Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Miniatyriserte eksempel forberedelse til overføring elektronmikroskop

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57310
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1
1Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum, University of Basel, 2Swiss Nanoscience Institute, University of Basel, 3BioEM lab, Biozentrum, University of Basel
* These authors contributed equally

Summary

Et instrument og metoder for utarbeidelsen av nanoliter størrelse utvalg volumer for overføring elektronmikroskop presenteres. Ingen papir-blotting trinn er nødvendig, og dermed unngår de ødeleggende konsekvensene dette kan ha for proteiner, betydelig redusere utvalget tap og aktivere analyse av enkelt celle lysate for visuell Proteomikk.

Abstract

På grunn av teknologiske framskritt, cryo-elektronmikroskop (cryo-EM) er raskt å bli en standard metode for strukturell analyse av protein komplekser å Atom løsning. Men forbli protein isolasjon teknikker og prøve forberedelse metoder for EM en flaskehals. Et relativt lite antall (100.000 noen millioner) personlige protein partikler skal avbildes for høyoppløselig analyse av proteiner av én partikkel EM tilnærming, gjør miniatyriserte eksempel teknikker og microfluidic prinsipper mulig.

En miniatyriserte, blotting-papirløse EM rutenettet forberedelse metode for eksempel før condition, EM rutenettet grunning og etterbehandling som bare bruker nanoliter-volum av prøven er presentert. Metoden bruker en dispensering system med sub-nanoliter presisjon kontroll flytende opptak og EM rutenettet grunning, en plattform for å kontrollere rutenettet temperaturen dermed å finne relativ fuktighet over EM rutenettet, og en pick-og-stupe-mekanisme for eksempel vitrifikasjon. For cryo-EM, et EM rutenett er plassert på temperaturkontrollert scenen og prøven er aspirated inn en kapillær. Kapillær spissen er plassert i nærheten av rutenettet overflaten, rutenettet er lastet med prøven og overflødig er nytt aspirerede inn i microcapillary. Deretter er prøve filmen stabilisert og litt tynnet av kontrollert fordampning regulert av forskyvningen av plattform temperaturen i forhold til duggpunktet. På et gitt tidspunkt utløses pick-og-styrter mekanismen, raskt overføre primet EM rutenettet til flytende etan for eksempel vitrifikasjon. Eventuelt er prøve condition metoder tilgjengelig for å forberede nanoliter størrelse utvalg volumer for negative flekk (NS) EM.

Metodikkene sterkt redusere prøve og unngå tilnærminger skadelige proteiner, slik som filter papir blotting brukes i konvensjonelle metoder. Videre kan minuscule mengden prøve kreves romanen eksperimentelle strategier, for eksempel rask eksempel condition, sammen med encellede lysis for "visuelle Proteomikk" eller "lossless" totale eksempel forberedelse til kvantitativ analyse av komplekse eksempler.

Introduction

Maskinvare og programvare for strukturell analyse av protein komplekser av overføring elektronmikroskop (TEM) har svært avanserte de siste årene. Forbedringene gjort banet vei til en "oppløsning revolution"1,2 og forandret strukturelle forskning. Revolusjonen startet med bruk av cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM)3,4, tillater utarbeidelse av biologiske prøver under nær fysiologiske forhold mens redusere stråling følsomhet og hindre eksempel fordampning i høy vakuum overføring elektronmikroskop5. I de følgende årene økt inkrementell teknologiske fremskritt gradvis oppløsning oppnåelig. Blant disse nyvinningene ble programmet feltet-utslipp våpen6,7, og mer nylig forbedret data analysealgoritmer, for eksempel maksimal sannsynlighet metoder8,9. Direkte elektron detektor kameraer10,11,12,13, filmmodus imaging og tilhørende programvare utviklingen14,15, 16 , 17, gitt det endelige gjennombruddet kreves for å oppnå Atom løsning for biologiske prøver av én partikkel analyse (for en gjennomgang se Cheng, Grigorieff, et al. 18). betydningen av cryo-EM ble nylig anerkjent av tildelingen av Nobelprisen i kjemi tre av pionerene.

For å bilde et biologiske utvalg av TEM, måten du laste EM rutenettet med prøve (heretter referert til som "rutenett forberedelse") må sikre at det resulterende eksempel laget (i) er tynne nok (< 100 nm) å unngå omfattende støy av uelastisk eller multiplisere spredt elektroner, (ii) tåler høy vakuum elektronmikroskop, og (iii) beskytter biomolecules mot stråling skader. To hovedmetoder brukes til å oppfylle disse godtgjørelser: Negative flekk(NS)19,20 prosedyrer (figur 1A) adsorberes prøven til en tynn karbon film, legge til biomolecules i amorfe heavy metal og deretter tillate at samlingen tørr luft. Dette er enkel og rask, og de lastet EM (heretter referert til som "eksempel rutenett") er lett å lagre og kan oppbevares i lengre perioder (vanligvis år). I TEM, forberedelsene exhibit høy kontrast på grunn av NS og tåle høyere elektron doser enn cryo-preparater, men oppløsningen er begrenset til ca 20 Å. Cryo-EM prosedyrer (figur 1B) ansette holey karbon støtter. En tynn film av prøve løsningen er spredt over hullene og EM rutenettet er kastet inn i en cryogen, vanligvis flytende etan, raskt avkjøles den under-150 ° C. Resultatet er en amorf, vitrified, 50 til 100 nm-tykk film av løsningen i støtte hullene. Denne tynne, amorf filmen tåler høy vakuum i elektronmikroskop og i det ideelle tilfellet, bevarer biologiske strukturer i sin opprinnelige tilstand. Prosedyren kan biologiske prøver å avbildes i høy oppløsning. Imidlertid holdes prøve rutenettet ved temperaturer under-150 ° C hele tiden å unngå devitrification. Det kan avbildes bruker relativt høy elektron doser på grunn av lav temperatur, men kontrasten og signal-til-støy forholdet er likevel lav. Derfor snitt teknikker er ansatt for å øke kontrasten, og forutsatt at prøven er imaged fra forskjellige vinkler, en høy oppløsning tredimensjonalt (3D) kart kan bli rekonstruert. De mest brukte svært vellykket metode for 3D rekonstruksjon som nå er den eneste partikkel tilnærmingen. For en siste gjennomgang, kan du se Cheng al.18.

Negativ flekken TEM (NS-EM) er viktig for screening og kvalitetskontroll, når Høykontrast er nødvendig eller bare begrensede mengder utvalg er tilgjengelig (adsorpsjon til karbon filmen generelt konsentrerer utvalget). Enkelt partikkel cryo-EM er metoden gull-standard om høyoppløselige 3D rekonstruksjoner av protein er rettet for.

Figure 1
Figur 1: prinsipper av TEM rutenettet forberedelse og sammenligning mellom klassisk (panelet A, B) og en microfluidic tilnærming (panel C, D). A) klassisk NS-EM rutenettet forberedelse: om 3 µL av prøven er pipetted for hånd på en EM rutenett dekket med en kontinuerlig karbon film (senere referert til som en 'NS-EM rutenett") (i). Etter inkubasjon for ca 10 s, filter papir brukes å viske bort overflødig væske fra siden (ii), forlater den adsorbert biomolecules i en tynn vann film. Deretter protein er ruges i heavy metal salt løsning, f.eks, 2% uranyl acetate, for 20 s (iii), og igjen væske fjernes ved blotting fra siden ved hjelp av filter papir (iv). Til slutt, EM-rutenettet er igjen til tørk i luften. B) klassisk cryo-EM rutenettet forberedelse: om 3 µL av prøven er pipetted av en hånd på en holey karbon film. For å danne en tynn eksempel film, fjernes overflødig væske av papir-blotting ansikt på fra en eller begge sider (ii). Til slutt, rutenettet er raskt kastet inn flytende etan for vitrifikasjon (iii). C) NS-EM rutenettet forberedelse bruk cryoWriter: A 5 nL volum er pustende fra prøve lager ved hjelp av en microcapillary (i). For eksempel condition er microcapillary spissen nedsenket i condition løsningen, f.eks2% ammonium acetate. Ioner og små molekyler utveksles ved diffusjon (ii). Merk at dimensjonene for microcapillary sikre at hele prosessen er diffusjon drevet. Proteiner har mye lavere diffusjon konstanter enn salt ioner og er ikke betydelig mistet24. Endelig er prøven utlevert på rutenettet og lov til å tørke (iii). D) prinsipper cryo-EM rutenettet forberedelser med metoden cryoWriter-baserte: en EM rutenettet dekket med en holey karbon film er plassert på overflaten av en temperaturkontrollert plattform og holdt av pinsett. Temperaturen på plattformen styres på en forskjøvet fra duggpunkt temperaturen på rutenettet miljøet. Rutenettet flyttes i forhold til microcapillary som inneholder utvalget og microcapillary senkes før det er noen få mikrometer over rutenettet. Senere, er noen nanoliters av prøven utlevert fra den mens scenen flyttes i en spiral mønster; overskytende væske er nytt aspirerede (i). Etter EM rutenett grunning, trekkes microcapillary og rutenettet forblir på temperatur kontrollert plattform (heretter kalt duggpunkt (DP) scenen) for en kort tid til å tillate en kontrollert mengde å fordampe. For styrter frysing, er rutenettet raskt trukket fra scenen ved hjelp av pinsett (ii), vendes 90 ° i vertikal posisjon og stupte inn i et cryogen bad (iii) (senere referert til som "pick-og-styrter" mekanisme). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dessverre rutenettet forberedelse metodene som brukes for NS og cryo-EM har ikke er vesentlig forbedret siden de ble oppfunnet. Gjeldende ulempene er høy eksempel forbruket (ca. 3 µL 1 mg/mL protein) og den store mengden (> 99%) i utvalg mistet (figur 1A, B). Videre klassisk måten du forberede rutenett cryo-EM er harde fremgangsmåte for proteiner: først det innebærer en omfattende ansikt på papir-blotting trinn (figur 1B, ii), og andre protein er eksponert for luft-vann-grensesnittet for en betydelig mengde tid21. Her en alternativ metode for prøven før condition, prøve rutenettet forberedelse og etterbehandling (rutenett tørking eller vitrifikasjon) for NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (figur 1D) er presentert. Huset bygget stilling, kalt "cryoWriter", bruker miniatyriserte eksempel håndtering teknologi og microfluidic prinsipper å Sug opp tilstand og dispensere prøve, unngå papir blotting helt og gi alternative metoder for å tynne prøver for Cryo-EM. Det betydelig reduserer eksempel forbruk og bedre bruker-kontroll over eksempel forberedelse som helhet. Videre tillater den romanen eksperimentelle programmer. for eksempel utarbeidelsen av isolerte biologiske komponenter i enkeltceller i en metode kalt "enkelt celle visuelle Proteomikk"22,23,24,25.

Protocol

En "cryoWriter" (figur 2, for informasjon se tidligere arbeid24,26,27) eller tilsvarende instrumentering kreves for følgende protokoller. En liste over leverandører for deler og forbruksvarer er gitt i Tabellen for materiale.

1. negative flekk (NS) rutenettet forberedelse

  1. Slå på maskinen og starter programvaren. Initialisere alle nødvendige moduler (sprøyte pumpe kontrolleren, motorisert stadier, overvåkingskameraer og duggpunkt scenen).
  2. Cool eksempel støtte og duggpunkt scenen. Hvis nødvendig, sørge for at duggpunkt scenen temperaturen reguleres 1-2 ° C over duggpunkt.
    Merk: Scenen er avkjølt av en kommersiell Peltier enhet med en PID-kontroller.
  3. Forberede NS ved å fylle en 100 eller 200 µL PCR tube med 100-150 µL av NS (f.eks, kommersielt tilgjengelig 2% methylamine tungstate). Sett røret på avkjølt eksempel støtte av instrumentet.
  4. Plasser prøven.
    1. Sette prøven (0,5 - 1 µM) inn i et 100 eller 200 µL PCR rør. Hvis mindre enn 50 µL av prøve tilgjengelig, kuttet av nederst på en PCR rør med et barberblad og bruke den som en prøve også. Dette sikrer at microcapillary nås lett prøven.
      Merk: Det er lettest å Sug opp prøver fra 100 eller 200 µL PCR rør, fordi microcapillary brukes senere inneholder utvalget er litt skrå og reise høyde z retning er begrenset.
    2. Plass PCR rør/beholderen på avkjølt eksempel støtte i instrumentet å hindre fordampning. Alternativt kan eksempler være aspirated fra bra plater i mikroskopet scenen topp inkubator ved romtemperatur; kjøling er ikke implementert for godt plater.
  5. Definere posisjoner. Bruk cryoWriter-joysticken som styrer motorisert xy-scenen og programvare kontrollknappene for lineær x-, y- og z-aksen stadier posisjon i microcapillary. Bruk kameraet for å kontrollere plasseringen av av kapillær.
    1. Flytt microcapillary eksempel reservoaret. Senk spissen i prøven væsken og lagre denne posisjonen som "sample".
    2. Flytt microcapillary til NS PCR røret, dyppe spissen i NS løsningen og lagre denne posisjonen som "flekken".
    3. Plass microcapillary omtrent 100 µm over midten av sporet der EM rutenettet plasseres og lagre denne posisjonen som "grid_save".
  6. Sug opp prøve og tilstand den for NS-EM.
    1. Dersom ikke allerede installert, kan du montere en 10-µL sprøyte (0,46 mm indre diameter) på en presisjon sprøytepumpe.
    2. Fest en ende av en 30 cm lang smeltet silica microcapillary (ytre diameter 360 µm, indre diameter 150 µm) til sprøyten stikkontakt.
    3. Koble den andre enden av microcapillary til en kort (5 cm) lenge konisk microcapillary via trykk passer kontakt. Den koniske spissen av den korte microcapillary danner dispensering spissen.
    4. Fyll sprøyten med degassed dobbel-destillert vann (ddH2O, systemet flytende) og unngå dannelse av luftbobler.
    5. Støte noen titalls nanoliters av systemet, og fjerne noen dråper fra microcapillary med en lofri vev.
    6. Dobbeltklikk den lagrede prøveposisjon. Dette stillinger i microcapillary i prøven godt. Mens av kapillær er bevegelse, dispensere 3 x 0,5 nL systemet flytende like før microcapillary spissen er nedsenket i prøve å hindre luftboble blir fanget det (se note 2 nedenfor).
    7. Leveringstanken 5 nL av prøven.
    8. Dobbeltklikk den lagrede NS-posisjonen. Microcapillary er trukket fra beholderen utvalg og flyttet til NS reservoaret automatisk. Mens av kapillær er bevegelse, manuelt dispensere 3 x 0,5 nL eksempel væske like før spissen er nedsenket i reservoaret for å sikre at det er ingen luft bobler (se note 2 nedenfor).
      Merk: viktig: (1) når du bytter fra aspirasjon dispensering modus eller omvendt, det er et lite tap i stempelet slag grunn til tilbakeslag i i gears of sprøytepumpen. Ifølge produsenten, tilbakeslag av en ny enhet ligger mellom 7 og 12 µm. For våre sprøyte med fat diameter 0,46 mm betyr dette 1-2 nL. Derfor kan 1-2 nL være "utlevert", før prøven er faktisk utlevert. Vanligvis en liten dråpe begynner å avslutte microcapillary spissen etter den tredje 0,5 nL dispensere trinn. (2) en luftboble fanget over/under prøven ville gjøre dispensing mindre nøyaktig og forhindre prøve condition ved diffusjon.
    9. La microcapillary midt i 3-12 minutter, avhengig av prøven buffer og munnstykke geometri.
      Merk: Jo høyere salt og/eller fosfat konsentrasjonen i buffer, jo lenger nødvendig nedsenkningstiden. NS diffunderer (relativt raskt) inn prøven pluggen mens bufferen salter (relativt rask) og protein (saktere) diffus ut. Dette senker konsentrasjonen av buffer salter i utvalget hindre bandets når lastet rutenettet tørker. Videre fosfat tendens til å danne en føre sammen med NS.
  7. Forberede et rutenett og sette en flekk av betinget prøven.
    1. Mens prøven er å være betinget, ta et stykke selvklebende tape og en PDMS blokk og rengjøre oversiden av PDMS ved å bruke og fjerne teip for å sikre at det er ingen støv. Sett PDMS blokken i en Petriskål.
      Merk: Nye PDMS blokker hentes fra rent.
    2. Forsiktig plukke opp et rutenett (f.eksCu, 200 eller 400 mesh belagt med Parlodion/C film). Sørg for å ta bare kanten av rutenettet med pinsett. Plass den på rene PDMS blokken med karbon filmen vendt oppover.
    3. Sted PDMS blokken med rutenettet i en air glød-utslipp enhet og glød utslipp for 20 s med 100 W strøm på 0,4 mbar. Lagre rutenettet i en lukket Petriskål. Lengre glød utslipp ganger vanligvis føre til en større spredning av avsatt eksempel volumet på rutenettet. Resultatet flekken blir tynnere (svakere flekken).
    4. 1 min før nedsenkningstiden er opp, forstå glød-utladet rutenettet med cryoWriter pinsett. Kontroller at elektromagnet er aktivert. ellers slå den på i programvaren. Montere pinsett på elektromagnet og bruke manuelle micromanipulator skruen til å justere rutenettet flatt på duggpunkt scenen, karbon filmen side opp. Kontroller at duggpunkt scenen temperaturen reguleres 1-2 ° C over duggpunkt å redusere frekvensen av fordampning etter prøven er lastet.
    5. Når nedsenkningstiden er opp, dobbeltklikk på "grid_save". Microcapillary spissen plasseres trygt på rutenettet havoverflaten. Manuelt ta microcapillary spissen i kontakt med rutenettet. Løft dysen ved 10 µm og plasser den over sentrum.
      Forsiktig: Noen eksempler som inneholder vaskemidler tendens til å flytte langs den ytre overflaten av microcapillary når væske er utlevert på grunn av lavere overflatespenningen. Det er viktig å være svært nær rutenettet overflaten å hindre slike tap.
    6. Dispensere 5 nL av prøven på rutenettet. På en tørr dag, når rask fordampning foregår på microcapillary spissen, kan en også langsomt dispensere til prøven er helt på tuppen, og deretter raskt dispensere 5 nL.
    7. Ta ut microcapillary og la betinget prøven tørr sakte på duggpunkt scenen (DP-scenen).
    8. Når prøven stedet har tørket, fjerne rutenettet og oppbevares ved romtemperatur i et rutenett eller Petriskål.
    9. Dispensere 500 nL systemet væske fra microcapillary og fjerne den med en lofri vev. Skyll av kapillær 5 ganger med etanol, vaskemiddel eller 1 M NaOH. Dette fjerner microcapillary slik at den kan brukes med en annen prøve.

2. Cryo rutenettet forberedelse

  1. For å forberede instrument og utvalg, følger du trinnene 1.1 til 1,5 beskrevet ovenfor. Hvis NS ikke er nødvendig, utelater du trinn 1.3 og 1.5.2. Å utveksle eksempel bufferen eller betingelse for cryo-EM utvalg av dialyse, f.ekså redusere konsentrasjonen av buffer salter eller for å innføre tilsetningsstoffer (f.eks, trehalose, vaskemidler) bruke den ønskede bufferen i stedet for NS i trinn 1.3 og 1.5.2.
  2. Forbered flytende etan i standard cryo beholder.
    1. Montere etan cup, cryo boksen holder og edderkopp og fylle beholderen cryogen til randen med flytende nitrogen; vanligvis krever ca 200 mL. Vent noen minutter før etan koppen avkjølt, uten flytende nitrogen.
    2. Åpne etan gass flasken og sakte la gasstrømmen i etan koppen. La den fylle med flytende etan før er 2-3 mm under toppen; Dette tar et par minutter og krever ca 5 mL av flytende etan.
    3. Ta en cryo-boksen og plasserer den i en ledig slot i beholderen cryogen.
    4. Fjerne edderkoppen, plasser polystyrol lokket på toppen og plassere beholderen cryogen på montering i cryoWriter.
  3. Glød utslipp et EM rutenett.
    1. Ta et stykke selvklebende tape og en polydimethylsiloxane (PDMS)-blokk og rengjør oversiden PDMS ved å bruke og fjerne teip (fjerner støv). Sett PDMS blokken i en Petriskål.
    2. Nøye velge et rutenett i rutenett-boksen. Sørg for å ta bare kanten av rutenettet med pinsett. Plass den på en ren PDMS blokk med holey karbon filmen vendt oppover.
    3. Sted PDMS blokk med rutenettet i en plasma renere og plasma-clean rutenettet overflaten (f.eks bruk 75% Ar/25% H2, makt 50 W, press 25 mTorr). Plass PDMS blokken med glød-utladet rutenettet i en Petriskål.
  4. Riktig rutenettet i apparatet
    1. Forstå glød-utladet rutenettet med cryoWriter pinsett. Kontroller at elektromagnet er aktivert. ellers slå den på i programvaren. Montere pinsett på elektromagnet og bruke manuelle micromanipulator skruen til å justere rutenettet flatt på scenen, karbon film siden opp.
    2. Dobbeltklikk på "grid_save". Juster microcapillary posisjon slik at spissen er ca 10 µm over rutenettet overflaten. Kontroller at microcapillary kan bevege seg fritt over rutenettet uten berørende det hvor som helst, hvis nødvendig trekke microcapillary noen få mikrometer.
    3. Gå tilbake til midten av rutenettet og lagre den nye stillingen som "rutenett".
      Forsiktig: Riktig navn er obligatorisk for makro-skript til å fungere.
  5. Skrive prøven og styrter frostvæske rutenett.
    1. Spyle microcapillary med noen titalls nanoliters av systemet, og fjerne noen dråper fra microcapillary med en lofri vev.
    2. Starte makroskript. Makroen skal utføre følgende trinn:
      1. Dispensere 5 nL (for å fjerne eventuelle luftbobler på spissen) og gå til prøveposisjon.
      2. Leveringstanken 65 nL av prøven. Infundere 5 nL tilbake til eksempel røret. Dette står for systemet tilbakeslag og lar synkroniserte skriving, dvs., for å sikre at dispensing og scenen bevegelse start samtidig.
      3. Flytt til "rutenett" posisjon.
      4. Starte 'skrive mønster", som vil føre microcapillary å flytte over rutenettet samtidig dispensing 45 nL av prøven.
      5. Etterpå flytte microcapillary tilbake til midten av rutenettet senke den en annen 10 µm, og ta ut overskytende eksempel væske.
      6. Ta ut microcapillary og slå av elektromagnet. Dette frigir pinsett og starter spranget frysing.
  6. Grip pinsett og nøye løslate magnetiske kortet fra stempelet. Raskt overføre rutenettet fra etan cup i beholderen cryogen som inneholder boksen cryo og sette rutenettet i en ledig slot.

3. én celle Lysate forberedelse

  1. Forberede microcapillaries electroporation.
    Merk: Konisk (laser-trukket og inspiserte) smeltet silica microcapillaries har en beskytte polyimid (pi) belegg på utsiden, med unntak av spissen, hvor belegget er brent under tapering prosessen.
    1. For å coat microcapillaries med en ledende lag, montere dem i en vinkel på 45° på et metall jernbane, med tips pekende oppover. Bruk en aluminiumsfolie for å skjerme den nedre enden (2 cm) tips, da ubestrøket polyimid (pi) danner den beste seglet med trykk-fit kontaktene ansatt senere.
    2. Frese sette et klebrig lag 20 nm Ti/W, og deretter en 200 nm-tykt lag av Pt.
  2. Endre microcapillary spissen hydrofobe.
    1. Forberede en 1 M løsning av 1-dodecanethiol i EtOH.
    2. Glød-utslipp microcapillary i luften for 1 min med 100 W strøm på 0,4 mbar.
    3. Senk spissen av microcapillary i 1 M løsning av 1-dodecanethiol for et par timer (ideelt over natten).
      Merk: Det er best å forberede tips fersk en dag før bruk.
  3. Installere en ny microcapillary.
    1. Fjerne microcapillary fra 1-dodecanethiol løsning, skyll utsiden med etanol og skyll innsiden med etanol bruker en sprøyte.
      Merk: Hvis det finnes ingen functionalized microcapillaries, raskt glød utslipp spissen av en microcapillary og dyppe den i en dråpe kommersielle bilen vindu behandling, som er en blanding av PDMS og svovelsyre. Den resulterende hydrofobe functionalization er ikke så med 1-dodecanethiol, men vanligvis tilstrekkelig.
    2. Cleave ubestrøket enden med kapillær kniv.
      Merk: Et rent kutt er viktig for en god tetning med trykk-fit-kontakt.
    3. Bruk en tannpirker gjelder sølv lim for skarp grensen dannet mellom glass og polyimid (pi) belegg når polyimid (pi) belegg ble brent av laser under kapillær trekke.
      Merk: Denne forsterkning er nødvendig som Pt belegget er veldig svak i denne regionen, og elektriske gjennomføring kan brytes.
    4. Vask polyimid (pi) slutten av microcapillary med aceton. La en liten dråpe aceton på slutten og sette den inn i hullet av trykk-plass koblingen. Bruke lett trykk å danne en god tetning.
  4. Kalibrere microcapillary posisjon.
    1. Slå på apparatet og start programmet som beskrevet i trinn 1.1. I tillegg initialisere mikroskop kameraet og funksjonsgenerator.
    2. Plass en barometer microscope skyve inn lysbildeholderen på mikroskopet.
    3. Lavere microcapillary glass lysbilde og center det over mikroskopet målet til den vises i mikroskopet kameravisningen. Bruk x - og y-akse lineær stadier for å plassere spissen av microcapillary i midten av bildet. Deretter sakte senke spissen til det litt berører av objektglass.
      Forsiktig: Velg meget liten skritt (5 µm) mot den endelige tilnærmingen. Ellers kan spissen være skadet.
    4. Trykk på "Kalibrere munnstykke". Dette trekkes i microcapillary 40 mm, og setter dette posisjon som hjem posisjon.
  5. Utarbeidelse av stemplet PDMS stykker og ITO lysbilder
    1. Blanding PDMS og crosslinker i 10:1 ratio, hell i en stor Petriskål til en dybde på ca 2-3 mm. stek ved 60° C for et par timer i hybridisering inkubator eller lignende enhet.
    2. Med en hammer og frimerke (12 mm diameter), skjære hull i PDMS laget. Etterpå bruk skalpell for å kutte ut 2 cm lange ruter eller rektangler inkludert hullene for å få stemplet brikker som passer på en microscope skyve. Vanligvis er to stemplet deler montert på en microscope skyve.
    3. Vask PDMS bitene og ITO lysbildene først med vaskemiddel og deretter med 70% etanol. Plassere dem, våt, i en Petriskål og la etanol fullt fordampe i en ovn ved 60° C.
    4. Glød-utslipp ITO lysbilder for 1 min med 100 W strøm på 0,4 mbar og deretter bruke 1 mL av belegg løsning (f.ekspoly-L-lysine (PLL)). Inkuber i 5 min, fjerne løsningen med en pipette og bruke 1 mL av ddH2O. litt agitere for 1 min, og fjern deretter ddH2O bruker en pipette. La lysbildene tørr på 60° C.
  6. Forberede cellekultur. Følg tilhenger-celle dyrking standardprotokoll (f.eksArnold, et al. 24 , 25). frø celler på ITO under normale splitting/passaging kjører.
    1. Ta en fersk PLL-belagt ITO lysbilde og legge litt PDMS. Bruke litt press å danne et vanntett segl. Dette gir liten brønner med lysbildet som base.
    2. Legge til ca 300 µL av celler suspendert i frisk medium PDMS fordelt. Seeding tetthet bør være rundt 75 000 celler per brønn.
    3. Inkuber ITO lysbildene i 1-2 dager under standard betingelser.
  7. Klargjør celle lysis eksperiment:
    1. Forvarm noen ml electroporation bufferen (f.eksfosfat bufret saltvann (PBS)).
    2. Forberede oppsett NS-EM rutenettet forberedelse
      Merk: Detaljer for å forberede oppsettet vises i trinn 1.1-1.5 (ns) eller trinn 2.1-2,4 (for cryo). Her beskriver vi de viktigste trinnene for NS-forberedelse.
      1. Forberede NS ved å fylle en 100 eller 200 µL PCR tube med 100-150 µL av NS (f.eks, kommersielt tilgjengelig 2% methylamine tungstate). Sett røret på avkjølt eksempel støtte av instrumentet.
      2. Flytt microcapillary til NS PCR røret, dyppe spissen i NS løsningen og lagre denne posisjonen som "flekken".
    3. Laste inn parameterne standard lysis, f.eks, lyse spenningen.
    4. Ta ITO lysbildet settefiskanlegg og montere den på mikroskopet innsatsen. Bruke to skruer fikse lysbildet på aluminium innsatsen og sikre elektrisk kontakt mellom ITO belegg av lysbildet og elektrisk jordet aluminiumsramme.
    5. Fjerne celle kultur medium og vask to ganger med 300 µL electroporation bufferen. Holde cellene i electroporation buffer.
    6. Sted aluminium sett holde ITO lysbildet i live-celle inkubator scenen på oppsettet.
    7. Finn cellekultur i visningen mikroskop og velge et område med noen celler. Nærmer spissen på ITO overflaten og forsiktig røre den, og trekke tips 100 µm og lagre som "celler".
    8. Raskt la cellekultur og tømme microcapillary spissen med et par titalls nanoliters av systemet for å sette det inn i cellen kulturen igjen. Støte noen nanoliters under nedsenking i brønnen PDMS å sikre at ingen luft boblene er fanget på spissen.
    9. Forsiktig tilnærming ITO overflaten (i utgangspunktet må du være i posisjon "celler", dvs., 100 µm over overflaten). Ved kontakt, trekke tips 10 µm.
    10. Velg en nærliggende celle for lysis. Plassere microcapillary over målrettede cellen.
  8. Starte makro script encellede lysis.
    1. Navnet posisjonen i microcapillary skal flyttes til når en celle har vært vellykket lysed. Dette blir NS reservoaret (NS-EM), en avsalting buffer (cryo-EM) eller EM rutenettet (cryo-EM). Unngå skrivefeil og trykk "ok".
    2. Makroen fortsetter uten brukermedvirkning:
      1. i) av mikroskopet scenen og celle kultur 100 µm flyttes til venstre, et øyeblikksbilde av målrettet cellen er tatt, og 50 nL ddH2O systemet væske er utlevert fra microcapillary. Dette fortrenger og utvanner høy salt bufferen som gjelder osmotisk Trykk for cellen.
      2. II) scenen er flyttet tilbake til plasser tuppen over målrettede cellen igjen. Forhåndsdefinerte spenning utbrudd brukes, og etter 500 ms pumpesystem starter inneholder 3 nL av eksempel på en flow rate på 2 µL/min.
      3. III) scenen er flyttet til venstre igjen, slik at cellen undersøke. Et vindu vises, ber brukeren om informasjon.
    3. Si om lysis trinnet var vellykket eller ikke.
      1. Hvis svaret er nei, overta, flush på microcapillary og målrette en ny celle.
      2. Hvis svaret er ja, et øyeblikksbilde av fjernet (lysed) cellen er tatt, og etterpå microcapillary flyttes til plasseringen angitt i 3.8.1. Hvis dette er NS eller et buffer reservoar, bruker standard-brukergrensesnittet til å dispensere 3 x 0,5 nL væske mens microcapillary flyttes til kontrollere at ingen luftbobler. Spissen er nedsenket i reservoaret væsken makroen.
        Merk: Du kan fortsette å tilstand prøven og forberede rutenett som forklart i avsnitt 1.6.9 - 1.7.9 for NS-EM eller inndelingen 2.2-2.6 for cryo-EM. Nedenfor forklares fremgangsmåten for NS-rutenettet forberedelse.
    4. La microcapillary midt i 8-12 minutter, avhengig av dysen geometri
      Merk: Høyt fosfat konsentrasjonen i bufferen krever en lengre nedsenkningstid for condition.
    5. Dispensere 5 nL betinget cellen lysate på rutenettet.
    6. Ta ut microcapillary og la betinget prøven tørr sakte på duggpunkt scenen (DP-scenen) regulert 1-2° C over duggpunkt temperaturen.
    7. Fjern rutenettet og oppbevares ved romtemperatur i et rutenett eller Petriskål.

Representative Results

"CryoWriter" oppsettet ble utviklet (avbildet i figur 2) for å teste miniatyriserte EM rutenettet forberedelse prosedyrene foreslått i figur 1C, D. Figur 2 En viser en oversikt over forskjellige komponenter montert en omvendt fluorescens mikroskop. En celle-dyrking modulen er installert på venstre side av mikroskopet; en modul for EM rutenettet forberedelse ligger til høyre. Modulen celle-dyrking (figur 2B) tillater veksten av tilhenger eukaryote celler og live-celle imaging celle kultur av lys mikroskopet. Individuelle celler er lysed av den kombinerte virkningen av osmotisk sjokk, electroporation og aspirasjon av celleinnholdet i en microcapillary (figur 2B, figur 6en)24,25. Aspirerede lysate prøven kan deretter brukes til å forberede rutenett for NS - eller cryo-EM. Alternativt kan en lager protein løsning i et PCR-rør være prøvekilden. Microcapillary (figur 2B) ansatt er koblet til en høy presisjon pumpesystem slik at prøven volumer pustende og utlevert med sub-nL presisjon. Som beskrevet i protokoller utføres alle prøve behandling i denne microcapillary eller på EM rutenettet selv uten signifikant utvalg transport. For eksempel brukes den samme microcapillary til å lyse individuelle eukaryote celler, Sug opp den lysate, tilstanden den og til slutt kvitte dele på EM rutenett. Rutenettet forberedelse modulen består av et bevegelig DP-stadium som tillater temperaturen på EM rutenettet plassert på det skal presist kontrollert (figur 2C). For NS-TEM, forberedt eksempel rutenettet deretter bare fjernet fra kalde scenen og lov til å tørke i luften ved romtemperatur. Imidlertid må såkalte kaffe-ring effektene som kan føre til deretter unngås for kvantitative TEM der protein 'partikler' telles. Gjør er rutenett tørket sakte på DP-scenen med en gradvis økende temperaturgradient tregere flytende fordampning. Cryo-EM, er temperaturen på rutenettet holdt nær duggpunkt; en positiv forskyvning på ca 8 ° C er valgt, tillater kontrollert fordampning av prøven væske for tynnfilm stabilisering og tynning, som kan overvåkes av en sensor eventuelt26. Etter tynning starttiden, aktiveres en pick-og-styrter mekanisme og prøven er vitrified (figur 2C). Merk at denne stuper mekanismen ikke er nødvendig for NS-EM rutenett, som lagres i romtemperatur.

Figure 2
Figur 2: oversikt av cryoWriter. A) oversikt av cryoWriter montert på en omvendt lys-mikroskopet (1). B) rammemargen i området vises til venstre i panelet A. celle dyrking rom (2), med en microcapillary (3) for eksempel manipulasjon og celle lysis plassert over en miniatyriserte PDMS-baserte celle kultur plate (4). C) rammemargen i området vises til høyre i panelet A. 'Pick-og-styrter"mekanisme. Et holey karbon filmen EM rutenett (5) er montert mellom tips pinsett (6) og plassert vannrett i direkte kontakt med temperaturkontrollert scenen (7), kalt duggpunkt scenen (DP-scenen) i hovedteksten. Scenen temperaturen er strengt kontrollert via en PID-kontroller og en vannkjølt Peltier-element, holder den på eller nær duggpunkt temperatur, avhengig av ambient miljøet. DP-scenen (7) er montert på en motorisert xy-akse flytte rutenettet i forhold til microcapillary. Microcapillary selv kan er montert på en z-scene og senkes til det er svært nær overflaten av EM rutenettet og brukes til å dispensere nanoliter store volumer bort på sample støtte dekker det (en kontinuerlig tynn karbon lag for NS-EM eller en holey karbon film for cr Yo-EM). Merk at flytende opptak og dispensing utføres ved hjelp av en høy presisjon pumpesystem (8). Utlevert væsken kan distribueres ved å flytte rutenettet i forhold til microcapillary i en spiral-mønster. For cryo-EM forberedelse overfører pick-og-styrter frysing mekanismen (9) raskt eksempel lastet rutenettet til flytende etan (10) for rask nedkjøling og prøve vitrifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 viser representant resultatene for NS-EM rutenett forberedt bruk cryoWriter. Spissen av microcapillary var lastet med 5 nL eksempel fra en lagerløsning og dyppet i et reservoar av NS løsning (2% methylamine tungstate) i flere minutter å tillate diffusive utveksling av NS og salt ioner (teoretisk informasjon se Arnold, et Al. 24). etterpå betinget prøven ble utlevert til tynne karbon filmen en NS-EM rutenettet og tørket. Figur 3 En viser bruk av et spor rutenett på samme måte å visualisere komplett slippverktøyet, som kreves for kvantitative TEM. For å unngå kaffe ring effekten, var fersk glød-utladet rutenettet opprinnelig holdt på duggpunkt temperaturen (ingen fordampning) og deretter sakte varmet opp på DP-scenen. Merk, at for de fleste programmer (f.eks, kvalitetskontroll av prøve eller strukturelle analysen) langsom-tørking prosessen ikke er nødvendig. Høy kvalitet NS-preparater oppnås uten den, som vist i Figur 3B, C. Condition tider for fosfat-gratis lav salt buffere er rundt 3 min, f.eksmed lav-salt Tris-buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4 med 50 mM NaCl), som vist i Figur 3B bruker tobakk mosaikk virus (TMV) som eksempel. Figur 3 C presenterer et verstefalls scenario som TMV var i PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.4). Fosfat ioner danne forbigående krystaller med heavy-metal-ioner av NS (se figur 5C), forlenge condition tidsbruken (7 minutter). Andre tungmetallsalt kan også brukes med rutenett forberedelse modulen, f.eks, 2% methylamine vanadate eller ammonium molybdate (se også Arnold, et al. 24). uranyl acetate er imidlertid ikke passer; crosslinking effekten av denne flekken fører til aggregater hvis protein prøven er betinget i løsningen før adsorpsjon til en karbon film (se figur 5E)23.

Figure 3
Figur 3: typiske resultater for NS rutenett forberedt bruk cryoWriter som vist i figur 1C. A) oversikt bilde av en 3 nL dråpe utlevert på et spor rutenett etter condition med 2% methylamine tungstate. B) TMV 20 mM TRIS buffer. Rammemargen viser en 3 x utvidelse av den angitte området. Tilpasset fra Arnold, et al.24 (ytterligere tillatelser gjelder materialet Hentet rettes til ACS). C) tobakk mosaikk virus (TMV) i PBS buffer. Rammemargen viser en 3 x utvidelse av den angitte området. Tilpasset fra Arnold, et al.24 (ytterligere tillatelser gjelder materialet Hentet rettes til ACS). Skalere barer: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Typisk resultatene for cryo-EM rutenett forberedt bruk cryoWriter er avbildet i Figur 4. Panelet 4A viser et rutenett atlas av området som dekkes av vitrified prøven. Panelet 4B viser homogenitet av glasslegemet isen i et valgt rutenett sporet. I begge tilfeller var utvalget i 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl bufferen som inneholder 0,05% Fos 14 vaskemiddel. Mange prøver og buffere ble testet og en tilsvarende høy kvalitet glasslegemet is ble innhentet, men vilkårene som kreves er buffer avhengige (se diskusjon av figur 5). Panelet 4C viser apoferritin partikler og en bacteriophage i Tris-HCl buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4) avbildet på høy defokus å øke kontrasten. Panelet 4D viser et 200 kDa membran protein stabiliseres ved amphipoles.

Figure 4
Figur 4: typiske resultater for cryo-EM rutenett forberedt bruk cryoWriter som vist i figur 1D. Prøvene og bufferne varierer i eksemplene vises. Alle prøvene var lastet holey karbon filmer. A) Collage av oversikt bilder ("rutenett atlas") av et utvalg som inneholder en 150 kDa membran protein, utkanten av glasslegemet isen er angitt med hvite piler. B) forstørret rutenett sporet fra et rutenett med samme bufferen, viser holey karbon filmen med glasslegemet is. Noen hull er ikke fylt med eksempel bufferen som indikert av hvite pilene. C) karbon hullet med vitrified eksempel som inneholder apoferritin protein komplekser og bacteriophages. Innfelt: todelt forstørrelse viser halen av en bacteriophage. Den hvite stjernen angir karbon filmen. Legg merke til at bildet ble spilt inn med høy defokus å øke kontrasten. D) en 200 kDa membran protein rekonstituert i amphipols. Innfelt: en 2 x forstørrelse på den angitte området vises med økt kontrast. Skalere barer: A, 100 µm; B, 10 µm; C og D, 80 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

CryoWriter oppsettet tillater systematisk screening for optimal EM-rutenettet forberedelse forhold; et eksempel er vist i figur 5et (apoferritin i 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, 0,05% Fos 14). I dette eksperimentet, glasslegemet isen "tynt" temperatur var variert, men tynt tiden (dvs., den tid gapet mellom eksempelprogram og styrter frysing) forble konstant (1 s). Ved lave offset temperaturer (f.eks, 8 K) var prøve laget for tykk. Offset temperaturer, glasslegemet isen i hullene var tynnere (10 K, 12 K) til på et tidspunkt (over 18 K) rutenettet ble fullstendig tørke (ikke vist). I resultatene presentert her en forskyvning av 12 K føre til et stort homogen område av glasslegemet is som angis av pilene, svart. Slike optimalisering eksperimenter kan utføres med bufferen på målet utvalget bruke "test" proteiner (for eksempel apoferritin). De beste forholdene funnet brukes deretter til målet prøven. Videre rutenett med parametere langt fra optimal kan ofte bli gjenkjent under forberedelse prosedyren og trenger ikke å bli vist i elektronmikroskop, sparer betydelig tid. Figur 5 viser også et galleri av typiske cryo-EM (Panel B) og NS-EM (paneler C e) gjenstander gjelder for cryoWriter oppsettet. Cryo-EM rutenettet vises i panelet 5B med TMV i PBS med 0,1% decyl-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM) var overdrevet tynnet. Bakgrunnen av bildet er kornete fordi salt konsentrasjonen ble for høy. Vanligvis synes utseendet til et utvalg ikke å være en lineær funksjon av saltkonsentrasjon; korn blitt plutselig fremtredende når en terskel konsentrasjon er nådd under prosessen med tynning. Merk at uønskede stoffer fjernes ved et condition skritt før rutenettet forberedelse, som NS-EM i protokollen delen 1.6. NS kan forårsake andre gjenstander. I eksemplet som vises i panelet 5C, PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.4) uten prøven var betinget i 2% methylamine tungstate for 3 min. Precipitates og krystaller er tydelig og utøve omfattende styrker på karbon overflaten fører til sprekker. Precipitates eneste skjemaet i en bestemt PBS og NS konsentrasjon varierer og kan unngås ved condition utvalget for lengre (sammenlign Figur 3C). Panelet 5D viser utkanten av en utlevert NS eksempel dråpe viser en "kaffe ring". Dette vil forstyrre kvantitativ, total eksempel analyse og kan unngås ved å bremse ned tørkeprosessen, dvs, ved å holde EM rutenettet ved duggpunkt temperatur under eksempelprogram, og deretter gradvis øke temperaturen å tørke den) se Figur 3A). Panelet 5E (apoferritin 20 mM HEPES, pH 7.0, betinget 3 min) viser crosslinking aktiviteten til 2% uranyl acetate flekken, som ikke kan brukes til tilstanden protein prøver før de er adsorbert til karbon filmen støtter.

Figure 5
Figur 5: systematisk endringer og gjenstander observert når cryoWriter oppsettet ble brukt til å forberede rutenett for NS - og cryo-EM. A) systematisk glasslegemet is tykkelse variasjon; optimalisering av rutenettet forberedelse til cryo-EM. Offset temperaturen på DP-scenen var variert (8 K til 12 K) holde tynning tiden konstant (1 s). Pilene angir utkanten av prøven laget. B) Salt effekter; for Høykonsentrert, var dvsthinning trinnet for langt. Rammemargen viser en 2 x forstørrelse av den angitte området. C) Salt precipitates dannet av PBS buffer i nærvær av tungmetallsalt. Prøver som inneholder PBS bufferen må være betinget lenger enn prøvene i andre buffere. Her var PBS buffer uten prøven betinget i 2% methylamine tungstate for 3 min, en typisk tid for andre prøve buffere. Note sprekken i karbon filmen sannsynligvis på grunn av de sterke styrkene precipitates opptrer på tynn støtte i tørking prosessen. D) "Kaffe ring" effekt. E) Apoferritin betinget i 2% uranyl acetate for 3 min. Uranyl ioner viser betydelig crosslinking aktivitet og apoferritin klynger skjemaet store mengder. Skalere barer: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den lite og volum kreves for EM rutenettet forberedelse bruk cryoWriter gjør nye typer eksperimenter. For eksempel kan totalt innholdet i en enkeltcelle, samles og forberedt for NS - og cryo-EM. Prosedyren er angitt i figur 6en. En tilhenger, eukaryote celle (HEK 293) er lysed av samtidige electroporation og prøve aspirasjon (Panel 6A)25. Et totalt volum på 3 nL er pustende, som inneholder cellen lysate, og beholdes i microcapillary for videre behandling. For NS-EM vises i panelet 6B, ble celle-dyrking mediet utvekslet med PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.4) før cellen lysis. Innholdet ble pustende i 3 nL bufferen og betinget i et reservoar av NS som vist i figur 1C for 10 min. etterpå, en 5 nL volumet ble utlevert til kontinuerlig karbon filmen en NS-EM rutenettet. Individuelle proteiner, f.eks, trådformede utgangen og membran oppdateringer med vedlagte proteiner kan gjenkjennes i bildet. For cryo-EM, som vist i figur6 C, en mengde 3 nL ble utlevert på en holey karbon EM rutenettet uten re aspirasjon fjerne væske. Relativt tykk filmen av prøve dannet var mye tynnet før vitrifikasjon. Dette gjør økt DP-trinns temperaturen gradvis, starter på duggpunkt temperaturen. Thinning prosessen ble overvåket av en sanntid sensor-systemet til en pre-spesifiserte terskel ble nådd utløsing av "pick-og-styrter" mekanisme og prøve vitrifikasjon (for detaljer se Arnold, et al. 26). membran strukturer og proteiner kan gjenkjennes i bildet.

Figure 6
Figur 6: enkelt celle visuelle Proteomikk bruker cryoWriter oppsett. A) Lysis av en enkelt tilhenger eukaryote celle. Cellen er dyrket (1, grønn) på en functionalized, ITO belagt (rød) glass-lysbilde (2) i en miniatyriserte Petriskål (3)25. ITO laget er elektrisk jordet. Cellen er kontaktet av microcapillary (4), som er belagt med platina. En første osmotisk sjokket (ikke angitt) er gitt til rette lysis, som er utført av en rekke elektriske pulser og skjær krefter utøvde under aspirasjon av cellen lysate. Prosessen kan overvåkes av * lys; linsen av mikroskopet er angitt (5). For detaljer, se vår tidligere arbeid24,25. B) NS-EM bildet av lysate fra en enkelt HEK 293-celle. Trådformede utgangen og membran flekker med vedlagte proteiner er synlig. Panelet tilpasset fra Arnold, et al.24 (ytterligere tillatelser gjelder materialet Hentet rettes til ACS). C) Cryo-EM bildet av lysate fra en enkelt HEK 293-celle. Rammemargen viser en 2 x forstørrelse av den angitte området der typisk membran strukturer med tilhørende proteiner er synlige. Panelet C tilpasset fra Arnold, et al. 26 skala barer: B, 50 nm; C, 80 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

'CryoWriter' instrumentet og protokollene som kreves for å forberede eksempelliste nett for NS - og cryo-EM fra nL størrelse totale eksempel volumer og helt unngå klassisk papir-blotting trinnet presenteres. Microfluidic prinsipper og et micromechanical kombineres i cryoWriter å gjøre dette mulig.

Vår erfaring viser at når miniatyriserte metodene i dette manuskriptet brukes parameteren plass til EM-rutenettet forberedelse er større enn klassisk metoder og strammere brukerstyrt. Viktigere, gjør den økte reproduserbarhet oppnådd det mulig å pre-skjermen med eksempel buffer system, supplert med en lett tilgjengelig test protein, til å bestemme de optimale parameterne før det aktuelle eksperimentet utføres. Dette holder forbruk av prøven av interesse til absolutte minimum anbefales. Avgjørende skritt for begge NS - og cryo-EM rutenettet forberedelse er: (i) grunning av pumpen; for sub-nanoliter volum dispensering, systemet væske (vann) skal degassed og bubble gratis. (ii) nøyaktig kontroll av glød utslipp eller plasma rengjøring trinn; overflaten kjennetegner EM rutenettet er avgjørende for reproduserbar resultater. (iii) eksempel condition; tiden som kreves for condition, f.eksmed NS, avhenger på bufferen type, saltinnhold og konsentrasjon (Figur 3), samt på munnstykket geometrien i microcapillary24. (iv) fordampning priser for NS-EM forberedelser for kvantitative EM; kaffe-ring effekten kan forby kvantitativ analyse NS-EM forberedelser, og må undertrykkes av langsom fordampning priser kontrollert av DP-scenen.

Ulike aspekter av presentert rutenettet forberedelse metoder kan kombineres fritt slik at utviklingen av allsidig protokoller for spesielle prøver. Typiske eksempler ville være fjerning av et stoff som hindrer høyoppløselig EM, f.eks, glyserol, et steg condition før rutenettet forberedelse til cryo-EM; innføring av megler molekyler, som ligander, ved condition før rutenettene er beredt, eller undersøkelse av enkelt celle lysate av NS - eller cryo-EM (figur 6).

Bruk av microfluidics og minimal eksempel beløp i metodene presentert fjerner fullstendig behovet for papir-blotting trinnene. Dette er en stor fordel, fordi papir blotting er en hard behandling for proteiner, potensielt forurensende prøven med uønskede ioner og iboende fører til massiv utvalg tap. På den annen side, unngås potensielt effekten av luft-vann-grensesnittet i tynne eksempel filmen dannet når cryo-EM prøver er forberedt på den klassiske måten ikke når cryoWriter brukes. Rutenett egnet for cryo-EM kan tilberedes med en mindre enn 0,2 s ventetiden mellom eksempelprogram og vitrifikasjon (data ikke vist). Men som proteiner reiser et par tiendedeler av en nanometer i noen nanosekunder med diffusjon, er det fortsatt nok tid for dem å kollidere med luft-vann-grensesnittet av en 100 nm tykk eksempel film flere ganger. Men hvor mye proteiner stikker i luft-vann-grensesnittet kan reduseres betydelig ved disse kort tid-huller og kan hindre protein rødsprit eller begrenset partikler retning. En annen lovende tilnærming som kan beskytte sensitive proteiner i luft-vann-grensesnittet er å dekke eksempel filmen med lav molekylvekt overflateaktive stoffer. Forbindelsene kan bli raskt introdusert av et condition skritt i cryoWriter før rutenettet forberedelse. Høy er overflate-til-volum microfluidic systemer en ytterligere begrensning av cryoWriter, som eksempel potensielt gå tapt ved uspesifikke adsorpsjon til microcapillary overflaten og forstyrre kvantitativ analyse av partikkel opptellingen. Problemet behandles på to måter: først prøven ikke reise lange avstander i microcapillary. Faktisk gjenstår nanoliter eksempel volumet på kapillære spissen hele behandlingen. Andre overflaten til volumkontrollen reduseres ytterligere ved å bruke microcapillaries med store indre diameter, f.eks, 180 µm. tredje, overflater av microcapillaries kan være enkelt passivated om nødvendig f.eksved å behandle dem med kommersielt tilgjengelig polylysine etanol glycols (PLL-PEG).

Høyoppløselig analyse av proteiner av én partikkel tilnærming brukes i EM krever bare 100 000 til noen millioner bilder av personlige protein partikler. Dette betyr at microfluidic teknikker kan gi nok protein komplekser for strukturelle etterforskningen. Miniatyriserte immuno-nedbør metode for rask isolering av protein komplekser (rundt 1 time) fra minimal celle beløp (ca. 40.000 celler) ble utviklet tidligere28. Denne metoden vil nå være direkte knyttet til miniatyriserte eksempel forberedelsen scene av cryoWriter. Det endelige målet er å utvikle en integrert microfluidic rørledning for ultra-rask protein isolasjon og cryo-EM rutenettet forberedelse som krever mindre enn to timer i alle. Videre, som demonstrert av figur 6minutt mengden og mengden materiale som er nødvendig for eksempel forberedelse og nesten lossless condition og rutenettet forberedelse prosedyre ved hjelp av cryoWriter, gjør det mulig å studere protein komplekser individuelle celler. Sammen legge miniatyriserte immuno-nedbør metoden og cryoWriter grunnlaget for en ny Proteomikk metode kalt "enkelt celle visuelle Proteomikk", som vi nylig demonstrert for varme-shock eksperimenter24. Data analysealgoritmer rettet til analyse av "visuelle Proteomikk" bilder blir nå testet.

Disclosures

Forfatterne Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg og Thomas Braun erklære den konkurrerende økonomisk interessen: cryoWriter konseptet er en del av patentsøknad PCT / EP2015/065398 og EP16194230.

Acknowledgments

Forfatterne gjerne takke verkstedet til Biozentrum av universitet Basel for deres støtte, S. A. Müller for viktige diskusjoner og nøye lese manuskriptet, A. Fecteau-og teknisk hjelp med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann for membran protein test prøver (alle fra C-CINA, Biozentrum, Universitetet i Basel) og A. Engel, emeritus universitet Basel for hans inspirerende samtaler. Test prøver fotograferingen av P. Ringler, M.-A. Mahi, og T. Schwede (Biozentrum, Universitetet i Basel), P. Leiman (Laboratory av strukturell biologi og biofysikk, EPFL) og R. Diaz-Avalos (New York strukturell biologi Center, USA). Prosjektet ble støttet av sveitsiske nanovitenskap Institute (SNI, prosjektet P1401, ARGOVIA prosjektet MiPIS) og sveitsiske National Science Foundation (SNF, prosjektet 200021_162521).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liquid handling
Microcapillary tip New Objective FS360-100-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
FS360-150-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve New Objective CONGAS-1  Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing BGB-Analytik TSP-150375 TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector BGB-Analytik 2525LD Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 
Syringe 10 µl BGB-Analytik HA-80001 Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included) 
Syringe pump controller Cetoni A3921000093 neMESYS controller
Syringe pump dosing unit Cetoni A3921000095 neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor Meltec UFT75-AT Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor Sensorshop24.ch LS7-PT1000-1.0-3L Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller Cooltronic TC2812  PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element Distrelec.ch PE-127-14-15-S 40x40 mm
Water-cooling block - - Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump Digitec.ch 294877 XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block - - Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers PCHC.ch 223050 Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements Distrelec.ch PE-031-10-15-S Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis Dyneos AG M-404.2PD High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller Dyneos AG C-863 Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage Prior Scientific H117EIL5 Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets Supermagnete S-05-08-N Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet Schramme EG1025A02/110 Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet Conrad.ch MST-1630.001 7 Electromagnet control PCB board
Solenoid hub Distrelec.ch HD8286-R-F-24V100% Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers Electron Microscopy Sciences 0302-M5S-PS Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts Thorlabs - -
Various mechanical parts Workshop Biozentrum, University Basel - Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode Thorlabs CPS780S 780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector Thorlabs PDA100A-EC Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM emsdiasum.com DTF-03523 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS Sigma D8537 SIGMA Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2% nanoprobes.com Negative stain vanadium based
NanoW 2% nanoprobes.com Negative stain tungsten based
Software
openBEB The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin) Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrandt, W. Biochemistry: The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  3. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
  4. Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. Electron microscopy of frozen biological suspensions. J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).
  5. Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation damage in electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. , (2010).
  6. Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. Electron gun using a field emission source. Rev Sci Instrum. , (2003).
  7. Zemlin, F. Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy. Micron. 25 (3), 223-226 (1994).
  8. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  9. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  10. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat methods. 10, 584-590 (2013).
  11. Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).
  12. Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy. J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).
  13. Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors. J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).
  14. Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  15. Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. Processing of Cryo-EM movie data. Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).
  16. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  17. McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy. J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).
  18. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  19. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  20. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  21. Glaeser, R. M. How good can cryo-EM become. Nat Methods. 13, 28-32 (2016).
  22. Engel, A. in . Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).
  23. Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. Connecting µ-fluidics to electron microscopy. J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).
  24. Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy. ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).
  25. Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy. J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).
  26. Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).
  27. Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements. BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).
  28. Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy. Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).

Tags

Biologi problemet 137 elektronmikroskop cryo negative flekker microfluidics eksempel condition visuell Proteomikk encellede lysis
Miniatyriserte eksempel forberedelse til overføring elektronmikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S.… More

Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S. A., Stohler, T., Syntychaki, A., Bieri, A., Albiez, S., Goldie, K. N., Chami, M., Stahlberg, H., Braun, T. Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (137), e57310, doi:10.3791/57310 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter