Summary
בעבודה זו, מוצג עבור שיפור האות של biosensing nanoprobe מבוססי פרוטוקול. הפרוטוקול מבוסס על ההפחתה של חומצה chloroauric על פני nanoprobes הקיים המורכבים של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל.
Abstract
השימוש nanoprobes כגון זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל כמו ריאגנטים זיהוי במבחני וביו-אנליטיות וואלידציה יכול לאפשר רגישות גבוהה ולא נוחה readout ערכי צבע מוחלטים. עם זאת, צפיפות גבוהה של חלקיקים נדרשים בדרך כלל עבור זיהוי. הפרוטוקולים זמינים שיפור מבוסס-סינתזה או חלקיקים מוגבל של כסף וזהב, או להסתמך על שליטה מדויקת אנזימטי ואופטימיזציה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את המדידה ערכי צבע מוחלטים של זהב, כסף, סיליקה, תחמוצת ברזל nanoprobes. זה היה ציין כי האות ערכי צבע מוחלטים יכולים להשתפר על ידי עד גורם 10000-fold. הבסיס לאסטרטגיה שיפור כזה האות הוא צמצום הכימי Au3 + Au0. ישנם מספר תגובות כימיות המאפשרים צמצום Au3 + Au0. בפרוטוקול, יכולות buffers ו- H2O2 משמשים ויש אפשרות להעדיף בתצהיר של Au0 על פני nanoprobes הקיימים, ב לרעת של היווצרות של חלקיקי זהב חדש. הפרוטוקול מורכב הדגירה של microarray פתרון בהיקף של חומצה chloroauric ו- H2O2 ב 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה pH 6 מאגר בעקבות וזמינותו זיהוי מבוסס nanoprobe. ניתן להחיל את הפתרון שיפור נייר וחיישנים מבוססי זכוכית. יתר על כן, זה יכול לשמש immunoassays זמינים מסחרית כפי שמתואר על-ידי היישום של השיטה כדי microarray אלרגן המסחרי. התפתחות האות דורש פחות מ 5 דקות של דגירה עם הפתרון שיפור, המדידה יכול להיות מוערך על ידי בעין או התקנים רכישת התמונה זולים כמו סורק שולחני או מצלמה דיגיטלית.
Introduction
השימוש של ננו-חומרים, כמו חלקיקי זהב (AuNPs) או חלקיקי תחמוצת ברזל (IONPs) אפשרה את היישומים ב- biosensing עם רגישות משופרים ורב-תכליתיות. 1 שפע של שיטות שפותחו עבור הקישוט של פני השטח של חלקיקים עם ליגנדים שונים, כדי לנצל את פני השטח גבוהה שלהם יחס נפח, אפשרו את העיצוב של חיישנים עם רגישות משופרת. 2 . עם זאת, כלי biosensing הוא תלוי מספר nanoprobes הדרוש להשגת אות לזיהוי. לדוגמה, במקרה של 40 ננומטר AuNPs, לרכוש אות באמצעות UV-vis ספקטרוסקופיה, כ nanoprobes6 × 10 90 נדרש כדי לזהות ביעילות ביעד של ריבית. 3 מגבלה זו צפיפות nanoprobe יכול שיפרו באמצעות הגברה של האות. אסטרטגיות כאלה4 יכול להתבסס על צבירת interparticle או הצטברות, שבו הצפיפות של nanoprobes הראשונית מתגברת על ידי צבירת קבוצה שנייה של nanoprobes השני. 5 הגדלת מספר חלקיקים במיקום נתון על משטח החיישן מאפשר חזותי או UV מול האות רכישה. עם זאת, הרגישות של וזמינותו תקושר מטבעו בהתאם לקיבולת מיקוד של הסט השני של חלקיקים כלפי הקבוצה הראשונית של nanoprobes. אסטרטגיות אחרות להסתמך על ההכתמה של nanoprobes או זהב וכסף. 6 , 7 ההכתמה מושגת באמצעות הפחתה בצריכת יוני כסף על גבי המשטח של חלקיקים, הפעלת של visual או לזיהוי UV-vis. 8 בשיטות אלה להגביר את האות של הקיים זהב או כסף nanoprobes על ידי potentiating פלזמון תהודה משטח את האות, לא בהתאם משני אירועים מיקוד כמו הצטברות interparticle שיטות. עם זאת, שיטות מכתימים כסף רק דווחו עם השימוש nanoprobes זהב או כסף. 8 , 9
בשנת 2005, Zayats et al. 10 דיווח ההפחתה של Au יונים על פני nanoprobes זהב כדי להגביר את האות תהודה פלזמון משטח. בעבודה זו תלויי-אנזים, מימן על-חמצני נוצר על ידי גלוקוז אוקסידאז זרז, יחד עם cetyltrimethylammonium כלוריד מותר ההפחתה של חומצה chloroauric.
לאחרונה וואנג ואח. דיווח על שיטת שיפור שבו נוצרת שכבת זהב על פני השטח של nanoprobes הקיים. 11 nanoprobes מוגדלת אלה מוצגים peroxidase כמו פעילות קטליטית נגד המצע 3′, 5, יונקות-tetramethylbenzidine (שוייץ) המאפשר את החזיית צבע כחול בהיר בעין בלתי מזוינת.
סטיבנס. et al. דיווח על התפתחות plasmonic assay מבוסס-אליסה. 12 לאחר זיהוי אנטיגן ספציפי הערמונית (PSA) באמצעות אסטרטגיה אליסה המסורתית, נוגדנים משניים המסומנת קטלאז, נדגרה בעזרת חיישן אחרי אשר החיישן היה שקוע פתרון המכיל מימן על-חמצני, חומצה chloroauric. הנוכחות של משני קטלאז-לאחרונה הנוגדן (תוצאה חיובית) תקדם את צריכת חמצן, מאט הפחתת חומצה chloroauric, מניב מעין כדורית monodispersed AuNPs עם צבע אדום. העדר של הנוגדן קטלאז-לאחרונה (תוצאה שלילית) אפשרה את ריכוז חמצן ללא פגע, ובכך לקדם את ההפחתה chloroauric מהירה, מניב AuNPs עם האחראי על צבע כחול/סגול ברורות וההקשר מורפולוגיות . ריכוז חמצן, נקבע על ידי פעילות קטלאז, הוצגה בקורלציה לריכוז analyte עניין. הצורך של נוגדנים משניים קטלאז-לאחרונה, השליטה של התנאים של פעילות קטליטית הם שני הגורמים המעכבים את האוניברסליות של שיטה זו. יתר על כן, היווצרות של אשכולות זהב, באופן עצמאי AuNPs קיימים, עשויים להציג נושאים רקע רעש את האסטרטגיה הגברה.
הטכניקות הנ ל, כמו גם כמה אחרים13,14,15, שהפכו עבור ביולוגיים מבוססי nanoprobe להשיג את הגבולות של זיהוי שוה עם טכניקות מסורתיות.
כאן, שיטה שיפור זהב הרומן הוא הפגין, איפה האות של nanoprobe הקיים מוגבר על-ידי שמגדיל יכולתו או היכרות עם אות תהודה פלזמון משטח. לאחר הזיהוי מתבצעת עם השימוש של זהב, כסף, סיליקה או חלקיקי תחמוצת ברזל, החיישן מותר דגירה עם פתרון של תערובת של מימן על-חמצני וחומצה chloroauric ב 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic (MES) חומצה pH 6 מאגר. הריכוזים של הרכיבים השונים הפתרון שיפור אופטימציה לטובת בתצהיר של Au0 על פני השטח של nanoprobes הקיים. עבור כל למד nanoprobe סוגי, כלומר. AuNPs, סילבר חלקיקים (AgNPs), חלקיקי סיליקה (SiNPs), IONPs, היווצרות רובד ברורות וההקשר הניב או augmented הפיזור של האור אשר הביא אות גלוי לזיהוי או מוגבר. עלייה אות עם גורם הגברה 100-fold הושג nanoprobes נייר, זכוכית מבוסס מיקרו-מערכים, התהליך לוקח פחות מ 5 דקות כדי לרכוש אות. רכישת אות יכול להיעשות על ידי בעין בלתי מזוינת, UV-vis ספקטרוסקופיה או הדמיה כלים זולים כגון מצלמה דיגיטלית או סורק שולחני. יתר על כן, הוכח כי פרוטוקול שיפור זה ניתן בקלות ליישם assay אבחון אלרגיה זמינים מסחרית ללא צורך אופטימיזציה ספציפיים.
Protocol
הדוגמאות סרום האנושי התקבלו בהתאם לדרישות המשפטית והאתית של המדינה של אוסף, כלומר. עם האישור של ועדת האתיקה (או דומה) ועם הסכמה בכתב של התורם.
1. שיפור הפתרון הכנה:
- להכין מאגר ה-pH 6 MES 10 מ מ על ידי השעיית MES נתרן מלח במים יונים. להתאים את ה-pH 6 באמצעות פתרון NaOH 4 M.
- להכין 5 מ מ HAuCl פתרון4 10 מ מ- MES-pH 6-מאגר (פתרון 1).
- להכין פתרון2 O של21.027 M H ב- 10 מ מ- MES-pH 6-מאגר (פתרון 2).
הערה: אמצעי האחסון של פתרון 1 וגם פתרון 2 תלוי המספר והגודל של מיקרו-מערכים כדי להיות משופרת. לדוגמה, microarray של 10 x 10 מ מ דורש 100 μL הנפח הכולל (פתרון 1 + פתרון 2) כדי להבטיח האזור microarray בקשר עם הפתרון שיפור. לאחר דילול,2O H2 אמור לשמש בתוך כ- 30-45 ימים.
2. חלקיקים הכנה:
- להכין 40 ננומטר AuNPs כפי שתואר על ידי Bastús et al. 16 . בקצרה, להזריק 1 מ"ל של 25 מ מ מימית HAuCl4 קודמן לתוך פתרון רותחים של 2.2 מ"מ סודיום ציטרט (149 מ"ל). המתן עד צבע יין אדום נצפית. להשתמש פתרון זה של חלקיקים כמקורות עבור שלבי הצמיחה זרע.
- ב 90 מעלות צלזיוס, להזריק 1 מ"ל של 60 מ מ סודיום ציטרט ואחריו 1 מ"ל של 25 מ מ HAuCl4 לתוך הזרע המכיל פתרון. לאחר 30 דקות, התגובה היא מלאה. חזור על השלב זרע-צמיחה חמש פעמים עד 40 ננומטר חלקיקים מתקבלים, כפי שתואר על ידי Bastús et al. 16
- למדוד את ספיגת UV-vis של הפתרון הסופי של חלקיקים לקביעת הגודל של חלקיקים. 17 . לחלופין, שידור אלקטרון micrographs (TEM) יכול להיות רכשה, המשמשת לקביעת הגודל של חלקיקים.
- להכין 90 ננומטר AgNPs כפי שתואר על ידי ריברו ואח. 18 . בקצרה, להוסיף dimethylaminoborane (DMAB) פתרון נמרצות מנוער של פולי (חומצה אקרילית, מלח נתרן) (במספר דוכנים) ו- AgNO3. הנפח הסופי של הפתרון הוא 50 מ ל, הריכוז הסופי של DMAB, במספר דוכנים, AgNO3 1.6 מ מ, 10 מ מ, מ מ 3.33, בהתאמה.
הערה: 100 ננומטר IONPs ששינה עם קבוצות carboxyl ו- 50 ננומטר SiNPs ששינה עם קבוצות carboxyl נרכשו. - Functionalize את AuNPs עם נוגדנים בעקבות פרוטוקול שתואר על ידי Puertas et al. 19 . בקצרה, להוסיף 1 מ ג של COOH-פג-SH (5000 g·mol− 1) פתרון של 1.2x10-9 מ' AuNPs (10 צפיפות אופטית, יתר). להתאים את ה-pH ל-12 עם פתרון של 4 M NaOH.
- לתת את הפתרון דגירה בן לילה, בטמפרטורת החדר (~ 22 מעלות צלזיוס), בתנאים מלהיב מתון.
- להסיר את עודף של פג על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב g x 13800 למשך 15 דקות.
- Resuspend בגדר עם 500 μL של מים יונים.
- דגירה של AuNPs פג-השתנה עם 5 μmol של N-(3-Dimethylaminopropyl) N'-ethylcarbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ו- 7.5 μmol של מלח נתרן N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) ב- pH MES 10 מ מ 6 מאגר למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להסיר את עודף של EDC, sulfo-NHS על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב g x 13800 במשך 5 דקות.
- Resuspend בגדר ב 500 µL 10 מ מ MES pH 6 המאגר ולהוסיף g·mL 100-1 של נוגדן. לתת את הפתרון תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להסיר את עודף של נוגדנים על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב 13800 g x 10 דקות פעמיים, resuspend בגדר ב 500 μL של 10 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 0.3 M NaCl מאגר. לתת את הפתרון תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להסיר את הנוגדן מאוגד לא ספציפי על ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב 13800 g x 10 דקות פעמיים, resuspend בגדר ב 500 μL של 1% אלבומין שור (BSA) במאגר ה-pH 6 MES 10 מ מ. דגירה בדגימות ב 4 ° C בלילה.
- לשטוף את העודפים של BSA על-ידי צריך שתוציאו את הפתרון ב 13800 g x 10 דקות פעמיים ולאחר resuspending בגדר ב 500 μL מאגר ה-pH 6 MES 10 מ מ.
- בצע את השלבים 2.5.1 דרך 2.5.9 עבור השינוי של 5 מ' AgNPs, 0.5 מ ג של IONPS ו 0.5 מ ג של SiNPs עם נוגדן, התאמת הכמויות של EDC, sulfo-NHS בהתאם.
3. אנכי לזרום מבחני המבוסס על נייר:
- הכן את מיקרו-מערכים באמצעות הפקדת ריכוז הדרגתי של חלבון G על קרום נייר ניטרוצלולוזה עם מדפסת רובוטית. לאחר ההדפסה, תן מיקרו-מערכים הלילה יבש בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C).
- לבצע וזמינותו זרימה אנכית עם הקרום בסוגריים בעל מסנן. זורמים פתרון 8 מ' של IgG-השתנה AuNPs באמצעות משאבת אולטרה-מזרק בקצב של mL·min 1− 1. חזור על שלב זה עם פתרון של AgNPs מ' אג-לאחרונה 17, mg·mL 0.1− 1 IgG-השתנה SiNPs ו- 0.1 mg·mL− 1 IONPs IgG-השתנה.
- תן את מיקרו-מערכים יבש בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C) במשך 30 דקות וסרוק אותם סורק סטילס ברזולוציה של 4800 dpi. לשמור את התמונות כקובצי TIFF 24-bit צבע.
4. מבחני המבוסס על זכוכית מסחרי הפניה:
- דגירה שתי שקופיות זכוכית עבור 120 דקות לצורך זיהוי מרכיבי לאלרגן עם 4 דגימות בנסיוב אדם שונים בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף את מיקרו-מערכים עם מים יונים.
- Incubate שקופית אחת עם הנוגדן IgE נגד מצומדת פלורסנט בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C) במשך 30 דקות Incubate השקופית השניה עם האנטי-האדם IgE נוגדנים-ששינה AuNPs למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף את מיקרו-מערכים עם מים יונים.
- למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית microarray זה, נדגרה עם הנוגדן IgE נגד פלורסנט עם לייזר סורק המנגנון. Digitalize microarray זה נדגרה עם האנטי-האדם IgE נוגדנים-השתנה AuNPs עם סורק שולחני עבור רכישת אות ערכי צבע מוחלטים.
- לאחר דיגיטיזציה, דגירה של microarray עם הפתרון שיפור בטמפרטורת החדר (~ 22° C) במשך 5 דקות.
- לשטוף את החיישן במים יונים ולאפשר לו להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (~ 22 ° C).
- Digitalize את microarray עם סורק שולחני ברזולוציה 4800 dpi עבור רכישת אות ערכי צבע מוחלטים. שמור התמונות בגווני אפור 16 סיביות קובצי TIFF.
5. Microarray הדגירה עם שיפור פתרון:
- מראש לערבב את אותה כמות של פתרון 1 ו- 2 פתרון או לערבב אותם ישירות על המשטח של החיישן ולהבטיח כי האזור של ריבית על microarray מכוסה התערובת של פתרון.
- תן החיישן דגירה בטמפרטורת החדר עם הפתרון שיפור עבור עד כדי 5 דק יותר זמן דגירה זמן יכולות להניב משופרת ברגישויות, כמו גם יחס אות/רעש גבוה יותר, במיוחד עבור מיקרו-מערכים המבוסס על נייר.
- לשטוף את microarray מאת השוקע זה במים יונים פעם אחת למשך 5 ס. תשאיר את זה לייבוש בטמפרטורת החדר.
הערה: הזמן של השלב הייבוש תלוי החומר microarray. עבור microarray המבוסס על נייר, הצעד ייבוש דורש כ 30 דקות. עבור microarray המבוסס על זכוכית, הצעד ייבוש דורש כ 5-10 דקות.
6. הדמיה ניתוח:
- לנתח את עוצמות קרינה פלואורסצנטית עם כלי תוכנה. שקול כל התוצאות שווה או גדול מ- 0.3 החבוט Standardize יחידות (ISU), הנחיות השימוש (DfU) של היצרן חיישן.
- לנתח את עוצמות ערכי צבע מוחלטים באמצעות כלי תוכנה. הפוך את קובצי התמונה, למדוד את עוצמת בכל מקום, לחשב את עוצמת פיקסל מרושע. השתמש את הערכים של המקומות triplicate כדי לחשב את הערך הסופי אות כמו ממוצע של שלוש עוצמות פיקסל ספוט מרושע.
Representative Results
לאחר assay מתבצעת, באמצעות nanoprobes כסוכני זיהוי, עשוי להיות מאוכלס האזור זיהוי חיישן עם nanoprobes (איור 1). אם המספר של nanoprobes מתחת למגבלה עבור זיהוי חזותי, זיהוי analyte, בתחילה, ייחשב השלילי. באמצעות פרוטוקול המובאת כאן (איור 1b), האות של nanoprobes זה potentiated על ידי החדרת רובד ברורות וההקשר של Au (איור 1c).
המבוסס על נייר מתכלה המיועדים זיהוי של חלבון G בוצע כדי להציג לראווה את האפקטיביות של פרוטוקול שיפור (איור 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs ו IONPs היו ששינה עם נוגדנים IgG ו המשמש לאיתור סוכנים. מיקרו-מערכים נייר הוכנו וכן הדרגתי של מספר מולקולות חלבון G לכל מקום.
לאחר assay הוצאה לפועל, זה היה ציין כי IgG AuNPs שונה (IgG-AuNPs) היו מסוגלים לזהות יהיה נמוך ככל 2 מולקולות5 × 10 לכל נקודה (איור 2), IgG AgNPs שונה (IgG-AgNPs) היו מסוגלים לזהות יהיה נמוך ככל × 10 24 מולקולות לכל נקודה (איור 2c), IgG שונה IONPs (IgG-IONPs) היו מסוגלים לזהות נמוך ככל 2 מולקולות7 × 10 לכל נקודה (איור 2e) ולשנות IgG SiNPs (IgG-SiNPs) לא היו מסוגלים לספק אות חזותי ( איור 2g).
מאת המקננת על מיקרו-מערכים עם הפתרון שיפור, ניתן היה להגדיל את האות על ידי 100-fold בין כל סוגי חלקיקים בשימוש. במקרה של SiNPs, הפתרון שיפור שאפשר להתבונן אות שבו אין אות חזותי נצפתה ללא הפתרון שיפור (איור 22f 2d, b, ו- 2 h).
האפשרות של היישום של השיטה מתכלה המסחרי הקיים הוערך. השיפור בוצע בראגנטים microarray רכיב אלרגן המבוסס על זכוכית. סט של 4 לאמת, מאופיין סרום דגימות מחולים אלרגית הוערכו עם microarray (דוגמאות נקבעו כ- a, b, c ו- d). זיהוי fluorometric רגיל assay הזה נמשל מכתים עם אנטי-IgE הנקרא AuNPs ואחריו השיפור של האות (איור 3). לפני שיפור, אין כתמים אותרו על מיקרו-מערכים היכן הגילוי בוצע עם אנטי-IgE הנקרא AuNPs. לאחר שיפור, מספר נקודות היו גלויים בעין בלתי מזוינת, מטענו נרשמה על ידי תמונה דיגיטיזציה (איור 3). עם זיהוי פלורסצנטיות, מגוון רחב של מקומות היו זוהה (איור 3).
