En este trabajo se presenta un protocolo para la mejora de la señal de biosensores basados en nanoprobe. El protocolo se basa en la reducción del ácido chloroauric sobre la superficie de crónicas ya existentes que consisten en oro, plata, sílice u óxido de hierro nanopartículas.
Puede habilitar el uso de crónicas tales como oro, plata, sílice o nanopartículas de óxido de hierro como reactivos de detección en los ensayos de bioanalítica alta sensibilidad y lectura colorimétrica conveniente. Sin embargo, altas densidades de nanopartículas típicamente son necesarios para la detección. Los protocolos de mejora disponible basada en síntesis son o nanopartículas limitadas al oro y plata o se basan en la optimización y control enzimático preciso. Aquí, presentamos un protocolo para mejorar la lectura colorimétrica de oro, plata, sílice y óxido de hierro crónicas. Se observó que la señal colorimétrica puede mejorarse hasta un 10000-fold factor. La base para las estrategias de mejora de la señal es la reducción química de Au3 + Au0. Hay varias reacciones químicas que permiten la reducción de Au3 + Au0. En el protocolo, se utilizan buffers y H2O2 de buena y es posible favorecer la deposición de Au0 en la superficie de las crónicas existentes, en detrimento de la formación de nanopartículas de oro nuevo. El protocolo consiste en la incubación de los microarrays con una solución de ácido chloroauric y H2O2 en 2-(N-morfolino) tampón de pH ácido 6 (n-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-ácido siguiendo el ensayo de detección basada en nanoprobe. La solución de mejora puede aplicarse a sensores basados en vidrio y papel. Además, puede utilizarse en inmunoensayos disponibles comercialmente según lo demostrado por la aplicación del método a un microarray de alergenos comerciales. El desarrollo de señal requiere menos de 5 minutos de incubación con la solución de mejora y la lectura puede evaluarse por el ojo desnudo o dispositivos de adquisición de imagen de gama baja como una cámara digital o un escáner de sobremesa.
El uso de nanomateriales nanopartículas de oro (AuNPs) como nanopartículas de óxido de hierro (IONPs) ha permitido a las aplicaciones en biodetección con versatilidad y mejoras en la sensibilidad. 1 la gran cantidad de métodos desarrollados para la decoración de la superficie de las nanopartículas con diferentes ligandos, aprovechar de su alta superficie y volumen, han permitido el diseño de los sensores con sensibilidad mejorada. 2 sin embargo, una herramienta de biodetección depende el número de crónicas necesaria para lograr una señal detectable. Por ejemplo, en el caso de 40 nm AuNPs, para adquirir una señal a través de espectroscopía UV-vis, aproximadamente 90 × 106 crónicas es necesaria para detectar eficazmente el objetivo de interés. 3 esta limitación de densidad nanoprobe puede eludirse mediante el uso de amplificación de la señal. Tales estrategias4 puede basarse en la agregación entre partículas o aglomeración, donde se aumenta la densidad de Nanosondas inicial por acumular una segunda serie de crónicas sobre la primera. 5 aumentar el número de nanopartículas en un lugar determinado en una superficie de sensor permite visual o adquisición de la señal de UV-vis. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo se vincularán intrínsecamente a la capacidad de segmentación del segundo sistema de nanopartículas hacia el conjunto inicial de crónicas. Otras estrategias se basan en la tinción de crónicas ya sea oro y plata. 6 , 7 la tinción se logra a través de la reducción de los iones de plata sobre la superficie de las nanopartículas, lo que permite una visual o detección UV-vis. 8 estos métodos mejoran la señal existente de oro o plata crónicas por potenciar el plasmón de resonancia superficial de la señal, no dependiendo de eventos dirigidos a secundaria como en métodos de aglomeración entre partículas. Sin embargo, métodos de tinción de plata sólo han divulgado con uso de crónicas de oro o plata. 8 , 9
En 2005, Zayats et al. 10 informó de la reducción de los iones de la Au en la superficie de oro Nanosondas para aumentar la señal de resonancia de plasmón superficial. En este trabajo dependiente de la enzima, el peróxido de hidrógeno se generó por catálisis de oxidasa de glucosa y, junto con cloruro de cetiltrimetilamonio permitida la reducción del ácido chloroauric.
Más recientemente Wang et al. informó un método de mejora donde se produce una capa de oro sobre la superficie de crónicas existentes. 11 estas Nanosondas ampliadas muestran actividad catalítica de la peroxidasa-como contra el sustrato 3 ‘, 5, 5-tetrametilbencidina (TMB) que permite la visualización de un color azul brillante al ojo desnudo.
Stevens et al. reportado el desarrollo de un ensayo basado en ELISA plasmónica. 12 después de la detección de un antígeno prostático específico (PSA) a través de una estrategia tradicional de ELISA, un anticuerpo secundario marcado con la catalasa se incubó con el sensor después de que el sensor se sumerge en una solución que contiene peróxido de hidrógeno y ácido chloroauric. La presencia de la catalasa-modificado de anticuerpo secundario (resultado positivo) podría promover el consumo de peróxido de hidrógeno, reducción Reducción ácido chloroauric y rendimiento quasi-esférico monodispersados AuNPs con un color rojo. La ausencia de anticuerpos modificados catalasa (resultado negativo) permitió la concentración de peróxido de hidrógeno que permanecen intactas, promoviendo así la reducción de la chloroauric rápida y rendimiento AuNPs con morfologías mal responsables de un color azul/púrpura . La concentración de peróxido de hidrógeno, determinado por la actividad de catalasa, fue demostrada para ser correlacionado con la concentración del analito de interés. La necesidad de un anticuerpo secundario modificado de catalasa y el control de las condiciones de la actividad catalítica son dos factores que dificultan la universalidad de este método. Por otra parte, la formación de racimos de oro, independientes de las AuNPs existentes, puede presentar problemas de ruido de fondo a la estrategia de amplificación.
Las técnicas antes mencionadas, como así otros13,14,15, han hecho posible para biosensores basados en nanoprobe alcanzar límites de detección a la par con las técnicas tradicionales.
Aquí, se demuestra un método de mejora de oro novela, donde se amplifica la señal de un nanoprobe existente por potenciar o la introducción de una señal de resonancia de plasmón superficial. Después de la detección se lleva a cabo con el uso de oro, plata, sílice u óxido de hierro nanopartículas, el sensor se le permite incubar con una solución de una mezcla de peróxido de hidrógeno y ácido chloroauric en 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-ácido ácido buffer de pH 6 (MES). Se optimizaron las concentraciones de los componentes en la solución de mejora para favorecer la deposición de Au0 en la superficie de crónicas existentes. Para todos estudiaron nanoprobe tipos, es decir. AuNPs, nanopartículas de plata (AgNPs), nanopartículas de sílice (SiNPs) y IONPs, la formación de una capa mal rendido o había aumentado la dispersión de la luz que dio lugar a una señal visible perceptible o mayor. Se logró un aumento de señal con un factor de amplificación 100-fold para crónicas en papel y microarrays de vidrio y el proceso toma menos de 5 minutos para la adquisición de una señal. La adquisición de la señal puede hacerse por el ojo desnudo, espectroscopía UV-vis o proyección de imagen herramientas de gama bajos como una cámara digital o un escáner de sobremesa. Por otra parte, se demostró que el presente Protocolo de realce se puede aplicar fácilmente en un análisis diagnóstico de alergias disponibles en el mercado sin necesidad de optimización específico.
En la actualidad, técnicas de realce de señal para ensayos con detección basada en nanoprobe son ya sea de base enzimática12, requieren un segundo conjunto de nanopartículas a destino la detección crónicas21 o, en el caso de técnicas de tinción, se limitan a el uso de AuNPs o AgNPs como sondas de detección. 22 aquí, un método simple, rápido y libre de enzima se describe para el realce de la señal del nanoprobe detección-ensayos. Con este método, fue posible mejorar la señal colorimétrica proporcionada por 4 tipos de crónicas: AuNPs, AgNPs, IONPs y SiNPs.
El factor de amplificación observada para cada conjunto de crónicas fue de 100-fold, excepto el SiNPs donde no fue posible debido a la falta de señales de mejora de la cuantificación del factor de mejora. Este factor mejora sugiere que la eficacia del protocolo es similar en todos los tipos de crónicas. Por otra parte, cuando el protocolo de realce se llevó a cabo sobre un soporte de papel donde se imprime una serie de diluciones de una suspensión stock de AuNPs, se observó un factor de 10000-fold amplificación. Anterior a la mejora, los puntos visibles con el menor número de AuNPs fueron donde se imprimieron aproximadamente 10000 nanopartículas, después mejora las manchas que nanopartículas de menos de 10 llegó a ser visibles. 20
Las condiciones establecidas para el protocolo de mejora aquí presentado han permitido tomar ventaja de la reducción de Au3 + Au0 para mejorar la señal, manteniendo el ruido de fondo a un mínimo. La mejora puede realizarse justo después de que el ensayo se realiza, así como microarrays que han sido almacenadas por hasta varios meses después el ensayo se realizó. La solución de mejora consiste en una mezcla 1:1 de solución 1 y 2. Ambas soluciones pueden ser previamente mezclados o directamente mezclados cuando se pipetea en el microarray. La diferencia entre la mezcla o mezcla directa afecta sólo la vida útil de la solución de mejora. Cuando premezclado la vida útil es de 5 a 7 días, aumentando a 30-45 días si no premezclada.
Análisis de los resultados ha demostrado que el método de mejora no interfiera con el análisis cuantitativo del biosensor. Una correlación lineal entre la intensidad observadas y la concentración del analito se mantuvo (tabla 1). Los datos obtenidos para 4 muestras clínicas previamente caracterizadas mediante el inmunoensayo de microarray de componente alérgeno basados en vidrio, con detección de fluorescencia estándar y detección colorimétrica, demostraron una buena concordancia entre los dos métodos de detección. Comparación de la intensidad de fluorescencia media (IFM) y la intensidad media de colorimétrica (MCI), una media R2 = 0.79 +-0.08 se obtuvo cuando los datos se registran 10 en ambos ejes. Este experimento demostró que el método de mejora puede aplicarse a un kit comercial, si utiliza el Nanosondas para detección o puede ser adaptado para la detección de nanoprobe.
La eficacia del método de mejora se basa en dos aspectos críticos. Es importante asegurar que la mezcla de la solución 1 y la solución 2 es homogénea. Sin una mezcla homogénea, el sensor estará en contacto con fracciones de la solución de mejora donde la solución 1 o 2 es predominante en relación con el otro. Reducirá la eficacia de la reducción de Au3 + Au0, dañando así la eficacia de la mejora. También es importante que toda la zona de interés de los microarrays en contacto con la solución de mejora durante el período de incubación.
Para lograr el realce ultrasensible de una señal, se requerirá un tiempo de incubación (aproximadamente 5 min) con la solución de mejora. Para evitar el desarrollo de ruido de fondo que puede interferir con la adquisición de la señal, la superficie de microarray debe estar previamente bloqueados (por ejemplo, BSA, PEG) para evitar la rápida deposición inespecífica de Au0 y consecuente formación de oro capa.
Una limitación al método del realce es la eficacia intrínseca del ensayo. El ensayo requiere tener controles positivos y negativos en cuanto a garantizar la mejora de la señal puede ser atribuido a los resultados positivos de verdad. Si hay una interacción no específica de las crónicas con el objetivo, las señales adquirieron después de mejora no será válida.
Otras técnicas de mejora son en base a cualquier agregación de nanopartículas o coloración de las nanopartículas con un material que permite la adquisición de señal mejorada. Promoviendo la recolección de la cantidad de nanopartículas en el sitio de detección, la adquisición de la señal será posible ya sea visualmente o medidas de UV-Vis. 5 estas técnicas de realce de la señal dependen de un sistema de detección de dos etapas, la detección inicial del analito de interés y una segunda etapa donde se requiere que el reportero se unen a la construcción de detección inicial. Tales estrategias carecen de universalidad debido a la exigencia de optimización de protocolo de mejora específicos para cada tipo de ensayo.
Las técnicas de mejora tinción, como la plata, tanto la coloración como el protocolo que aquí se presenta, permiten la mejora directa de las construcciones de detección de señal. Sin embargo, a diferencia del protocolo que se muestra aquí, plata ha sólo ha demostrado que aplicar a las AuNPs o AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
La aplicabilidad de este método es probable que podría abarcar cualquier ensayo que utiliza AuNPs, AgNPs, IONPs o SiNPs como agentes de detección. Trabajo se lleva a cabo para estudiar la aplicación del método de sensores consisten en otros materiales.
The authors have nothing to disclose.
Financiación del Consejo Europeo de investigación de la Unión Europea en el séptimo programa marco (FP/2007-2013) / ERC Grant acuerdo no. 615458, el Consejo Sueco de investigación y excelencia Pronova centro de tecnología de la proteína (VINNOVA – sueco Agencia gubernamental de los sistemas de innovación) se agradece.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |