I detta arbete presenteras ett protokoll för signal förbättring av nanoprobe-baserade biosensing. Protokollet är baserat på en minskning av chloroauric syra på ytan av befintliga nanoprober som består av guld-, silver-, kisel- eller järn-oxid nanopartiklar.
Användning av nanoprober såsom guld-, silver-, kisel- eller järn-oxid nanopartiklar som upptäckt reagenser i bioanalytisk analyser kan aktivera hög känslighet och bekväm kolorimetriska avläsning. Dock behövs vanligen höga tätheter av nanopartiklar för upptäckt. Protokollen finns syntes-baserade förbättring är antingen begränsat till guld och silver nanopartiklar eller lita på enzymatisk precisionskontroll och optimering. Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra den kolorimetriska avläsningen av guld, silver, kiseldioxid och järnoxid nanoprober. Det observerades att den kolorimetriska signalen kan förbättras genom upp till en 10000-fold faktor. Grunden för sådan signal enhancement strategier är det kemisk reduktion av Au3 + Au0. I området i närheten finns det flera kemiska reaktioner som gör att en minskning av Au3 + Au0. I protokollet, Goods buffertar och H2O2 används och det är möjligt att gynna nedfall av Au0 på ytan av befintliga nanoprober, på bekostnad av bildandet av nya guld nanopartiklar. Protokollet består av inkubering av microarray med en lösning bestående av chloroauric syra och H2O2 i 2-(N-morpholino) ethanesulfonic surt pH 6 bufferten efter nanoprobe-baserad detektion analysen. Enhancement lösningen kan tillämpas på papper och glas-baserade sensorer. Dessutom kan den användas i kommersiellt tillgängliga immunoanalyser framgår av tillämpningen av metoden på en kommersiell allergen microarray. Signal utvecklingen kräver mindre än 5 minuters inkubation med lösningen förbättring och utslaget kan bedömas av blotta ögat eller low-end bild förvärv enheter såsom en bordsskiva skanner eller en digitalkamera.
Användningen av nanomaterial som Guldnanopartiklar (AuNPs) eller järnoxid nanopartiklar (IONPs) har tillåtna program i biosensing med förbättrad känslighet och mångsidighet. 1 uppsjö av metoder som utvecklats för dekoration av ytan av nanopartiklar med olika ligander, att dra nytta av deras höga yta volym förhållande, har aktiverat utformningen av sensorer med förbättrad känslighet. 2 dock ett biosensing verktyg är beroende av antalet nanoprober som krävs för att uppnå en detekterbara signal. Till exempel när det gäller 40 nm AuNPs, att förvärva en signal via UV-vis spektroskopi, cirka 90 × 106 nanoprober krävs för att effektivt upptäcka föremål för intresse. 3 denna nanoprobe densitet begränsning kan kringgås med hjälp av signal förstärkning. Sådana strategier4 kan baseras på interparticle aggregering eller tätbebyggelse, där tätheten av inledande nanoprober ökas genom att ackumulera en andra uppsättning nanoprober vid först. 5 öka antalet nanopartiklar på en given plats på en sensor yta tillåter visuell eller UV-vis signal förvärv. Dock kommer att analysens känslighet vara förknippad med inriktning kapaciteten i den andra uppsättningen av nanopartiklar mot den ursprungliga uppsättningen nanoprober. Andra strategier är beroende av färgningen av antingen guld och silver nanoprober. 6 , 7 färgningen uppnås genom minskning av silverjoner på ytan av de nanopartiklar, möjliggör en visuell eller UV-vis-detektion. 8 dessa metoder öka signalen av befintliga guld eller silver nanoprober av potentierande ytan resonans plasmon signal, inte beroende på sekundär målgrupp händelser som i interparticle gytter metoder. Silver färgning metoder har emellertid endast rapporterats med användning av guld eller silver nanoprober. 8 , 9
I 2005, Zayats et al. 10 rapporterade en minskning av Au joner på ytan av guld nanoprober att öka ytan plasmon resonans signalen. I detta enzym-beroende arbete genererades väteperoxid av glukos oxidas katalys och tillsammans med cetyltrimethylammonium klorid tillåtna minskning av chloroauric syra.
Mer nyligen Wang et al. rapporterade en förbättring metod där ett guld lager produceras på ytan av befintliga nanoprober. 11 dessa utvidgade nanoprober visas peroxidas-liknande katalytiska aktivitet mot de substrat 3′, 5, 5 ‘-tetrametylbensidin (TMB) möjliggör visualisering av en ljust blå färg för blotta ögat.
Stevens et al. redovisas utvecklingen av en plasmoniska ELISA-baserad analys. 12 efter upptäckt av ett prostataspecifikt antigen (PSA) genom en traditionell ELISA strategi, var en sekundär antikropp märkt med katalas inkuberas med sensorn varefter sensorn var nedsänkt i en lösning som innehåller väteperoxid och chloroauric syra. Förekomst av sekundära katalas-modifierade antikroppen (positivt resultat) skulle främja konsumtionen av väteperoxid, sakta chloroauric syra sänkning och ger nästan sfärisk monodispersed AuNPs med en röd färg. Avsaknad av katalas-modifierade antikroppen (negativa resultat) tillåtna koncentrationen i väteperoxid att förbli intakt, vilket främjar snabb chloroauric minskning och ger AuNPs med oklara morfologier ansvarar för en blå/lila färg . Koncentrationen av väteperoxid, bestäms av aktiviteten av katalas, visades vara korrelerade till koncentrationen av analyten sevärdheter. Behovet av en katalas-modifierade sekundär antikropp och kontroll av villkoren för den katalytiska aktiviteten är två faktorer som hindrar denna metod universalitet. Dessutom införa bildandet av guld kluster, oberoende av den befintliga AuNPs, bakgrund bullerproblem till strategin förstärkning.
De ovan nämnda teknikerna, som också flera andra13,14,15, har gjort det möjligt för nanoprobe-baserade biosensorer att nå detektionsgränser i paritet med traditionella tekniker.
Här, en roman guld förbättring metod demonstreras, där signalen från en befintlig nanoprobe förstärks av potentierande eller införa en ytan plasmon resonans signal. Efter identifieringen genomförs med användning av guld-, silver-, kisel- eller järnoxid nanopartiklar, sensorn är tillåtet att Inkubera med en lösning av en blandning av väteperoxid och chloroauric syra i 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syra (MES) pH 6 buffert. Koncentrationerna av komponenterna i enhancement lösningen var optimerad för att gynna nedfall av Au0 på ytan av befintliga nanoprober. För alla studerade nanoprobe typer, dvs. AuNPs, Silvernanopartiklar (AgNPs), kiseldioxid nanopartiklar (SiNPs) och IONPs, bildandet av en dåligt definierad lager gav eller augmented spridningen av ljuset vilket resulterade i en detekterbar eller ökad synlig signal. En signal ökning med en 100-faldig förstärkningsfaktor uppnåddes för nanoprober i papper och glas-baserade microarrays och processen tar mindre än 5 min att förvärva en signal. Förvärvet signal skulle kunna göras för blotta ögat, UV-vis spektroskopi eller imaging low-end verktyg såsom en digitalkamera eller en skanner i bordsskivan. Det visades dessutom att denna förbättring protokoll kan lätt tillämpas i ett kommersiellt tillgängliga allergi diagnostiska test utan att kräva specifika optimering.
För närvarande signal förstärkningstekniker för analyser med nanoprobe-baserad detektion är antingen enzym-baserade12, kräva en andra uppsättning nanopartiklar att rikta de Upptäck nanoprober21 eller, när det gäller färgningsteknik, är begränsade till användning av AuNPs eller AgNPs som upptäckt sonder. 22 här, en enkel, snabb och enzym-fri metod beskrivs signal förbättring av nanoprobe upptäckt-baserade analyser. Med denna metod, var det möjligt att förbättra kolorimetriska signalen som tillhandahålls av 4 typer av nanoprober: AuNPs, AgNPs, IONPs och SiNPs.
Den observerade förstärkningsfaktor för varje uppsättning nanoprober var av 100-fold, utom den SiNPs där kvantifiering av enhancement faktorn inte var möjligt på grund brist före enhancement signaler. Denna förbättring faktor antyder att effektiviteten i protokollet är liknande för alla typer av nanoprober. Dessutom när protokollet enhancement genomfördes på ett pappersstöd där en utspädning serie en stamlösning AuNPs trycktes, observerades en 10000-fold förstärkningsfaktor. Tidigare till förbättring, de synliga ställen med det lägsta antalet AuNPs var där cirka 10000 nanopartiklar trycktes, efter förbättring fläckarna härbärgerat mindre än 10 nanopartiklar blev synligt. 20
De villkor som fastställts för protokollet förbättring som här presenteras har tillåtit att dra nytta av en minskning av Au3 + Au0 för signalen att förbättra, bibehållen bakgrund buller till ett minimum. Förstärkningen kan utföras direkt efter analysen utförs såväl som på microarrays som har lagrats för upp till flera månader efter analysen utfördes. Enhancement lösningen består av en 1:1 blandning av lösning 1 och lösning 2. Båda lösningarna kan tidigare blandas eller direkt blandade när pipetteras till microarray. Skillnaden mellan pre blandning eller blanda direkt påverkar bara hållbarheten av enhancement lösningen. När pre-blandad hållbarhet är 5-7 dagar stiger till 30-45 dagar om inte förblandad.
Vidare analys av resultaten har visat att metoden enhancement inte stör kvantitativ analys av biosensor. En linjär korrelation mellan observerade intensiteten och koncentrationen av analyten bibehölls (tabell 1). Uppgifterna om 4 pre kännetecknas kliniska prover med glas-baserade allergen komponent microarray immunoassay, med standard fluorescens upptäckt och kolorimetriska upptäckt, visade en god överensstämmelse mellan de två identifieringsmetoder. Jämför medelvärdet fluorescensintensiteten (MFI) och genomsnittlig kolorimetriska intensiteten (MCI), en genomsnitt R2 = 0,79 +/-0,08 erhölls när data är 10-inloggad på båda axlarna. Detta experiment visade att metoden förbättring kan tillämpas på ett kommersiella kit om det använder nanoprober för detektion eller kan anpassas för nanoprobe-baserad detektion.
Förbättring metod effekten är beroende av två kritiska aspekter. Det är viktigt att säkerställa att blandningen av lösning 1 och lösning 2 är homogen. Utan en homogen blandning, kommer att sensorn vara i kontakt med bråkdelar av enhancement lösningen där lösning 1 eller 2 är dominerande i förhållande till den andra. Som kommer att minska effektiviteten i minskningen av Au3 + Au0, således skada effektiviteten i förstärkningen. Det är också viktigt att ha det hela området av intresse för microarray kontakt med enhancement lösningen under inkubationstiden.
För att uppnå ultrasensitive förbättring av en signal, kommer en längre inkubationstid (ca 5 min) med enhancement lösningen att krävas. För att undvika utveckling av bakgrund buller som kan störa signalen förvärvet, ska microarray ytan vara tidigare blockerade (t.ex. BSA, PEG) att förhindra snabb ospecifikt nedfall av Au0 och därav bildandet av guld skikt.
En begränsning till metoden förbättring är inneboende effekten av analysen. Analysen kräver att ha negativa och positiva kontroller som säkerställer att den signalen förbättringen observeras kan hänföras till sant positiva resultat. Om det finns en icke-specifik interaktion av nanoprober med målet, förvärvade signaler efter förbättring inte kommer att vara giltigt.
Andra förstärkningstekniker är baserat på antingen nanopartiklar aggregering eller färgning av nanopartiklarna med ett material som tillåter bättre signal förvärv. Genom att främja insamling av antalet nanopartiklar på webbplatsen identifiering, signal förvärvet blir möjligt antingen visuellt eller UV-Vis mätningar. 5 dessa signal förstärkningstekniker lita på ett två-stegs system för upptäckt, den inledande identifieringen av analyten av intresse och ett andra steg där reportern krävs att binda till den inledande identifiering konstruktion. Sådana strategier saknar universalitet på grund av kravet på viss förbättring protokoll optimering för varje typ av test.
De färgning förstärkningstekniker, såsom silver färgning, mycket som protocol här presenteras, tillåta en direkt förbättring av signal upptäckt konstruktioner. Men till skillnad från det protokoll som visas här, har silverfärgning bara visats tillämpas på antingen AuNPs eller AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
Tillämpligheten av denna metod kunde sannolikt spänner någon analysmetod som använder AuNPs, AgNPs, IONPs eller SiNPs som upptäckt agenter. Ytterligare arbete genomförs för att studera tillämpningen av metoden i sensorer som består av andra material.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering från Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant avtal nr 615458, Vetenskapsrådet och Pronova excellence center för protein-teknik (VINNOVA – svenska Verket för innovationssystem) är erkänt tacksamt.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |