In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Signal-Verbesserung der Nanoprobe-basierte Biosensoren vorgestellt. Das Protokoll basiert auf die Reduzierung der Chlorogoldsäure auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden, die aus Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln bestehen.
Die Verwendung von Nanosonden wie Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid Nanopartikeln als Nachweisreagenzen in bioanalytischen Assays können hohe Empfindlichkeit und bequeme farbmetrischen auslesen. Jedoch sind hohe Dichten von Nanopartikeln in der Regel für die Erkennung benötigt. Die verfügbaren Synthese-basierten Verbesserung Protokolle sind entweder beschränkt sich auf gold und Silber-Nanopartikel oder verlassen Sie sich auf präzise enzymatische Steuerung und Optimierung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das farbmetrische Auslesen von Gold, Silber, Kieselsäure und Eisenoxid Nanosonden zu verbessern. Es wurde beobachtet, dass die farbmetrische Signal von bis zu einem 10000-fold Faktor verbessert werden kann. Die Grundlage für solche Signal-Verbesserung-Strategien ist die chemische Reduktion von Au3 + Au0. Es gibt mehrere chemische Reaktionen, die es die Reduzierung der Au3 + Au0 ermöglichen. Im Protokoll gut Puffer und H2O2 dienen und es ist möglich, die Ablagerung von Au0 auf die Oberfläche des vorhandenen Nanosonden in Nachteil der Bildung von neuen gold-Nanopartikeln zu bevorzugen. Das Protokoll besteht aus der Inkubation der Microarray mit einer Lösung bestehend aus Chlorogoldsäure und H2O2 in 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure pH 6 Puffer nach der Nanoprobe-basierte Erkennung-Assay. Die Verbesserung Lösung kann auf Papier und Glas-basierten Sensoren angewendet werden. Darüber hinaus kann in kommerziell erhältlichen Immunoassays verwendet werden, wie durch die Anwendung der Methode auf einen kommerziellen Allergen Microarray gezeigt. Die Signal-Entwicklung erfordert weniger als 5 min Inkubation mit Verbesserung Lösung und das Auslesen von bloßem Auge oder Low-End-Bild Erwerb Geräte wie eine Tischplatte Scanner oder eine Digitalkamera beurteilt werden kann.
Die Verwendung von Nanomaterialien wie gold-Nanopartikeln (AuNPs) oder Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) hat die Anwendungen in Biosensoren mit verbesserte Empfindlichkeit und Vielseitigkeit erlaubt. 1 die Fülle der Methoden für die Dekoration der Oberfläche von Nanopartikeln mit verschiedenen Liganden, ihre hohe Fläche zum Volumenverhältnis, nutzen haben das Design der Sensoren mit verbesserter Empfindlichkeit ermöglicht. 2 doch ist ein Biosensoren Werkzeug hängt von der Anzahl der Nanosonden erforderlich um ein nachweisbares Signal zu erzielen. Z. B. bei 40 nm AuNPs ein Signal durch UV-Vis-Spektroskopie, ca. 90 × 106 Nanosonden zu erwerben ist erforderlich, um effektiv das Ziel von Interesse zu erkennen. 3 diese Nanoprobe Dichte Einschränkung kann durch den Einsatz von Signalverstärkung umgangen werden. Solche Strategien4 können anhand Oberflächenkräfte Aggregation oder Agglomeration, wo die Dichte der ersten Nanosonden erhöht wird, durch die Anhäufung einer zweiten Reihe von Nanosonden auf den ersten. 5 die Zahl der Nanopartikel an einer bestimmten Position auf einer Sensorfläche ermöglicht, Seh- oder UV-Vis-Signalerfassung. Die Empfindlichkeit des Tests wird jedoch von Natur aus mit targeting Kapazität des zweiten Satzes von Nanopartikeln in Richtung der Anfangssatz von Nanosonden verknüpft werden. Andere Strategien verlassen sich auf die Färbung der entweder gold und Silber Nanosonden. 6 , 7 die Färbung entsteht durch den Abbau von Silber-Ionen auf die Oberfläche der Nanopartikel, ermöglicht eine visuelle oder UV-Vis-Erkennung. 8 diese Methoden verbessern das Signal des bestehenden gold oder silberne Nanosonden von potenzierende Oberfläche Resonanz Plasmon-signal, nicht abhängig von sekundären targeting Ereignissen wie Oberflächenkräfte Agglomeration Methoden. Silberne Färbung Methoden sind jedoch nur mit Verwendung von gold oder Silber Nanosonden berichtet worden. 8 , 9
Im Jahr 2005 Zayats Et Al. 10 berichtet die Reduzierung der Au-Ionen auf die Oberfläche des gold Nanosonden um Oberflächen Plasmon Resonanzsignal zu erhöhen. In diesem Enzym-abhängige Arbeit wurde Wasserstoffperoxid durch Glukose-Oxidase-Katalyse und zusammen mit Cetyltrimethylammonium-Chlorid erlaubt die Reduzierung der Chlorogoldsäure generiert.
Vor kurzem Wang Et Al. eine Erweiterungsmethode wo eine Goldschicht entsteht berichtet auf der Oberfläche des bestehenden Nanosonden. 11 diese erweiterten Nanosonden angezeigt Peroxidase-ähnliche katalytische Aktivität gegen das Substrat 3′, 5, 5 ‘-Tetramethylbenzidine (TMB) ermöglicht die Visualisierung von eine leuchtend blaue Farbe mit bloßem Auge.
Stevens Et al. die Entwicklung eines plasmonische ELISA basierende Assays berichtet. 12 nach der Erkennung von einer Prostata-spezifischen Antigens (PSA) durch eine traditionelle ELISA-Strategie, wurde ein sekundärer Antikörper mit Katalase beschriftet mit dem Sensor nach dem der Sensor war eingebettet in eine Lösung mit Wasserstoffperoxid inkubiert und Chlorogoldsäure. Das Vorhandensein von der Katalase-modifizierte Sekundärantikörper (positives Ergebnis) würde die Förderung des Verbrauchs von Wasserstoffperoxid, Verlangsamung Chloroauric Säure Reduktion und nachgiebig quasi-sphärische Prozess AuNPs mit einer roten Farbe. Das Fehlen der Katalase-modifizierte Antikörper (negativ) erlaubt die Wasserstoffperoxid-Konzentration zu bleiben intakt, fördert damit die rasche Chloroauric Reduktion und nachgiebig AuNPs mit unklaren Morphologien verantwortlich für eine blau/lila Farbe . Die Konzentration von Wasserstoffperoxid, bestimmt durch die Aktivität der Katalase, wurde gezeigt, um die Konzentration des Analyten von Interesse korreliert werden. Die Notwendigkeit einer Katalase-modifizierte Sekundärantikörper und die Kontrolle über die Bedingungen der katalytischen Aktivität sind zwei Faktoren, die die Universalität dieser Methode zu behindern. Darüber hinaus kann die Bildung von Goldclustern, unabhängig von den bestehenden AuNPs Hintergrund Lärmprobleme Verstärkung Strategie vorstellen.
Die oben genannten Techniken, wie auch mehrere andere13,14,15, haben es möglich gemacht für Nanoprobe-basierte Biosensoren, Nachweisgrenzen auf Augenhöhe mit traditionellen Techniken zu erreichen.
Hier eine neuartige gold Erweiterungsmethode gezeigt hat, wo das Signal von einer vorhandenen Nanoprobe wird durch potenzierende oder Einführung ein Surface Plasmon-Resonanz-Signal verstärkt. Nach der Erkennung mit dem Einsatz von Gold, Silber, Silizium oder Eisenoxid-Nanopartikeln erfolgt, darf der Sensor mit einer Lösung aus einer Mischung von Wasserstoffperoxid und Chlorogoldsäure in 2-(N-Morpholino) inkubieren Ethanesulfonic Säure (MES) pH 6-Puffer. Die Konzentrationen der Komponenten in die Verbesserung Lösung wurden optimiert, um die Ablagerung von Au0 auf der Oberfläche des bestehenden Nanosonden begünstigen. Für alle untersuchten Nanoprobe Arten, dh. AuNPs, silberne-Nanopartikeln (AgNPs), Silica-Nanopartikel (SiNPs) und IONPs, die Bildung einer vagen Schicht ergab oder ergänzt die Streuung von Licht nachweisbar oder erhöhte sichtbares Zeichen geführt. Eine Erhöhung der Signal mit einem 100-fold Verstärkungsfaktor für Nanosonden in Papier und Glas-basierten Microarrays erreicht wurde und der Vorgang dauert weniger als 5 min, ein Signal zu erwerben. Die Signalerfassung getan werden könnte, mit bloßem Auge, UV-Vis Spektroskopie oder Low-End-Tools wie z. B. eine Digitalkamera oder einen Scanner Tischplatte imaging. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Erweiterung Protokoll ohne weiteres in einem handelsüblichen Allergie-Diagnostik-Assay angewendet werden kann, ohne gezielte Optimierung.
Derzeit Signal Verbesserung Techniken für Assays mit Nanoprobe-basierte Erkennung sind entweder Enzymbasis12, erfordern eine zweite Reihe von Nanopartikeln auf die Erkennung Nanosonden21 oder, im Falle der Färbetechniken, sind beschränkt auf die Verwendung von AuNPs oder AgNPs als Erkennung Sonden. 22 , wird hier eine einfache, schnelle und Enzym-freie Methode für Signal-Verbesserung der Nanoprobe Erkennung basierende Assays bezeichnet. Mit dieser Methode war es möglich, das farbmetrische Signal von 4 Arten von Nanosonden zu erweitern: AuNPs, AgNPs, IONPs und SiNPs.
Die beobachteten Verstärkungsfaktor für jeden Satz von Nanosonden war 100fach, mit Ausnahme der SiNPs wo Quantifizierung des Faktors Erweiterung nicht möglich, da Mangel an Pre-Erweiterung Signale war. Diese Verstärkung Faktor legt nahe, dass die Effizienz des Protokolls über alle Arten von Nanosonden ähnlich ist. Wenn die Erweiterung Protokoll auf einem Papierträger durchgeführt wurde wo eine Verdünnungsreihe einer Aktie AuNPs Suspension gedruckt wurde, wurde darüber hinaus ein 10000-fold Verstärkungsfaktor beobachtet. Vorherigen zur Verbesserung, die sichtbaren Flecken mit der niedrigsten Anzahl von AuNPs wurden, wo etwa 10000 Nanopartikel gedruckt wurden, wurde nach Verbesserung die Plätze beherbergen weniger als 10 Nanopartikel sichtbar. 20
Die Bedingungen für die Erweiterung Protokoll hier vorgestellt haben erlaubt, unter Ausnutzung der Verringerung der Au3 + Au0 für das Signal verbessern und gleichzeitig die Geräuschkulisse auf ein Minimum. Die Verstärkung kann durchgeführt werden, gleich nachdem der Test durchgeführt wird, sowie auf Microarrays, die für gespeichert wurden, bis zu mehrere Monate nach der Test durchgeführt wurde. Die Verbesserung Lösung besteht aus einer 1:1 Mischung der Lösung 1 und Lösung 2. Beide Lösungen können zuvor gemischt oder direkt gemischt, wenn auf die Microarray pipettiert werden. Der Unterschied zwischen Vormischen oder direkte Vermischung betrifft nur die Haltbarkeit der Verbesserung Lösung. Bei vorgemischten die Haltbarkeit von 5-7 Tagen Erhöhung auf 30-45 Tage, wenn nicht vorgemischt.
Weitere Analysen der Ergebnisse hat gezeigt, dass die Quantitative Analyse der Biosensor der Erweiterungsmethode nicht stört. Eine lineare Korrelation zwischen der Intensität beobachtet und die Konzentration des Analyten konnte gehalten werden (Tabelle 1). Die Daten für 4 Pre charakterisierten klinischen Proben mit der Glas-basiert Allergen Komponente Microarray Immunoassay mit standard Fluoreszenz-Detektion und farbmetrische Erkennung, zeigte eine gute Übereinstimmung zwischen zwei Nachweismethoden. Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) und die mittlere farbmetrischen Intensität (MCI), eine durchschnittliche R2 = 0,79 + 0,08 / wurde erreicht, wenn die Daten auf beiden Achsen 10 angemeldet. Dieses Experiment hat gezeigt, dass der Erweiterungsmethode zu einem kommerziellen Kit angewendet werden kann, wenn es die Nanosonden zur Erkennung nutzt oder für Nanoprobe-basierte Erkennung angepasst werden kann.
Die Erweiterung Methode Wirksamkeit stützt sich auf zwei wichtige Aspekte. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Mischung der Lösung 1 und Lösung 2 ist homogen. Ohne eine homogene Mischung wird der Sensor, in Kontakt mit Bruchteilen von Verbesserung Lösung wo ist Lösung 1 oder 2 vorherrschende relativ zu den anderen. Das verringert die Leistung der Verringerung der Au3 + Au0, damit eine Beschädigung der Effizienz der Erweiterung. Es ist auch wichtig, das gesamte Gebiet des Interesses der Microarray in Kontakt mit der Verbesserung Lösung während der Inkubationszeit zu haben.
Um Gromer Verstärkung eines Signals zu erreichen, wird eine längere Inkubationszeit (ca. 5 min) mit der Verbesserung Lösung erforderlich sein. Um die Entwicklung von Hintergrundgeräuschen zu vermeiden, die die Signalerfassung stören können, sollte die Microarray Oberfläche zuvor blockierte (z.B. BSA, PEG), schnelle unspezifische Ablagerung von Au0 und daraus resultierende Bildung von Gold zu verhindern Schicht.
Eine Einschränkung der Erweiterungsmethode ist die innere Wirksamkeit des Assays. Der Test erfordert mit negativen und positiven Kontrollen sicherzustellen, dass die Signal-Verbesserung beobachtet wahr-Positive Ergebnisse zugeordnet werden kann. Wenn es eine unspezifische Interaktion von der Nanosonden mit dem Ziel, erworben Signale nach der Erweiterung nicht gültig werden.
Weitere Verbesserung Techniken sind basierend auf entweder Nanopartikel Aggregation oder Färbung der Nanopartikel mit einem Material, das verbesserte Signalerfassung ermöglicht. Durch die Förderung der Versammlung der Anzahl von Nanopartikeln bei der Erkennung, der Signalerfassung werden entweder visuell oder UV-Vis-Messungen. 5 diese Signal-Verbesserung-Techniken beruhen auf ein zweistufiges Detection System, der ersten Erkennung des Analyten von Interesse und in einem zweiten Schritt, wo die Reporter erforderlich ist, um an der ersten Erkennung Konstrukt zu binden. Solche Strategien fehlen Universalität aufgrund des spezifischen Erweiterung Protokoll Optimierung für jede Art von Test.
Die Färbung Verbesserung Techniken wie Silber-Färbung, viel wie das Protokoll hier dargestellt, ermöglichen die direkte Verbesserung des Signal-Erkennung-Konstrukte. Jedoch anders als das Protokoll, das hier gezeigt wird, silberne Färbung nur nachweislich auf AuNPs oder AgNPs angewendet werden. 6 , 7 , 8 , 9
Die Anwendbarkeit dieser Methode könnte wahrscheinlich jeder Assay erstrecken, die AuNPs, AgNPs, IONPs oder SiNPs als Erkennung Agenten verwendet. Weitere Arbeit wird durchgeführt, um die Anwendung der Methode in Sensoren bestehend aus anderen Materialien zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat unter dem siebten Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC-Grant Agreement Nr. 615458, der schwedischen Forschungsrat und Pronova Excellence center für Proteintechnologie (VINNOVA – Schwedisch Staatliche Agentur für Innovationssysteme) ist dankbar anerkannt.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |