Summary
Vi præsenterer her, en nem at bruge og alsidig metode for at udføre live imaging af udviklingsmæssige processer i almindelighed og muskel-sene morfogenese navnlig i levende Drosophila pupper.
Abstract
Muskler sener og skelettet aktiverer dyr, herunder mennesker til at flytte deres kropsdele. Muskel morfogenese er meget bevaret fra dyr til mennesker. Derfor, den kraftfulde Drosophila modelsystem kan bruges til at studere begreberne muskel-sene udvikling, der kan også anvendes til menneskelige muskelbiologi. Her, beskriver vi i detaljer, hvordan morfogenese af voksen muskel-sene system kan være let afbildet i levende, udvikle Drosophila pupper. Derfor, metoden giver mulighed for at undersøge proteiner, celler og væv i deres fysiologiske miljø. Ud over en trinvis protokol med nyttige tips giver vi et samlet overblik over fluorescently tagged markør proteiner, der er egnet til at studere muskel-sene system. For at fremhæve de alsidige programmer i protokollen, vise vi eksempel film lige fra visualisering af langsigtede morfogenetiske begivenheder – forekommer på tidsskalaen i timer og dage-til visualisering af kortsigtede dynamiske processer som muskeltrækninger forekommer på tidsskala i sekunder. Tilsammen, bør denne protokol aktiverer læseren til at designe og udføre live imaging forsøg til undersøgelse af muskel-sene morfogenese i den intakte organisme.
Introduction
Apparatet muskel-sene tillader dyr, herunder mennesker til at flytte deres kropsdele. De molekylære byggesten af muskel-sene system er meget bevaret. Derfor kan begreber af muskel-sene udvikling relevante for menneskelig muskelbiologi, f.eks muskel morfogenese, muskel-sene vedhæftet fil og myofibril selvorganisering, studeres ved hjælp af Drosophila melanogaster som et let tilgængeligt modelsystem. Drosophila puppe systemet har flere eksperimentelle fordele. Først, på den puppe stadie – når de voksne muskler er dannet-organismen er siddende og derfor let at billede på et mikroskop i løbet af timer eller endda dage. For det andet, mange muskler form tæt nok nedenunder den puppe overflade, således at de kan være afbildet inde den intakte, delvist gennemsigtig organisme. For det tredje kan musklerne undersøges i deres naturlige miljø, hvor de er forbundet til det danner exoskeleton via senen celler og væv spændinger er bygget. Det er ikke muligt i musklen celle kultur systemer. Og endelig, et væld af genetiske værktøjer er tilgængelige i Drosophila. Blandt disse er mange fluorescently tagged markører, der giver mulighed for mærkning af specifikke celletyper eller subcellulært strukturer for imaging i vivo.
Tabel 1 sammenfatter de vigtigste markører, der anvendes til at studere muskel-sene morfogenese. Det omfatter markører overexpressed ved hjælp af GAL4-UAS-system1 og endogent mærkede protein markører2,3,4. Fordelen ved GAL4-UAS-system er, at markører er generelt udtrykt på et højt niveau, hvilket resulterer i et stærkt signal, der kan nemt være afbildet i hele-mount pupper. Derudover kan væv specificitet opnås ved at vælge GAL4 drivere omhyggeligt. Fordelen ved fusion proteiner udtrykt under endogen kontrol er at dynamikken i de respektive proteiner kan være studerede i vivo, mens de kan også bruges som markører for forskellige celletyper eller specifikke subcellulært strukturer, for eksempel, ΒPS-Integrin-NGL for muskel vedhæftet fil sites. Sammen, giver disse markører høj fleksibilitet i eksperimentelle design og valg af forskning problemer, der kan løses nu og i fremtiden.
| Mærket struktur | Markør | Udtryk og lokalisering | Klasse | Stock antallet | Kommentar | Ref. | ||||||
| Muskel | Mef2-GAL4 | alle myoblasts og alle muskler i alle faser | GAL4 linje | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | voksen muskel prækursorer og tidlig myotubes indtil ≈24 h APF | GAL4 linje, enhancer trap | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | hoppe muskel ved differentiering | GAL4 linje | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | indirekte flyvning muskler begynder ≈14 h APF | GAL4 linje | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | indirekte flyvning muskler begynder ≈14 h APF | Act88F forstærker / promotor kørsel Cameleon 3.1 | - | Ca2 + indikator | 8 | |||||||
| Act88F-normal god landbrugspraksis | indirekte flyvning muskler begynder ≈14 h APF | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG78 og fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Ham- nls-NGL | voksen muskel prækursorer, nukleare, indtil ≈24 h APF i indirekte flyvning muskler | forstærker/promotor med nls-normal god landbrugspraksis reporter | - | 1,5 kb enhancer fragment | 9 | |||||||
| MHC-Tau-normal god landbrugspraksis | Mikrotubuli i DLM skabeloner og differentiere muskler | forstærker/promotor med Tau-normal god landbrugspraksis reporter | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-normal god landbrugspraksis | Mikrotubuli i myotubes (f.eks. i indirekte flyvning muskler fra ≈14 h AFP, stærkt faldende efter ≈48 h APF) | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-normal god landbrugspraksis (weeP26) | sarcomeres (tyk glødetråd) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flyvning muskler med udgangspunkt i ≈30 h APF) | Normal god landbrugspraksis-fælde | - | Brug heterozygous, etiketter en isoform delmængde | 11 | |||||||
| SLS-normal god landbrugspraksis | sarcomeres (Z-disc) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flyvning muskler med udgangspunkt i ≈30 h APF) | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | - | G53, brug heterozygous | 2 | |||||||
| Zasp66-normal god landbrugspraksis | Z-disc i alle kroppens muskler | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-normal god landbrugspraksis | Z-disc i alle kroppens muskler | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-normal god landbrugspraksis | aktin bindende; udtrykt i epitel, myoblasts og myotubes | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-normal god landbrugspraksis | epitelcelle vejkryds, myoblasts og membraner i musklerne i alle faser | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Muskel vedhæftet fil site | ΒPS-Integrin-normal god landbrugspraksis | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-knock-i | - | 13 | |||||||
| Kamilla-normal god landbrugspraksis og -mCherry | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fælde (efterligner linje) | - | 3 | ||||||||
| Kamilla-normal god landbrugspraksis | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| Ilk-normal god landbrugspraksis | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| VinC-normal god landbrugspraksis og -RFP | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fusion (transgen) | - | 13 | ||||||||
| Senen | SR-GAL4 | thorax senen celler, i hele puppe stadie | GAL4 linje, enhancer trap | BL 26663 | homozygot dødbringende | 14 | ||||||
| Muskler og sener | DUF-GAL4 | muskler og epitheler, tidlig debut | GAL4 linje | BL 66682 | kirre-rP298, grundlægger celle markør | 15 | ||||||
| UAS-reportere | UAS- normal god landbrugspraksis-Gma | aktin bindende | UAS linje | BL 31776 | aktin bindende domæne af Moesin sammenvoksede til normal god landbrugspraksis | 16 | ||||||
| UAS- mCherry-Gma | aktin bindende | UAS linje | - | GMA sammenvokset til mCherry | 17 | |||||||
| UAS- Lifeact-normal god landbrugspraksis | aktin bindende | UAS linje | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UAS- Lifeact-Ruby | aktin bindende | UAS linje | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UAS-CD8-normal god landbrugspraksis | membran bindende | UAS linje | forskellige lagre, f.eks.: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UAS-CD8-mCherry | membran bindende | UAS linje | BL 27391 og 27392 | 20 | ||||||||
| UAS-palm-mCherry | membran bindende gennem palmitoylation | UAS linje | BL 34514 | UAS- brainbow | 21 | |||||||
Tabel 1: Fluorescently tagged protein markører egner sig til at studere muskel-sene morfogenese i vivo.
Her, vi beskriver i detaljer hvordan billeddannelse af muskel-sene morfogenese i levende pupper kan udføres nemt og korrekt (figur 1). Alternativt kan der fastsættes pupper, dissekeret og immunostained, som tillader brug af antistoffer også mærke proteiner som ikke live markører er tilgængelige22. I dette tilfælde er den billeddiagnostiske kvalitet generelt højere, fordi der er ingen bevægelse og struktur af interesse kan placeres i umiddelbar nærhed af coverslip. Dog dissektion og fiksering kan føre til skader og molekylære eller væv dynamics, f.eks muskel trækninger, kan kun undersøges i den levende organisme.
Protocol
1. fase pupper
- Angive et cross med 20-40 jomfruelige hunner og 20 hanner pr flaske af flyve mad (figur 1A). Alternativt, hvis bestandene vil blive anvendt, flip hver bestand på nye flasker. For at få nok pupper, overveje at oprette to flasker pr. genotype.
- Inkuber flasker på 25 ° C (eller 27 ° C ifølge det eksperimentelle design) i fem til seks dage (figur 1B).
Bemærk: Holde flipping fluerne hver to til tre dage at undgå overbefolkning og sikre en kontinuerlig forsyning af pupper. - Bruge en våd pensel til at indsamle hvide prepupae fra væggene i flaskerne og overføre dem til glas dias (figur 1 c). Tid iscenesættelsen, sådan at pupper nå den ønskede alder ved start live imaging under mikroskop.
Bemærk: Disse prepupae ligne ældre pupper i deres form, men de er stadig hvid som larver. Udbruddet af den prepupal fase er defineret som 0 h efter puparium dannelse (0 h APF). - Fjerne klumper af flyve mad klistrer til pupper med en våd pensel og orientere den ventrale side af pupper mod glas dias ved hjælp af et stereomikroskop (fig. 1 d). Kassér pupper der stadig bevæger sig (for unge) eller der er begyndt at vende brun (for gammel). Dette sikrer, at alle pupper har samme alder (0 - 1 h APF).
- Label dias med genotype, datoen og tidspunktet for indsamlingen. Overføre glas dias til en petriskål hver og tilføje et vådt væv for at forhindre pupper fra udtørring (figur 1E).
- Opbevar pupper i en inkubator ved 25 ° C eller 27 ° C, indtil de har nået den ønskede alder. Fortsætte til de næste trin 1 h før imaging, således at pupper har den ønskede alder ved start live imaging (trin 3), for eksempel på 13 h APF for filmen vist i figur 2A-D.
Bemærk: Tidligst muligt tidspunkt udgangspunktet er efter hoved-eversion af pupper forekommende på 8-10 h APF på 27 ° C.
2. klargør pupper til billedbehandling
- Sikre, at pupper nu holde sig til glas dias, ligesom de naturligvis holder sig til væggene i flaskerne på grund af resterende fly mad. Ingen ekstra lim er påkrævet. Hvis pupper ikke holde godt nok på grund af høj luftfugtighed, åbne petriskål i et par min. at lade dem tørre. Alternativt, overføre dem til dobbeltklæbende tape på et glas dias, men normalt, det er ikke nødvendigt.
-
Åbn vinduet i puppe tilfældet for billeddannelse af indirekte flyvning muskler (Figur 1F; Gå til afsnit 2.3 for billeddannelse af mavemusklerne.)
- Orientere pupper stikning til glas dias med den forreste vender væk fra forskeren i henhold til et stereomikroskop. Justere zoom til 2 X.
- Ved hjælp af ene ende af biologi klasse #5 pincet, forsigtigt stikke et hul ind i puppe sagen dorsal til den fløj, hvor underlivet slutter, og thorax begynder.
