategi.
De ovennævnte teknikker, som også flere andre13,14,15, har gjort det muligt for nanoprobe-baserede biosensorer at opnå detektionsgrænser på lige fod med traditionelle teknikker.
Her, en roman guld enhancement metode er demonstreret, hvor signalet fra en eksisterende nanoprobe forstærkes af forstærkende eller indfører en overflade plasmon resonans signal. Efter påvisning er udført med brug af guld, sølv, silica eller jernoxid nanopartikler, sensoren er tilladt at udruge med en opløsning af en blanding af hydrogenperoxid og chloroauric syre i 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) pH 6 buffer. Koncentrationerne af komponenterne i enhancement løsning var optimeret til at favorisere aflejring af Au0 på overfladen af eksisterende nanoprobes. Alle studeret nanoprobe typer, dvs. AuNPs, sølv nanopartikler (AgNPs), silica nanopartikler (SiNPs) og IONPs, dannelsen af en dårligt defineret lag givet eller augmented spredning af lyset, hvilket resulterede i en påviselig eller øget synligt signal. En signal stigning med en 100-fold forstærkning faktor var opnået for nanoprobes i papir og glas-baserede microarrays og processen tager mindre end 5 min. at anskaffe et signal. Signal erhvervelse kunne gøres ved at blotte øje, UV-vis spektroskopi eller imaging low-end værktøjer som et digitalt kamera eller en tabel-top scanner. Derudover blev det påvist at dette ekstraudstyr protokol kan anvendes let og et kommercielt tilgængelige allergi diagnostiske assay uden at kræve bestemte optimering.
Protocol
Menneskelige serumprøver blev opnået i henhold til de juridiske og etiske krav til indsamlingsland, dvs. med godkendelse af en etisk komité (eller lignende) og med skriftligt samtykke fra donor.
1. ekstraudstyr løsning forberedelse:
- Forberede en 10 mM MES pH 6 buffer ved at suspendere MES natriumsalt i ionbyttet vand. PH indstilles til 6 ved hjælp af en 4 M NaOH-opløsning.
- Forbered en 5 mM HAuCl4 løsning i 10 mM MES pH 6 buffer (løsning 1).
- Forberede en 1.027 M H2O2 løsning i 10 mM MES pH 6 buffer (løsning 2).
Bemærk: Bind af både løsning 1 og løsning 2 afhænger af antallet og størrelsen af microarrays styrkes. For eksempel kræver et microarray af 10 x 10 mm 100 μL samlede volumen (løsning 1 + løsning 2) at sikre at området microarray er i kontakt med ekstraudstyr løsning. Efter fortynding, bør H2O2 anvendes inden for ca 30-45 dage.
2. nanopartikler forberedelse:
- Forberede 40 nm AuNPs som beskrevet af Bastús al.. 16 kort, indsprøjte 1 mL vandig 25 mM HAuCl4 forløber i en kogende opløsning af 2,2 mM natrium citrat (149 mL). Vent, indtil en rød-vin farve er observeret. Brug denne løsning af nanopartikler som frø for frø-vækst trin.
- Ved 90 ° C, indsprøjte 1 mL af 60 mM natriumcitrat efterfulgt af 1 mL af 25 mM HAuCl4 i de frø, der indeholder løsning. Efter 30 min er reaktionen færdig. Gentag trinnet frø-vækst fem gange indtil 40 nm nanopartikler er fremstillet, som beskrevet af Bastús al.. 16
- Absorbansen UV-vis af den endelige løsning af nanopartikler til fastsættelse af størrelsen af nanopartikler. 17 alternativt transmissions elektron micrographs (TEM) kan erhverves og anvendes til at bestemme størrelsen af nanopartikler.
- Forberede 90 nm AgNPs som beskrevet af Rivero mfl. 18 kort, tilføje dimethylaminoborane (DMAB) til et kraftigt omrørt løsning af poly (acrylsyre, natriumsalt) (PAA) og AgNO3. Den endelige mængden af løsningen er 50 mL og den endelige koncentration af DMAB, PAA og AgNO3 er 1,6 mM, 10 mM og 3,33 mM, henholdsvis.
Bemærk: 100 nm IONPs modificeret med carboxyl grupper og 50 nm SiNPs modificeret med carboxyl grupper blev købt. - Functionalize AuNPs med antistoffer efter protokollen beskrevet af Puertas mfl. 19 kort, tilføje 1 mg af COOH-PIND-SH (5000 g·mol1) til en løsning af 1.2x10-9 M AuNPs (10 optisk tæthed, OD). PH indstilles til 12 med en opløsning af 4 M NaOH.
- Lad løsningen der inkuberes natten over, ved stuetemperatur (~ 22 ° C), mild omrøring betingelser.
- Fjern overskydende af PIND ved centrifugering løsning ved 13800 x g i 15 min.
- Resuspenderes med 500 μL ionbyttet vand.
- Inkuber den PIND-modificerede AuNPs med 5 μmol af Nielsen-(3-Dimethylaminopropyl)'-ethylcarbodiimide hydrochlorid (EDC) og 7,5 μmol af N-hydroxysulfosuccinimide natriumsalt (sulfo-NHS) i 10 mM MES pH 6 buffer i 30 minutter ved 37 ° C.
- Fjern overskydende af EDC og sulfo-NHS ved centrifugering løsning på 13800 x g i 5 min.
- Resuspenderes i 500 µL af 10 mM MES pH 6 buffer og tilføje 100 g·mL-1 antistof. Lad løsningen der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
- Fjerne overskydende antistof ved centrifugering løsning på 13800 x g i 10 min. to gange og resuspenderes i 500 μl af 10 mM natriumfosfat pH 7,5, 0,3 M NaCl buffer. Lad løsningen Inkubér i 30 minutter ved 37 ° C.
- Fjerne den uspecifik bundne antistof ved centrifugering løsning på 13800 x g i 10 min. to gange og resuspenderes i 500 μL af 1% bovint serumalbumin (BSA) i 10 mM MES pH 6 buffer. Inkuber prøver ved 4 ° C natten over.
- Vask overskydende af BSA ved centrifugering løsning på 13800 x g i 10 min. to gange, og resuspending pellet i 500 μl af 10 mM MES pH 6 buffer.
- Følg trin 2.5.1 gennem 2.5.9 for ændring af 5 M AgNPs, 0,5 mg IONPS og 0,5 mg af SiNPs med antistof, justere mængden af EDC og sulfo-NHS tilsvarende.
3. lodret flow papirbaserede assays:
- Forberede microarrays ved at deponere en gradient koncentration af protein G på nitrocellulose papir membran med en robot printer. Efter udskrivning, skal du lade microarrays tørre natten ved stuetemperatur (~ 22 ° C).
- Udføre lodret flow assay med membran lukket i en filterholder. Flyde en 8 M opløsning af IgG-ændret AuNPs ved hjælp af en ultra-sprøjten pumpe med en hastighed på 1 mL·min1. Gentag dette trin med en opløsning af 17 M IgG-modificerede AgNPs, 0,1 mg·mL1 IgG-ændret SiNPs og 0,1 mg·mL1 IgG-ændret IONPs.
- Lad microarrays tørt ved stuetemperatur (~ 22 ° C) i 30 min og scanne dem i en flatbedscanner med en 4800 dpi opløsning. Gemme billeder som TIFF-filer, 24-bit farve.
4. reference kommercielle glas-baserede assays:
- Inkuber to glas dias for 120 min til påvisning af allergen komponenter med 4 forskellige menneskelige serumprøver ved stuetemperatur.
- Skyl microarrays med deioniseret vand.
- Incubate ét dias med et fluorescerende-konjugerede anti-menneskelige IgE antistof ved stuetemperatur (~ 22 ° C) i 30 min. Incubate det andet dias med antihumant IgE antistof-ændret AuNPs i 30 min. ved stuetemperatur.
- Skyl microarrays med deioniseret vand.
- Måle fluorescens-intensiteten af den microarray, der blev inkuberet med fluorescerende antihumant IgE antistof med en laser scanning apparater. Digital microarray der blev inkuberet med antihumant IgE antistof-modificerede AuNPs med en tabel-top scanner for kolorimetriske signal erhvervelse.
- Efter digitalisering, Ruger microarray med ekstraudstyr løsning ved stuetemperatur (~ 22° C) i 5 min.
- Skyl sensor med deioniseret vand og lad det tørre i 10 min. ved stuetemperatur (~ 22 ° C).
- Digital microarray med en bordplade scanner på en 4800 dpi opløsning for kolorimetriske signal erhvervelse. Gemme billederne som 16-bit gråtoneskala TIFF-filer.
5. Microarray inkubering med ekstraudstyr løsning:
- Pre Bland den samme mængde af løsning 1 og løsning 2 eller bland dem direkte på overfladen af sensoren, og sikre, at området af interesse på microarray er dækket med en blanding af løsning.
- Lad sensoren Inkuber ved stuetemperatur med ekstraudstyr løsning for op til 5 min. længere inkubation tid kan give forbedret følsomheder samt højere støj/signal forhold, især for papirbaserede microarrays.
- Afvaske microarray ved nedsænkning i ionbyttet vand en gang for 5 s. lader det tørre ved stuetemperatur.
Bemærk: Tid af trinnet tørring afhænger materiale af microarray. For en papir-baseret microarray kræver tørring trin ca 30 min. For et glas-baserede microarray kræver tørring trin ca 5-10 min.
6. imaging analyse:
- Analysere fluorescens intensiteter med softwareværktøj. Overveje alle resultater, der er lig med eller større end 0,3 Isac Standardiser enheder (ISU), efter brug (DfU) sensor fabrikantens anvisninger.
- Analysere de kolorimetriske intensiteter ved hjælp af en software-værktøj. Invertere billedfiler, måle intensiteten af hver plet og beregne den gennemsnitlige pixel intensitet. Brug værdierne for de tredobbelt steder til at beregne den endelige signalværdi som et gennemsnit af de tre betyde spot pixel intensiteter.
Representative Results
Efter en analyse er foretaget, ved hjælp af nanoprobes som registrering agenter, kan sensoren bevægelsesdetektering område befolket med nanoprobes (figur 1en). Hvis antallet af nanoprobes er under grænsen for en visuel genkendelse, påvisning af analysanden, i første omgang betragtes som negative. Ved hjælp af protokollen præsenteres her (figur 1b), er signalet fra nanoprobes forstærkede ved at indføre en dårligt defineret lag af Au (figur 1c).
En papir-baseret immunassay til påvisning af Protein G blev udført at fremvise effektiviteten af ekstraudstyr protokol (figur 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs og IONPs blev ændret med IgG antistoffer og brugt og registrering agenter. Papir microarrays blev udarbejdet, har et forløb en række Protein G molekyler pr. spot.
Efter analysen blev foretaget, det blev observeret, IgG modificeret AuNPs (IgG-AuNPs) var i stand til at opdage så lavt som 2 × 105 molekyler pr. spot (figur 2en), IgG modificeret AgNPs (IgG-AgNPs) var i stand til at opdage så lavt som 2 × 104 molekyler pr. spot (figur 2c), IgG modificeret IONPs (IgG-IONPs) var i stand til at opdage så lavt som 2 × 107 molekyler pr. spot (figur 2e) og IgG modificeret SiNPs (IgG-SiNPs) ikke var i stand til at give et visuelt signal ( Figur 2g).
Ved at inkubere microarrays med ekstraudstyr løsning, det var muligt at øge signal af 100 på tværs af alle typer af nanopartikler anvendes. I forbindelse med SiNPs, ekstraudstyr løsning gjort det muligt at observere et signal hvor ingen visuelle signal blev observeret uden ekstraudstyr løsning (figur 2b, 2d, 2f og 2 h).
Muligheden for anvendelse af metoden til et eksisterende kommercielle immunoassay blev evalueret. En forbedring blev udført på en glas-baserede allergen komponent microarray immunassay. Et sæt af 4 valideret og karakteriseret serum prøver fra allergiske patienter blev evalueret med microarray (prøver blev udpeget som a, b, c og d). Standard fluorometriske påvisning af denne analyse blev sammenlignet med farvning med anti-IgE mærket AuNPs efterfulgt af en forbedring af signal (figur 3). Før ekstraudstyr, blev ikke fundet nogen steder på microarrays hvor detektion blev udført med anti-IgE mærket AuNPs. Efter ekstraudstyr, flere steder blev synlig ved blotte øje og deres intensitet blev registreret af billede digitalisering (figur 3). Med fluorescens påvisning, en lang række steder blev opdaget (figur 3).
Figur 1 . Illustration af skridt, en microspot gennemgår fra analysanden opdagelse til forstærket signal. (en) to antistof-modificerede nanoprobes efter påvisning af en analysand immobiliseret på en microspot, (b) inkubation af microarray med ekstraudstyr protokol og efterfølgende frø-vækst af antistof-ændret nanoprobes og () c) microspot hvor størrelsen af nanoprobes øget efter inkubation 5 min med ekstraudstyr løsning. Dette tal har været dapted fra Dias mfl. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Digitaliseret billede af microarrays til påvisning af protein G. I venstre side af hver microarray er de observerede microspots forud for forbedring af påvisning udført med (en) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs og (g) IgG-SiNPs. På højre side af hver microarray er microspots efter forbedring af (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs og (h) IgG-SiNPs. Hver koncentration af protein G blev deponeret på microarray i tre eksemplarer. En beregning af antallet af protein G blev gjort baseret på koncentrationen af proteinet trykt i hver microspot. Dette tal er blevet tilpasset fra Dias mfl. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Korrelation mellem fluorescerende intensitet og kolorimetriske intensitet opnået for assays udført med kommercielle allergi diagnostiske assay. Betyde fluorescens intensitet (MFI) og mener kolorimetriske intensitet (MCI) målt til påvisning af allergener i prøver a, b, c og d. mellemværker er 10 omdannet logdata i intervaller hvor en lineær korrelation mellem begge metoder blev observeret. Intensiteten af microspots observeret til påvisning baseret på de fluorophore-ændret antistof (Fluorophore-Ab) er fluorescens emission. Lysstyrken på microspots observeret til påvisning baseret på Ab-AuNPs analysen blev opnået efter digitalisere microarray og vende billedet med imaging software. Microarrays er udformet har lodrette tre med positive kontroller til registrering af fluorescens i yderste højre bunden. De andre tre hjørner bruges til softwareevaluering. Billeder blev analyseret i 16-bit gråtoneskala. Dette tal er blevet tilpasset fra Dias mfl. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| R2 forudgående ekstraudstyr | R2 efter ekstraudstyr | |
| IgG-AuNPs | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| IgG-AgNPs | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| IgG-IONPs | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| IgG-SiNPs | - | 8.50E-01 |
Tabel 1. R2 værdier for påvisning af protein G, forudgående og efter ekstraudstyr, ved hjælp af forskellige sæt af nanopartikler. R2 værdier blev opnået efter korrelerede intensiteten af steder med koncentrationen af analyt målt.
Discussion
I øjeblikket, signal forbedring teknikker til assays med nanoprobe-baseret detektion er enten enzym-baserede12, kræver et andet sæt af nanopartikler til target detection nanoprobes21 eller, for så vidt angår farvning teknikker, er begrænset til Brug af AuNPs eller AgNPs som påvisning sonder. 22 her, en enkel, hurtig og enzym-fri metode er beskrevet for signal forstærkning af nanoprobe opdagelse-baseret assays. Med denne metode, det var muligt at øge kolorimetriske signalet leveres af 4 typer af nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs og SiNPs.
Den observerede forstærkning faktor for hvert sæt af nanoprobes var af 100, bortset fra SiNPs hvor kvantificering af ekstraudstyr faktor ikke var muligt skyldes manglende før ekstraudstyr signaler. Dette enhancement faktor antyder, at effektiviteten af protokollen er ens på tværs af alle typer af nanoprobes. Desuden, når enhancement protokol blev udført på et papir hvor en fortyndingsrække af stock AuNPs suspension blev trykt, blev det observeret en 10000-fold forstærkning faktor. Tidligere ekstraudstyr, de synlige steder med det laveste antal AuNPs var hvor ca 10000 nanopartikler blev trykt, efter enhancement steder husly mindre end 10 nanopartikler blev synlig. 20
Betingelserne for ekstraudstyr protokol her præsenteret har tilladt, at drage fordel af en reduktion af Au3 + til Au0 til signal forbedring, samtidig med at baggrundsstøjen til et minimum. Ekstraudstyret kan udføres lige efter analysen udføres såvel som på microarrays, der har været gemt for op til flere måneder efter analysen blev udført. Ekstraudstyr løsning består af en 1:1 blanding af løsning 1 og løsning 2. Begge løsninger kan tidligere blandet eller direkte blandet når pipetted på microarray. Forskellen mellem pre blanding eller direkte blanding påvirker kun holdbarheden af ekstraudstyr løsning. Når færdigblandede holdbarhed er 5-7 dage at stige til 30-45 dage hvis ikke pre blandet.
Yderligere analyse af resultaterne har vist, at metoden enhancement ikke forstyrrer den kvantitative analyse af biosensor. En lineær korrelation mellem intensiteten observeret og koncentrationen af analysanden blev opretholdt (tabel 1). Oplysninger indhentet for 4 præ karakteriseret kliniske prøver ved hjælp af glas-baserede allergen komponent microarray immunassay, med standard fluorescens påvisning og kolorimetrisk detektion, viste en god overensstemmelse mellem de to metoder til påvisning. Sammenligning af gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI) og den gennemsnitlige kolorimetriske intensitet (MCI), en gennemsnit R2 = 0,79 +/-0,08 blev opnået, når dataene er 10-logget på begge akser. Dette eksperiment viste, at metoden ekstraudstyr kan anvendes på en kommerciel kit, hvis det bruger nanoprobes til påvisning eller kan tilpasses til nanoprobe-baseret detektion.
Ekstraudstyr metode effektivitet er afhængig af to vigtige aspekter. Det er vigtigt at sikre, at blandingen af løsning 1 og løsning 2 er homogen. Uden en homogen blanding, vil sensoren være i kontakt med brøkdele af ekstraudstyr løsning hvor løsning 1 eller 2 er fremherskende i forhold til den anden. Det vil reducere effektiviteten af reduktion af Au3 + til Au0, dermed ødelægger effektiviteten af ekstraudstyret. Det er også vigtigt at have hele området af interesse af microarray kontakt med ekstraudstyr løsning under inkubationstiden.
For at opnå ultrasensitive forbedring af et signal, vil en længere Inkubationstiden (ca. 5 min.) med ekstraudstyr løsning være påkrævet. For at undgå udvikling af baggrundsstøj, der kan forstyrre signalet erhvervelse, bør microarray overfladen være tidligere blokeret (fx BSA, PIND) at forhindre hurtig uspecifik aflejring af Au0 og deraf følgende dannelsen af en guld lag.
En begrænsning til metoden ekstraudstyr er iboende effekten af analysen. Analysen kræver, at have negativ og positiv kontrol at sikre, at signalet enhancement overholdes kan tilskrives sand-positive resultater. Hvis der er en ikke-specifik interaktion af nanoprobes med mål, signaler erhvervet efter ekstraudstyr ikke vil være gyldig.
Andre forbedring teknikker er baseret på enten nanopartikel sammenlægning eller farvning af nanopartikler med et materiale, der giver forbedret signal erhvervelse. Ved at fremme indsamlingen af antallet af nanopartikler på webstedet påvisning, signal erhvervelse bliver muligt enten visuelt eller UV-Vis målinger. 5 disse signal forbedring teknikker stole på en to-trins detektionssystem, den første påvisning af analysand af interesse og et andet trin, hvor journalisten er forpligtet til at binde sig til den oprindelige registrering konstruktion. Sådanne strategier mangler universalitet på grund af kravet om specifikke enhancement protokol optimering for hver type af assay.
Farvning forbedring teknikker, såsom sølvfarvning, meget ligesom protokollen her præsenteret, tillader en direkte forbedring af signal detection konstruktioner. I modsætning til den protokol, der er vist her, har sølv farvning imidlertid kun været vist skal anvendes til enten AuNPs eller AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
Anvendeligheden af denne metode kunne sandsynligvis span nogen assay, der bruger AuNPs, AgNPs, IONPs eller SiNPs som registrering agenter. Yderligere arbejde udføres til at undersøge anvendelsen af metoden i sensorer bestående af andre materialer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013)-ERC Grant aftale nr. 615458, det svenske Forskningsråd og Pronova excellence center for protein teknologi (VINNOVA - svensk Statslige agentur for Innovation Systems) anerkendes taknemmeligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