איור 1 . איור של השלבים microspot עובר מהגילוי analyte לאות משופרת. nanoprobes () שני נוגדנים-השתנה לאחר זיהוי analyte ותשמרו על microspot, (b) דגירה של microarray עם פרוטוקול שיפור וצמיחה עוקבות זרע-של נוגדן-השתנה nanoprobes ( microspot c) איפה גדל לגודל nanoprobes לאחר המקננת 5 דקות עם הפתרון שיפור. איור זה כבר dapted של דיאס ואח. 20 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . תמונה מורכבת של מיקרו-מערכים איתור של חלבון G. בצד השמאל של כל microarray הן microspots נצפתה לפני שיפור של זיהוי מתבצעת עם () IgG-AuNPs, (ג) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs, (g) IgG-SiNPs. בצד ימין של כל microarray הן microspots לאחר שיפור של (b) IgG-AuNPs, (ד) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs, (h) IgG-SiNPs. כל הריכוז של חלבון G היה שהופקדו על microarray דולר. חישוב של המספר של חלבון ש-g נעשתה על סמך ריכוז החלבון מודפס לכל microspot. איור זה כבר ממאמרו של דיאס ואח. 20 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . מיתאם בין עוצמת פלורסנט בעוצמה ערכי צבע מוחלטים השיג עבור מבחני מתבצעת עם וזמינותו אבחון האלרגיה מסחרי. כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית (MFI), כלומר עוצמת ערכי צבע מוחלטים (MCI) שנמדד עבור הגילוי של אלרגנים הדגימות a, b, c, ו ד כניסות הם נתוני יומן 10 הפך את המרווחים שבו נצפתה מתאם ליניארי בין שתי השיטות. עוצמת microspots נצפתה איתור בהתבסס על הנוגדן fluorophore-לאחרונה (Fluorophore-Ab) היא פליטת קרינה פלואורסצנטית. בהירות microspots נצפתה איתור בהתבסס על וזמינותו Ab-AuNPs הושג לאחר פרויקט את microarray, היפוך התמונה עם תוכנות ליצירת תמונות. מיקרו-מערכים מיועדים וכן triplicates אנכי עם פקדים חיובי לגילוי קרינה פלואורסצנטית בתחתית הימין הקיצוני. שלוש פינות אחרות משמשות להערכת התוכנה. תמונות נותחו בגווני 16 סיביות. איור זה כבר ממאמרו של דיאס ואח. 20 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| R2 שיפור מוקדמת | R2 אחרי שיפור | |
| AuNPs אג | 8.70E-01 | 7.80E-01 |
| AgNPs אג | 9.10E-01 | 9.60E-01 |
| IONPs אג | 9.17E-01 | 9.30E-01 |
| SiNPs אג | - | 8.50E-01 |
טבלה 1. R2 ערכים עבור זיהוי של חלבון G, מוקדמת, לאחר שיפור, באמצעות קבוצות שונות של חלקיקים. הערכים2 R התקבלו לאחר התאמת עוצמת המקומות עם הריכוז של analyte נמדד.
Discussion
כיום, טכניקות שיפור האות מבחני עם זיהוי מבוסס nanoprobe או מבוססי אנזים12, דורשים קבוצה שנייה של חלקיקים למטרה nanoprobes זיהוי21 , או, במקרה של צביעת טכניקות, מוגבלים ל השימוש AuNPs או AgNPs כמו זיהוי הגששים. 22 . כאן, שיטה פשוטה, מהירה ונטולת אנזים מתואר עבור שיפור האות של מבחני זיהוי מבוסס nanoprobe. בשיטה זו, ניתן היה לשפר את האות ערכי צבע מוחלטים שסופקו על-ידי 4 סוגים של nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs ו- SiNPs.
הגורם הגברה שנצפו עבור כל ערכה של nanoprobes היה של 100-fold, למעט SiNPs שבו כימות של הגורם שיפור איננה אפשרית עקב חוסר שיפור קדם אותות. גורם שיפור זה מרמז כי היעילות של הפרוטוקול דומה בין כל סוגי nanoprobes. יתר על כן, כאשר פרוטוקול שיפור בוצעה על תמיכה נייר שבו הודפס סדרה דילול של השעיה AuNPs מניות, זה נצפתה גורם הגברה 10000-fold. הקודם כדי שיפור, המקומות גלוי עם המספר הנמוך ביותר של AuNPs היו בו הודפסו כ 10000 חלקיקים, לאחר שיפור המקומות הסתרת חלקיקים פחות מ- 10 הפך גלוי. 20
התנאים הוקמה עבור פרוטוקול שיפור שהוצגו כאן אפשרו ניצול של צמצום Au3 + Au0 לשיפור אותות, תוך שמירה על רעשי הרקע למינימום. ניתן לבצע השיפור אחרי וזמינותו מתבצע כמו גם על מיקרו-מערכים זה שהם אוחסנו עבור עד מספר חודשים לאחר וזמינותו בוצעה. הפתרון שיפור מורכבת תערובת 1:1 של פתרון 1 פתרון 2. שני פתרונות שניתן בעבר מעורב או מעורב ישירות כאשר pipetted על גבי microarray. ההבדל בין ערבוב מראש או ערבוב ישיר משפיע רק משך חיי המדף של הפתרון שיפור. כאשר טרום מעורב משך חיי המדף של 5-7 ימים גדל ל 30-45 ימים אם לא טרום מעורב.
ניתוח נוסף של התוצאות הראו כי שיטת שיפור אינה מפריעה ניתוח כמותי של החיישן. מתאם ליניארי בין עוצמת נצפתה ריכוז analyte היה מתוחזק (טבלה 1). הנתונים שהתקבלו עבור 4 דגימות קליניים מאופיין מראש באמצעות מתכלה microarray רכיב של אלרגן המבוסס על זכוכית, עם קרינה פלואורסצנטית רגילה איתור וזיהוי ערכי צבע מוחלטים, הראה קונקורדנציה טוב בין שתי השיטות לזיהוי. להשוות את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) ואת עוצמת ערכי צבע מוחלטים רשע (MCI), ממוצע R2 = 0.79 ± 0.08 היה מתקבל כאשר הנתונים הם 10 רשום על שני הצירים. הניסוי הראה כי שיטת שיפור ניתן להחיל על ערכה המסחרי אם משתמש את nanoprobes לצורך זיהוי או ניתן להתאים לצורך זיהוי מבוסס nanoprobe.
שיפור יעילות השיטה מסתמכת על שני היבטים קריטיים. זה חשוב להבטיח כי התערובת של פתרון 1, פתרון 2 הוא הומוגני. ללא תערובת הומוגנית, החיישן יהיה בקשר עם שברים של הפתרון שיפור איפה השולט לעומת השני פתרון 1 או 2. זה יקטין את היעילות של צמצום Au3 + Au0, ובכך לפגוע את היעילות של השיפור. חשוב גם שיהיה את כל שטח לטובת microarray בקשר עם הפתרון שיפור במהלך תקופת הדגירה.
כדי להשיג שיפור העדינה של אות, יידרש זמן דגירה ארוך (כ- 5 דקות) עם הפתרון שיפור. כדי למנוע ההתפתחות של רעש רקע זה יכול להתערב עם רכישת אות, השטח microarray צריך להיות שנחסם קודם לכן (למשל BSA, פג) כדי למנוע מהירה התצהיר לא ספציפי של יצירת0 והסוגר Au זהב שכבה.
מגבלה שיטת שיפור הוא מהותי היעילות של וזמינותו. וזמינותו מחייבת יש פקדים ואתאיזם המבטיחים שיפור האות נצפתה ניתן לייחס תוצאות אמת-חיוביות. אם יש שאינם ספציפיים ולאמוד nanoprobes עם המטרה, אותות רכשה לאחר שיפור לא יהיה חוקי.
טכניקות שיפור אחרות הן בהתאם גם צבירת ננו-חלקיק או ההגדלה של חלקיקים עם חומר המאפשר רכישת אות משופרת. באמצעות קידום הצטרפותם של מספר חלקיקים באתר זיהוי, רכישת אות ניתן יהיה גם מבחינה ויזואלית או מדידות UV-Vis. 5 טכניקות שיפור האות אלה מסתמכים על מערכת זיהוי שני שלבים, הגילוי הראשוני של analyte של עניין שלב שני שבו העיתונאית נדרשת כדי לאגד הבונה הזיהוי הראשוני. אסטרטגיות כאלה חסרי אוניברסאליות עקב הדרישה של שיפור מסוים פרוטוקול אופטימיזציה עבור כל סוג של וזמינותו.
טכניקות שיפור מוכתמים, כגון כסף מכתים, הרבה כמו פרוטוקול שהוצג כאן, לאפשר שיפור ישיר של המבנה זיהוי האות. עם זאת, בניגוד בפרוטוקול שמוצג כאן, צביעת כסף רק הוכח שיוחל או AuNPs או AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
תחולתה של שיטה זו סביר יכול להקיף כל assay המשתמשת AuNPs, AgNPs, IONPs או SiNPs כסוכני זיהוי. עבודה נוספת מתבצעת ללמוד את היישום של השיטה סנסורים המורכב של חומרים אחרים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מימון של המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / ERC גרנט הסכם מס 615458, מועצת המחקר השבדי ומצוינות Pronova מרכז לטכנולוגיה חלבון (VINNOVA - שוודית סוכנות ממשלתית למערכות חדשנות) הוא הודה בהכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
References
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