- Du kan skive åbne sagen puppe, forsigtigt flytte pincet til den forreste ende af thorax langs vingen, men undgå at beskadige det sårbare wing væv.
Bemærk: Hvis væske lækager fra puppe, det er beskadiget; kassere det og starte forfra med en anden puppe. - Løft del af sagen puppe over brystkassen med pincet og derefter skåret i dette afsnit af med fine, skarpe saks på den modsatte side af svinekroppens midterlinje.
-
Åbn vinduet i puppe tilfældet for billeddannelse af mavemusklerne (Figur 1 g)
- Orientere pupper stikning til glas dias med den forreste vender mod forskeren i henhold til et stereomikroskop. Justere zoom til 2 X.
- Ved hjælp af ene ende af biologi klasse #5 pincet, forsigtigt stikke et hul ind i puppe sagen dorsal til den fløj, hvor brystkassen slutter, og maven begynder.
- Du kan skive åbne sagen puppe, forsigtigt flytte pincet mod den bageste ende af maven.
Bemærk: Hvis væske lækager fra puppe, det er beskadiget; kassere det og starte forfra med en anden puppe. - Løft del af sagen puppe over maven med pincet og derefter skåret i dette afsnit af med fine, skarpe saks på den modsatte side af svinekroppens midterlinje.
-
Mount pupper (Figur 1 H)
- Bruge en våd pensel til at overføre op til fem pupper til en plastic slide med et groove (specialbyggede, der kan genbruges, se diskussion og liste over materialer). Tilføje et eller to spacer coverslips til hver side afhængig af dybden af rillen og tykkelsen af pupper. Put en lille dråbe vand under hver spacer coverslip at gøre det stick til diaset og forlade noget plads mellem groove og spacer coverslips på hver side.
Bemærk: Spacer coverslips kan også være permanent fastgjort til dias med super lim, på forhånd. - Orientere pupper, sådan at åbningen i puppe sagen vender opad ved hjælp af penslen. Sikre omhyggelig placering af pupper i den korrekte vinkel for god billeddiagnostiske kvalitet. Optimere vinkel for hver væv og udviklingsmæssige tidspunkt.
Bemærk: En lille mængde vand i rillen gør positionering af pupper lettere. Dræne overskydende vand med pensel bagefter at undgå drukning. - Hold en coverslip (18 x 18 mm) over pupper uden at røre dem. Placere små dråber (ca. 0,5 µL) i 50% glycerol løsning ovenfor kredittrancher puppe åbning på coverslip ved hjælp af en 20 µL pipette.
Bemærk: Denne procedure sikrer, at dråberne har den samme afstand som pupper. - Vend coverslip og Placer det over pupper i hånden eller ved hjælp af pincet (standard #5) mens de hviler en side af coverslip på spacer coverslips ved siden af pupper. Næste, falde blidt coverslip ind på pupper. Sikre at de puppe sag åbninger er ordentligt dækket med 50% glycerol for god billeddiagnostiske kvalitet og for at forhindre pupper fra udtørring.
- Fold over ene ende af et stykke selvklæbende tape og få fat i det med pincet (standard #5) i denne ende. Anbring forsigtigt båndet, således at det dækker en kant af den øverste coverslip, GIF-coverslip(s) og den plastic slide på den ene side. Undlad at trykke ned tape, endnu. Første, vende diaset og Gentag for anden siden.
- Brug begge indeks fingre til at presse ned båndet samtidig på begge sider. Denne procedure sikrer, at pupper ikke fordrevet.
- Kontrollere, om pupper er godt i kontakt med coverslip. For optimal billeddiagnostiske kvalitet bør pupper presses forsigtigt nedenunder i coverslip. Eventuelt justere antallet af gif-coverslips.
- Mærke diasset ved at skrive på den selvklæbende tape.
- Bruge en våd pensel til at overføre op til fem pupper til en plastic slide med et groove (specialbyggede, der kan genbruges, se diskussion og liste over materialer). Tilføje et eller to spacer coverslips til hver side afhængig af dybden af rillen og tykkelsen af pupper. Put en lille dråbe vand under hver spacer coverslip at gøre det stick til diaset og forlade noget plads mellem groove og spacer coverslips på hver side.
3. live Imaging af pupper
- Metoden montering giver mulighed for billeddannelse af pupper både inverterede mikroskoper (figur 1I) og opretstående mikroskoper (figur 1J). Især velegnet til live imaging scanner Konfokal mikroskoper, to-foton mikroskoper og spinning disc Konfokal mikroskoper uanset om de er inverteret eller oprejst. For langsigtet film, bruge en temperatur-kontrollerede fase, hvis det findes.
- Brug okulære og en UV-lampe eller transmission lys, finde en puppe og fokus inde puppe.
- Brug af kameraet, finde den ønskede struktur og justere zoomniveauet.
- For langsigtet film, definere en z-stakke, der omfatter struktur af interesse godt (for eksempel indirekte flyvning muskler, deres vedhæftede fil sites, senen celler eller en kombination af ovennævnte) og vælge et tidsinterval. Overveje at gøre gennemsnit til bedre billedkvalitet. For højhastighedstog, kortsigtede film, vælge et enkelt z-plan at opnå en høj billedhastighed.
- Regulere laser magten til at give den bedst mulige signal men lille mætning. Dog kan for høj laser power skade puppe over tid.
- Start imaging og vende tilbage til enhver tid at tjekke filmen og justere z-stakken positionering, hvis det er nødvendigt.
Figur 1: arbejdsgang for live imaging af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper. Se protokol for yderligere oplysninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Forskellige væv kan være afbildet i vivo udvikle flyve pupper, hvilket gør dem en ideel modelsystem at studere morfogenese af voksne organer. Blandt disse er indirekte flyvning muskler, thorax epitel herunder senen celler, fløj epitel, mavemusklerne og hjertet22,23,24,25,26 , 27. her, fokuserer vi på live imaging af muskler og sener morfogenese. For en detaljeret beskrivelse af indirekte flyvning muskel og mavemuskel morfogenese og yderligere metoder til at studere muskelbiologi i Drosophila, henvise vi læseren til Weitkunat og Schnorrer 201422.
Live imaging af indirekte flyvning muskler
For at studere blev den langsigtede udvikling af indirekte flyvning musklerne består af dorsolongitudinal muskler (DLMs) og dorsoventral musklerne (DVMs), kugleformede Moesin actin-bindende domæne markeret med normal god landbrugspraksis (UAS-normal god landbrugspraksis-Gma) udtrykt i alle musklerne bruger Myocyte forstærker faktor 2 (Mef2)-GAL4 driver (figur 2A-D, Film S1). Før imaging åbnede et vindue i sagen puppe over brystkassen, som vist i figur 1F. På en to-foton mikroskop, er z-stakke anskaffet hvert 20 min til 21 h starter ved ≈11 h efter puparium dannelse (11 h APF). I denne tidsramme, DLMs (grøn overlays i figur 2A'-D') først indlede tilknytning til senen celler (figur 2A) og derefter delt mens muskel vedhæftede filer modne (figur 2B). Næste, myotubes forkorte (figur 2 c), indtil de endelig nå maksimalt komprimeret scenen på 30 h APF (figur 2D). Tilsammen, fremhæver denne film de dramatiske ændringer i muskel morfologi, der finder sted på tidsskalaen i timer.
Figur 2: Live imaging af indirekte flyvning muskler og sener morfogenese. (A-D) Tid point fra en to-foton film (film S1) ved hjælp af Mef2-GAL4, UAS- normal god landbrugspraksis-Gma som markør for actin i indirekte flyvning musklerne består af dorsolongitudinal muskler (DLMs, fremhævet med grønt i A'-D') og dorsoventral muskler ( DVMs, fremhævet med blåt i A'-D'). Skala barer er 100 µm. (E-H) tid point fra en to-foton film (film S2) ved hjælp af Duf-GAL4UAS-CD8-normal god landbrugspraksis som markør for indirekte flyvning muskler og thorax epitel herunder senen celler. Paneler E'-H' vise en overlejring med en model af muskel-sene system på hvert tidspunkt, fremhæve de længe cellulære extensions dannet af senen epitel (magenta) kontakt med muskler (grøn). Skala barer er 100 µm (anslået fra størrelsen af afbildet strukturer). (I-L) Tid point fra en to-farvet, spinning disc Konfokal film (film S3) med fokus på muskel-sene vedhæftet fil indledning. Senen celler er mærket med sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) og dorsolongitudinal indirekte flyvning muskler med Mhc -Tau-normal god landbrugspraksis (grøn). Skala barer er 10 µm. tid er indiceret som TT efter puparium dannelse (APF). Bemærk, at ikke alle film var erhvervet på et temperatur-kontrollerede fase, derfor, udviklingsmæssige timing kan afvige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at studere sene og muskel morfogenese samtidig, membran-bundet normal god landbrugspraksis (UAS -CD8-NGL) blev udtrykt ved hjælp af Dumbfounded (Duf)-GAL4 som en driver, som kommer til udtryk både i senen celler og indirekte flyvning muskler (figur 2E -H, film S2). En z-stakken var taget på en to-foton mikroskop hvert 20 min. starter kl 16 h APF for 20 h. Mens myotubes kompakt (grøn overlay i figur 2E'-H'), senen celler form længe cellulære udvidelser aflang med tid (magenta overlay i figur 2E'-H'). Tilsammen, fremhæver denne film den tæt samspil mellem den sene og muskel celler i vivo.
For at undersøge muskel-sene interaktion mere detaljeret, blev to-farve, høj forstørrelse billeder udført. Pupper med myosin heavy chain (Mhc)-Tau-normal god landbrugspraksis i de DLMs og UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry) drevet af stribe (sr)-GAL4 i sener var afbildet hvert 5 min start på 12 h APF for 4,5 h på en roterende disk Konfokal mikroskop (figur 2I-L, film S3). På 12 h APF overflytte myotubes mod deres senen målceller samtidig danner lange filopodia på deres tips (figur 2I). Efterfølgende, muskler og sener væv interdigitate (figur 2J, K) til at danne en stabil fastgørelse. Som den vedhæftede fil modnes, udglatter færre filopodia form og grænsefladen muskel-sene (figur 2 L). To-farve, høj forstørrelse imaging kan således bruges til at afsløre cellulære dynamics i detaljer i den levende organisme.
Live imaging af mavemusklerne
For live imaging af mavemusklerne (figur 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-normal god landbrugspraksis blev brugt som en markør og et vindue blev åbnet over maven i puppe-sagen som beskrevet i figur 1 g. Svarende til den indirekte flyvning muskel film repræsenteret i figur 2A-D, dannelse og vækst af mavemusklerne kan følges over mange timer af udvikling (55 h i film S4). I løbet af denne tid smelter at myoblasts sammen og form vokser myotubes (figur 3A). Myotube tips migrere til deres mål i senen, og efter montering at senen celler, de kontraktile enheder i musklerne, sarcomeres, er dannet (figur 3B-D).
Figur 3: Live imaging af mavemuskel morfogenese. (A-D) Tid point fra en film (film S4) ved hjælp af Mef2-GAL4UAS-CD8-normal god landbrugspraksis som markør til at følge mavemuskel morfogenese. Paneler A'-E' Vis overlejringer med modeller af en mavemuskel sæt (grøn), der danner de novo puppe på stadiet. Skala barer er 100 µm. tid er indiceret som TT APF. Filmen blev erhvervet ved stuetemperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Live billedbehandling af trækninger i musklerne
I modsætning til figur 2 og figur 3, figur 4 viser muskel dynamics forekommer på tidsskalaen i sekunder: live optagelse af muskelsammentrækninger. Pupper udtrykker βPS-Integrin-NGL under endogen kontrol blev afbildet med en tidsopløsning af 0,65 s i en enkelt z-fly på en Konfokal mikroskop (Film S5). I eksemplet vises i figur 4, blev de vedhæftede fil sites af tre DVMs (figur 4A) afbildet i 10 min start på 42 h APF. I løbet af denne tid, fem spjæt hændelser blev observeret (figur 4B-F), viser at sarcomeres allerede er samlet godt nok til at støtte samordnede sammentrækninger på dette tidspunkt i udviklingen. Derfor kan billeddannelse af muskeltrækninger bruges som en funktionel læse-out for sarcomerogenesis allerede under indirekte flyvning muskel udvikling28, i modsætning til for eksempel prøveflyvninger, som kun kan udføres efter eclosion.
Figur 4: Live imaging af trækninger i musklerne. (A) første tidspunkt fra en film (film S5) viser trækninger af dorsoventral indirekte flyvning muskler på 42 h APF ved hjælp af βPS-Integrin-NGL som markør. I synsfeltet er musklen vedhæftet fil sites DVM II 2, DVM III 1 og DVM III 2. (B-F) Farve overlays af fem individuelle spjæt begivenheder, hver viser ramme før spjæt (magenta) og det første billede af spjæt begivenhed (grøn). Bemærk at de enkelte muskelfibre spjæt uafhængigt af hinanden. Pile fremhæve de trækninger bevægelse. Tidsopløsning af filmen er 0,65 s. skala barer er 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Live imaging af endogent tagged proteiner
Svarende til βPS-Integrin-normal god landbrugspraksis, en stor samling af fusion proteiner udtrykt i Drosophila under endogen kontrol er blevet genereret2,3,4. Disse flyve linjer kan bruges til at studere for eksempel subcellulært lokalisering eller udtrykket profiler af proteiner af interesse. Samlingen er især nyttig, hvis der foreligger ingen specifikke antistoffer eller protein dynamics skal være undersøgt i vivo uden fiksation. Figur 5 viser tre eksempler af endogent udtrykt fusion proteiner fra biblioteket flyve TransgeneOme (fTRG), Hu li tai shao (Hts)-normal god landbrugspraksis (figur 5A, B), Kamilla-normal god landbrugspraksis (figur 5 c, D) og βTubulin60D-normal god landbrugspraksis ( Figur 5E, F). Udtryk for disse proteiner kan studeres i alle væv, der udtrykker dem naturligt. Her, viser vi thorax epitel (figur 5AC, E) og indirekte flyvning muskler eller deres vedhæftede fil sites (figur 5BD, F) som eksempler.
Figur 5: Live imaging af endogent markeret proteiner. (A, B) Maksimale fremskrivninger af z-stakke taget af pupper udtrykker Hts-normal god landbrugspraksis. (C, D) Maksimale fremskrivninger af z-stakke taget af pupper udtrykker Talin-normal god landbrugspraksis. (E, F) Maksimale fremskrivninger af z-stakke taget af pupper udtrykker βTubulin60D-normal god landbrugspraksis. Paneler A, C og E Vis thorax epitel på 18, 24 og 18 h APF, henholdsvis, og paneler B, D og F viser de indirekte flyvning muskler eller deres vedhæftede fil sites på 30 h APF. Skala barer er 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan du billede muskel-sene morfogenese i levende Drosophila pupper ved hjælp af en bred vifte af fluorescently mærket proteiner. Denne i vivo billeddannelse strategi kan bruges til at studere udviklingsprocesser i deres naturlige miljø i hele organismen.
Det er afgørende for en vellykket eksperiment for at finde den korrekte udviklingsmæssige tidspunkt til at analysere. For eksempel, indlede dorsolongitudinal indirekte flyvning muskler tilknytning til deres sene mål på ≈16 h APF23 mens mavemusklerne udvikle senere og vedhæfte på begge ender kun mellem 30 og 40 h APF26. Derfor, tidligere publicerede litteratur skal bruges til at finde de rigtige tidspunkt punkter i udvikling til at analysere, eller hvis væv eller struktur af interesse ikke er blevet undersøgt i detaljer før, den overordnede udvikling må karakteriseres først.
For montering pupper med succes på de specialbyggede plast dias, er det vigtigt, at rillerne har passende dimensioner: riller skal være 1,0-1,5 mm brede og 0,3 - 0,4 mm dyb. Denne dybde giver mulighed for justering af den præcise afstand til den øverste coverslip med spacer coverslips efter behov. Dog bør mindst én spacer coverslip anvendes til at undgå dræning 50% glycerol fra prøven af kapillære kræfter. Den korrekte placering af pupper i rillen kræver nogle erfaring og bør optimeres således, at strukturen af interesse er så tæt som muligt på coverslip.
Hvis et stort antal pupper formodes at være afbildet i et mikroskop session, kan de alle monteres på forhånd og derefter opbevares i en inkubator indtil imaging for at sikre ordentlig udviklingsmæssig timing. Pupper skal overleve hele proceduren og også i det mindste forsøge at velsmagende hvis holdt på diaset efter billeddannelse. Overlevelsesraten kan bruges som en udlæsning til at kontrollere, om de billeddiagnostiske betingelser skade pupper.
De billeddiagnostiske indstillingerne skal vælges omhyggeligt ifølge de eksperimentelle krav. For kortsigtede film skal en høj billedhastighed versus en høj signal-støj-forholdet være afbalanceret, mens relativt høje laser power kan bruges uden at beskadige pupper for meget. Men for langsigtet film, laser power har at blive holdt på en moderat niveau og pupper bør ikke være afbildet løbende men snarere på visse tidspunkter, for eksempel hvert 20 min. For at sikre, at strukturen af interesse ikke bevæger sig ud af synsfeltet, kan det være nødvendigt at justere placeringen af z-stakken mellem tidspunkter. Til vores viden påvirker åbningen af puppe sagen i sig selv ikke udviklingsmæssige timing. Dog bør en temperatur-kontrollerede fase anvendes til langsigtet film for at sikre ordentlig udviklingsmæssig timing. Holde disse overvejelser i tankerne, kan meget informativ film erhverves.
Den præsenterede protokol kan bruges til at visualisere ikke kun muskel-sene morfogenese, men også andre udviklingslande væv, for eksempel, fløj epitel29. Kun tre ændringer til denne protokol er påkrævet: (1) åbning af puppe tilfældet ovenfor wing i stedet for thorax eller maven, (2) positionering af pupper med fløj over for den øverste coverslip og (3) anvendelsen af forskellige fluorescerende markør proteiner. Med fremme af CRISPR/Cas9-teknologi, vil mere endogent mærket fluorescerende proteiner være tilgængelige, fordi det er blevet mere ligetil at målrette endogene loci i Drosophila30,31 , 32. i fremtiden, vil dette give mulighed for belyse dynamikken i mange proteiner, celler og hele væv i deres fysiologiske miljø i detaljer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Manuela Weitkunat for erhvervelse af filmen S3. Vi er taknemmelige for Reinhard Fässler gavmilde støtte. Dette arbejde blev støttet af EMBO Young Investigator Program (F.S.), det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck Society (S.B.L., F.S.), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiativ Aix-Marseille Universitet AMIDEX (F.S.), LabEX-INFORM (F.S.) og Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
- Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
- Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), Cambridge, England. 3333-3341 (1997).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
- Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
- Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
- Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
- Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
- Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
- Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
- Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
- Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
- Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), Cambridge, England. 621-626 (2008).
- Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
- Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), Cambridge, England. 1261-1272 (2017).
- Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
- Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
- Classen, A. -K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), Bethesda. 2409-2418 (2014).
- Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
