Summary
Qui, presentiamo un metodo facile da usare e versatile per eseguire dal vivo imaging dei processi di sviluppo nella morfogenesi generale e muscolo-tendinee in particolare nella vita della drosofila pupe.
Abstract
Muscoli insieme lo scheletro e tendini permettono animali compreso gli esseri umani per spostare le loro parti del corpo. Morfogenesi del muscolo è altamente conservata dagli animali agli esseri umani. Di conseguenza, il potente sistema di modello di Drosophila utilizzabile per approfondire concetti di sviluppo muscolo-tendine che può essere applicato anche alla biologia del muscolo umano. Qui, descriviamo dettagliatamente come morfogenesi del sistema muscolo-tendinee adulto può essere facilmente imaged in vita, lo sviluppo di Drosophila pupe. Quindi, il metodo consente di indagare le proteine, cellule e tessuti nel loro ambiente fisiologico. Oltre a un protocollo di passo-passo con consigli utili, forniamo una panoramica completa delle proteine marker fluorescente contrassegnati che sono adatti per lo studio del sistema muscolo-tendinee. Per evidenziare le applicazioni del protocollo, abbiamo Visualizza esempio film che vanno dalla visualizzazione degli eventi morfogenetici a lungo termine – che si verificano sulla scala del tempo di ore e giorni – visualizzazione di processi dinamici a breve termine come contrazioni muscolari che si verificano su scala di tempo di secondi. Presi insieme, questo protocollo dovrebbe consentire al lettore di progettare ed eseguire esperimenti live-imaging per indagare la morfogenesi del muscolo-tendine nell'organismo intatto.
Introduction
L'apparato muscolo-tendinee permette animali compreso gli esseri umani per spostare le loro parti del corpo. I mattoni molecolari del sistema muscolo-tendinee sono altamente conservati. Di conseguenza, concetti di sviluppo muscolo-tendinee pertinente per la biologia del muscolo umano, ad esempio la morfogenesi del muscolo, muscolo-tendinee attaccamento e autorganizzazione Miofibrilla, possono essere studiati utilizzando Drosophila melanogaster come un facilmente accessibile modello di sistema. Il sistema di pupal Drosophila ha diversi vantaggi sperimentali. In primo luogo, nella fase pupal – quando si formano i muscoli adulti – l'organismo è sessile e quindi facile da immagine su un microscopio su un periodo di ore o addirittura giorni. In secondo luogo, forma molti muscoli abbastanza sotto la superficie pupal vicino così che essi possono essere imaged all'interno dell'organismo intatto, parzialmente traslucido. In terzo luogo, i muscoli possono essere studiati nel loro ambiente naturale, dove sono collegati per l'esoscheletro formatura tramite le cellule del tendine e si costruisce la tensione dei tessuti. Questo non è possibile in sistemi di colture cellulari del muscolo. E infine, una pletora di strumenti genetici è disponibile in Drosophila. Tra questi ci sono molti marcatori fluorescente con tag che permettono di etichettatura di tipi cellulari specifici o strutture subcellulari per l'imaging in vivo.
La tabella 1 riassume i più importanti marcatori utilizzati per lo studio della morfogenesi muscolo-tendinee. Esso comprende marcatori sovraespressi utilizzando il sistema GAL4-UAS1 e in modo endogeno con tag proteina marcatori2,3,4. Il vantaggio del sistema GAL4-UAS è che i marcatori sono generalmente espressi ad alti livelli, risultante in un segnale forte che può facilmente essere imaged in intero-monta pupe. Inoltre, tessuto specificità può essere ottenuta scegliendo con cura i driver GAL4. Il vantaggio delle proteine di fusione espresso sotto controllo endogeno è che la dinamica delle rispettive proteine può essere studiato in vivo, mentre può essere utilizzati anche come marcatori per diversi tipi di cellule o specifiche strutture subcellulari, ad esempio, ΒPS-integrina-GFP per siti di attacco del muscolo. Insieme, questi indicatori forniscono elevata flessibilità nel disegno sperimentale e la scelta dei problemi di ricerca che può essere risolto ora e in futuro.
| Struttura con etichetta | Marcatore | Espressione e localizzazione | Classe | Numero di azioni | Commento | Rif. | ||||||
| Muscolo | MEF2-GAL4 | tutti i mioblasti e tutti i muscoli in tutte le fasi | Gal4 linea | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | precursori del muscolo adulto e primi miotubi fino alle h ≈24 APF | Linea di Gal4, trappola enhancer | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | salto del muscolo su differenziazione | Gal4 linea | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF | Gal4 linea | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF | Act88F enhancer / promotore guida 3.1 Cameleon | - | Indicatore di CA2 + | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF | GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme) | fTRG78 e fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Lui- nls-GFP | precursori del muscolo adulto, nucleari, fino al ≈24 h APF nei muscoli di volo indiretto | Enhancer/promotore con reporter nls-GFP | - | frammento del rinforzatore di 1,5 kb | 9 | |||||||
| MHC-Tau-GFP | microtubuli in modelli di DLM e nella differenziazione di muscoli | Enhancer/promotore con reporter Tau-GFP | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | microtubuli in miotubi (ad es. nei muscoli di volo indiretto da ≈14 h AFP, diminuendo fortemente dopo ≈48 h APF) | GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GFP (weeP26) | sarcomeri (filamento spesso) in tutti i muscoli del corpo (ad es. nei muscoli di volo indiretto a partire da 30 h APF) | GFP-trappola | - | utilizzare eterozigoti, un sottoinsieme di isoforma di etichette | 11 | |||||||
| SLS-GFP | sarcomeri (Z-disco) in tutti i muscoli del corpo (ad es. nei muscoli di volo indiretto a partire da 30 h APF) | GFP-trappola (linea acchiappamosche) | - | G53, uso eterozigotico | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-disco in tutti i muscoli del corpo | GFP-trappola (linea acchiappamosche) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-disco in tutti i muscoli del corpo | GFP-trappola (linea acchiappamosche) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | associazione di actina; espresso in miotubi, mioblasti e dell'epitelio | GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | giunzioni delle cellule epiteliali, mioblasti e membrane nei muscoli in tutte le fasi | GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Luogo del collegamento del muscolo | ΒPS-integrina-GFP | siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto) | GFP-knock-in | - | 13 | |||||||
| Talin-GFP e - mCherry | siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto) | GFP-trappola (MiMIC linea) | - | 3 | ||||||||
| Talin-GFP | siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto) | GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| Ilk-GFP | siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto) | GFP-trappola (linea acchiappamosche) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc-GFP e - RFP | siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto) | GFP-fusione (transgene) | - | 13 | ||||||||
| Tendine | Sr-GAL4 | cellule del tendine di torace, durante fase pupal | Linea di Gal4, trappola enhancer | BL 26663 | omozigotica letale | 14 | ||||||
| Muscolo e tendine | DUF-GAL4 | muscoli ed epiteli, esordio precoce | Gal4 linea | BL 66682 | Kirre-rP298, indicatore di cella del fondatore | 15 | ||||||
| UAS-reporter | UAS- GFP-Gma | associazione di actina | Linea UAS | BL 31776 | dominio legante l'actina di moesina fusa alla GFP | 16 | ||||||
| UAS- mCherry-Gma | associazione di actina | Linea UAS | - | GMA fusa a mCherry | 17 | |||||||
| UAS- Lifeact-GFP | associazione di actina | Linea UAS | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UAS- Lifeact-Ruby | associazione di actina | Linea UAS | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UAS-CD8-GFP | associazione di membrana | Linea UAS | varie azioni, ad esempio: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UAS-CD8-mCherry | associazione di membrana | Linea UAS | BL 27391 e 27392 | 20 | ||||||||
| UAS-Palma-mCherry | associazione di membrana attraverso palmitoilazione | Linea UAS | BL 34514 | UAS- brainbow | 21 | |||||||
Tabella 1: Etichetta fluorescente proteine marker adatto per lo studio del muscolo-tendine morfogenesi in vivo.
Qui, descriviamo dettagliatamente come formazione immagine della morfogenesi muscolo-tendinee in pupe vivente può essere eseguita facilmente e con successo (Figura 1). In alternativa, possono essere fissati pupe, sezionato e immunostained, che consente l'utilizzo di anticorpi per etichettare anche proteine per cui no vivo marcatori sono disponibili22. In questo caso, la qualità delle immagini è generalmente superiore perché non c'è nessun movimento e la struttura di interesse può essere collocata in prossimità del vetrino coprioggetti. Tuttavia, la dissezione e la fissazione può portare a danni e molecolari o dinamiche di tessuto, per esempio, spasmi muscolari, può essere studiato solo nell'organismo vivente.
Protocol
1. fase pupe
- Impostare una croce con 20-40 Vergine femmine e maschi circa 20 a bottiglia di alimento (Figura 1A). In alternativa, se verranno utilizzate scorte, è possibile capovolgere ogni stock in nuove bottiglie. Per ottenere abbastanza pupe, considerare la creazione due bottiglie al genotipo.
- Incubare le bottiglie a 25 ° C (o 27 ° C secondo il disegno sperimentale) per cinque o sei giorni (Figura 1B).
Nota: Tenere lanciando le mosche ogni due o tre giorni per evitare il sovraffollamento e per garantire un approvvigionamento continuo di pupe. - Utilizzare un pennello bagnato per raccogliere membranose bianchi dalle pareti delle bottiglie e trasferirli alle diapositive di vetro (Figura 1). La messa in scena del tempo tali che le pupe raggiungono la desiderata età quando a partire dal vivo imaging sotto il microscopio.
Nota: Questi membranose come pupe più vecchi in termini di loro forma, ma sono ancora bianchi come larve. L'inizio della fase di prepupa è definito come 0 h dopo la formazione del pupario (0h APF). - Rimuovere macchie di cibo volo attaccando per le pupe con un pennello bagnato e orientare il lato ventrale delle pupe verso il vetrino utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 1). Scartare le pupe che sono ancora in movimento (troppo giovane) o che hanno iniziato a girare il colore marrone (troppo vecchio). Questo assicura che tutte le pupe hanno la stessa età (0 - 1 h APF).
- Marcare i vetrini con genotipo, data e ora della raccolta. Trasferire i vetrini in una capsula di petri e aggiungere un panno umido per evitare che le pupe secchino (Figura 1E).
- Memorizzare le pupe in un incubatore a 25 ° C o 27 ° C, fino a quando raggiungono l'età desiderata. Continuare con i passaggi successivi 1 h prima di formazione immagine, in modo che le pupe hanno desiderato età quando a partire dal vivo imaging (passaggio 3), ad esempio a 13 h APF per il film mostrato nella Figura 2A-D.
Nota: Il più presto fattibile tempo punto di partenza è dopo testa-rovesciamento delle pupe che si verificano a 8-10 h APF a 27 ° C.
2. preparare pupe per l'Imaging
- Assicurarsi che le pupe ora incolli sul vetrino, come naturalmente si attaccano alle pareti delle bottiglie a causa di residui alimentari volare. Nessuna colla supplementare è richiesta. Se le pupe non si attacchino abbastanza bene a causa della elevata umidità, aprire la capsula di Petri per qualche minuto per farli asciugare. In alternativa, trasferirli al nastro biadesivo su un vetrino, ma di solito, questo non è necessario.
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Finestra aperta nel caso pupal per l'imaging dei muscoli di volo indiretto (Figura 1F; Passare alla sezione 2.3 per l'imaging dei muscoli addominali).
- Orientare le pupe che attacca sul vetrino con l'anteriore si allontani il ricercatore sotto un microscopio stereoscopico. Regolare lo zoom 2x.
- Utilizzando un'estremità della biologia del grado 5 # forcipe, delicatamente colpire un foro sul caso pupal dorsale nell'ala dove finisce l'addome e il torace comincia.
- Per sezionare aperto il caso pupal, delicatamente spostare la pinza all'estremità anteriore del torace lungo l'ala, ma evitare di danneggiare il tessuto vulnerabile ala.
Nota: Se perdite di fluido dalla pupa, è danneggiato; eliminarlo e ricominciare da capo con una pupa differente. - Sollevare la sezione del caso pupal sopra il torace con le pinze e poi tagliare questa sezione con le forbici fine, taglienti sul lato opposto della linea mediana dorsale.
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Finestra aperta nel caso pupal per l'imaging dei muscoli addominali (Figura 1)
- Orientare le pupe che attacca sul vetrino con l'anteriore rivolta verso il ricercatore sotto un microscopio stereoscopico. Regolare lo zoom 2x.
- Utilizzando un'estremità della biologia del grado 5 # forcipe, delicatamente colpire un foro sul caso pupal dorsale nell'ala dove finisce il torace e l'addome inizia.
- Per sezionare aperto il caso pupal, muovete delicatamente la pinza verso l'estremità posteriore dell'addome.
Nota: Se perdite di fluido dalla pupa, è danneggiato; eliminarlo e ricominciare da capo con una pupa differente. - Sollevare la sezione del caso pupal sopra l'addome con il forcipe e poi tagliare questa sezione con le forbici fine, taglienti sul lato opposto della linea mediana dorsale.
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Mount pupe (Figura 1 H)
- Utilizzare un pennello bagnato per trasferire fino a cinque pupe a una diapositiva in plastica con una scanalatura (Vedi costruito su misura, riutilizzabile, la discussione ed elenco dei materiali). Aggiungere uno o due vetrini coprioggetti distanziale per ciascun lato a seconda della profondità della scanalatura e lo spessore delle pupe. Mettere una piccola goccia di acqua sotto ogni vetrino coprioggetti distanziale per farlo aderire alla diapositiva e lasciare spazio tra il groove e i coprioggetti distanziale su ogni lato.
Nota: Lamelle distanziatore possono anche essere fissate in modo permanente alla diapositiva con colla super, in anticipo. - Orientare le pupe tale che l'apertura nel caso pupal sia rivolta verso l'alto utilizzando il pennello. Assicurare un posizionamento accurato delle pupe l'angolo corretto per buona qualità delle immagini. Ottimizzare l'angolo per ogni tessuto e punto di tempo inerente allo sviluppo.
Nota: Una piccola quantità di acqua nella scanalatura rende il posizionamento delle pupe più facile. Scolare l'acqua in eccesso con il pennello in seguito per evitare l'annegamento. - Tenere un vetrino coprioggetti (18 x 18 mm) sopra le pupe senza toccarli. Posizionare piccole goccioline (circa 0,5 µ l) di soluzione di glicerolo al 50% ogni caso pupal aprono il coprioggetto usando una pipetta di 20 µ l di cui sopra.
Nota: Questa procedura assicura che le goccioline hanno la stessa spaziatura le pupe. - Capovolgere il vetrino coprioggetto e posizionarlo sopra le pupe a mano o con forcipe (standard #5) mentre ci si riposa un lato del coprivetrino su lamelle distanziale accanto le pupe. Successivamente, dolcemente cadere il coprioggetto sulle pupe. Assicurarsi che le aperture di caso pupale correttamente vengono coperte con 50% glicerolo per la buona qualità delle immagini e per impedire le pupe asciugarsi.
- Piegare oltre un'estremità di un pezzo di nastro adesivo e afferrarla con la pinzetta (standard #5) a tal fine. Posizionare delicatamente il nastro che si estende su un bordo del coprivetrino superiore, il coverslip(s) distanziale e scivolo di plastica su un lato. Non premere verso il basso il nastro, ancora. In primo luogo, girarsi la diapositiva e ripetere per l'altro lato.
- Utilizzare entrambi i dito indice per premere verso il basso il nastro contemporaneamente su entrambi i lati. Questa procedura assicura che le pupe non sono sfollate.
- Controllare che le pupe siano bene a contatto con il vetrino coprioggetti. Per la qualità delle immagini ottima le pupe dovrebbero essere spremute delicatamente sotto il vetrino coprioggetti. Se necessario, regolare il numero di vetrini coprioggetti distanziale.
- Etichettare la diapositiva di scrittura sul nastro appiccicoso.
- Utilizzare un pennello bagnato per trasferire fino a cinque pupe a una diapositiva in plastica con una scanalatura (Vedi costruito su misura, riutilizzabile, la discussione ed elenco dei materiali). Aggiungere uno o due vetrini coprioggetti distanziale per ciascun lato a seconda della profondità della scanalatura e lo spessore delle pupe. Mettere una piccola goccia di acqua sotto ogni vetrino coprioggetti distanziale per farlo aderire alla diapositiva e lasciare spazio tra il groove e i coprioggetti distanziale su ogni lato.
3. live Imaging delle pupe
- Il metodo di montaggio consente di formazione immagine delle pupe Microscopi rovesciati (Figura 1I) sia su microscopi (Figura 1J). Particolarmente adatto per formazione immagine diretta esegue la scansione di microscopi confocali, due-fotone microscopi e microscopi confocali di filatura disco indipendentemente dal fatto se essi sono invertiti o in posizione verticale. Per i film a lungo termine, è necessario utilizzare una fase temperatura controllata se disponibile.
- Utilizzando l'oculare e una lampada UV o trasmissione luce, individuare una pupa e un fuoco dentro la pupa.
- Con la fotocamera, trovare la struttura desiderata e regolare il livello di zoom.
- Per i film a lungo termine, definire un z-stack che comprende la struttura di interesse ben (ad esempio, i muscoli di volo indiretto, loro siti di attaccamento, le cellule del tendine o una combinazione del suddetto) e scegliere un intervallo di tempo. Prendere in considerazione facendo una media per una migliore qualità di immagine. Per i film ad alta velocità, a breve termine, scegliere un singolo z-aereo per raggiungere un frame rate elevato.
- Regolare la potenza del laser per dare il miglior segnale possibile ma poco saturazione. Tuttavia, anche ad alta potenza laser può danneggiare la pupa nel corso del tempo.
- Avviare imaging e tornare di tanto in tanto controllare il film e riadattare il posizionamento dello stack z se necessario.
Figura 1: flusso di lavoro per formazione immagine dal vivo della morfogenesi muscolo-tendinee in Drosophila pupe. Vedi protocollo per dettagli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Representative Results
Vari tessuti possono essere imaged in vivo nello sviluppo pupe volare, che li rende un sistema modello ideale per studiare la morfogenesi di organi adulti. Tra questi sono i muscoli di volo indiretto, l'epitelio di torace, comprese le cellule del tendine, l'epitelio dell'ala, muscoli addominali e il cuore22,23,24,25,26 , 27. qui, ci concentriamo su formazione immagine dal vivo della morfogenesi del muscolo e tendine. Per una descrizione dettagliata del muscolo voli indiretti e morfogenesi dei muscoli addominali e ulteriori metodi per lo studio della biologia del muscolo in Drosophila, rimandiamo il lettore a Weitkunat e Schnorrer 201422.
Live imaging dei muscoli di volo indiretto
Per studiare lo sviluppo a lungo termine dei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs) e i muscoli dorsoventral (DVMs), moesina globulare actina-associazione dominio contrassegnato con GFP (UAS -GFP-Gma) è stata espressa in tutte le i muscoli utilizzando il fattore di rinforzatore del Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 driver (Figura 2A-D, Film S1). Prima di formazione immagine, è stata aperta una finestra nel caso pupal sopra il torace come mostrato in Figura 1F. Su un microscopio a due fotoni, z-stack sono stati acquisiti ogni 20 min per h 21 a partire da ≈11 h dopo la formazione del pupario (11h APF). In questo lasso di tempo, la DLMs (verde sovrapposizioni nella Figura 2A'-D') prima di avviare collegamento alle cellule del tendine (Figura 2A) e quindi di dividere mentre gli allegati muscolari mature (Figura 2B). Successivamente, i miotubi accorciano (Figura 2) fino a raggiungere infine la fase compattata al massimo a 30 h APF (Figura 2D). Presi insieme, questo film mette in evidenza i drammatici cambiamenti nella morfologia del muscolo che si verificano sulla scala del tempo di ore.
Figura 2: Live imaging della morfogenesi di muscolo e tendine di voli indiretti. (A-D) Punti da un filmato di due fotoni (film S1) utilizzando Mef2tempo-GAL4, UAS- GFP-Gma come marcatore per l'actina nei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs, evidenziata in verde nell'A '-D') e la (muscoli dorsoventral DVMs, evidenziata in blu nell'A '-D'). Barre della scala sono 100 µm. (E-H) tempo punti da un filmato di due fotoni (film S2) utilizzando Duf-GAL4UAS-CD8-GFP come indicatore per i muscoli di volo indiretto e l'epitelio di torace compreso le cellule del tendine. Pannelli E'-H' mostrare una sovrapposizione con un modello del sistema muscolo-tendinee in ogni punto del tempo, evidenziando le estensioni lungo cellulare formata dall'epitelio del tendine (magenta) a contatto con i muscoli (verde). Barre della scala sono 100 µm (stimato dalla dimensione delle strutture imaged). (I-L) Tempo punti da un film di confocal di due colori, filatura disco (film S3) concentrandosi sull'iniziazione allegato muscolo-tendinee. Le cellule del tendine sono etichettate con sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) e il dorsolongitudinal indiretta volo muscoli con Mhc -Tau-GFP (green). Barre della scala sono 10 µm. tempo è indicato come HH: mm dopo formazione pupario (APF). Si noti che non tutti i film sono stati acquistati su un palco a temperatura controllata, pertanto, può divergere tempistica inerente allo sviluppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per lo studio della morfogenesi del tendine e del muscolo allo stesso tempo, membrana-limita GFP (UAS -CD8-GFP) è stato espresso utilizzando Dumbfounded (Duf)-GAL4 come un driver, che si esprime sia nelle cellule del tendine e i muscoli di volo indiretto (Figura 2E -H, film S2). Uno z-stack è stata presa su un microscopio a due fotoni ogni 20 min a partire a 16 h APF per 20 h. Mentre i miotubi compatto (sovrapposizione verde in Figura 2E'-H'), il tendine cellule estensioni lungo cellulare modulo che allungano con tempo (magenta sovrapposizione in Figura 2E'-H'). Presi insieme, questo film mette in evidenza la stretta interazione tra il tendine e muscolo cellule in vivo.
Per studiare l'interazione muscolo-tendinee più in dettaglio, due colori, ad alto ingrandimento imaging è stata eseguita. Pupe con catena pesante della miosina (Mhc)-Tau-GFP nella DLMs e UAS -palmitoilazione-mCherry (UAS -palm-mCherry) guidato da striscia (sr)-GAL4 nei tendini erano imaged ogni 5 min a partire da 12 h APF per 4,5 h su un disco che gira microscopio confocale (Figura 2I-L, film S3). A 12 h APF, i miotubi migrano verso loro cellule bersaglio del tendine formando lungo filopodi sulla loro punta (Figura 2I). Successivamente, i muscolo e tendine tessuti interdigitazione (Figura 2J, K) per formare un collegamento stabile. Come l'allegato matura, meno filopodi modulo e l'interfaccia muscolo-tendinee leviga (Figura 2 L). Così, due colori, ad alto ingrandimento imaging consente di rivelare la dinamica cellulare in dettaglio nell'organismo vivente.
Live imaging dei muscoli addominali
Per formazione immagine diretta dei muscoli addominali (Figura 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP è stato usato come un indicatore e una finestra è stata aperta sopra l'addome nel caso pupal come descritto in dettaglio nella Figura 1. Simile al film di muscolo voli indiretti rappresentato in Figura 2A-D, la formazione e la crescita dei muscoli addominali possono essere seguite su molte ore di sviluppo (55H nel film S4). Durante questo periodo, i mioblasti fusibile per formare miotubi (Figura 3A) in crescita. I suggerimenti di miotubi migrano verso i loro obiettivi di tendine, e dopo il collegamento per le cellule del tendine, si formano le unità contrattile dei muscoli, i sarcomeri, (Figura 3B-D).
Figura 3: Live imaging della morfogenesi del muscolo addominale. (A-D) Punti da un filmato (Movie S4) utilizzando Mef2tempo-GAL4UAS-CD8-GFP come marcatore di seguire la morfogenesi dei muscoli addominali. Pannelli A'-E' mostrare sovrapposte con modelli di un insieme di muscoli addominali (verde) che si forma de novo durante la fase di pupa. Barre della scala sono 100 µm. tempo è indicato come HH: mm APF. Il film è stato acquisito a temperatura ambiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Live imaging di contraendo i muscoli
In contrasto con la Figura 2 e Figura 3, Figura 4 Mostra dinamiche muscolari che si verificano sulla scala del tempo di secondi: la registrazione dal vivo di contrazioni muscolari. Pupe esprimendo βPS-integrina-GFP sotto controllo endogeno erano imaged con una risoluzione temporale di 0.65 s in un unico piano z su un microscopio confocale (Film S5). Nell'esempio visualizzato nella Figura 4, i siti di collegamento di tre DVMs (Figura 4A) erano imaged per 10 min a partire da 42 h APF. Durante questo tempo, twitch cinque eventi sono stati osservati (fig. 4B-F), mostrando che i sarcomeri sono già assemblati abbastanza bene per sostenere sviluppo coordinate contrazioni in questo momento. Quindi, imaging di contrazioni muscolari può essere utilizzato come una lettura funzionale per sarcomerogenesis già durante lo sviluppo del muscolo voli indiretti28, al contrario ad esempio prove di volo, che può essere eseguita solo dopo eclosion.
Figura 4: Live imaging di contraendo i muscoli. (A) primo tempo-punto da un filmato (Movie S5) mostrando contrazioni dei muscoli dorsoventral voli indiretti alle 42h APF utilizzando βPS-integrina-GFP come indicatore. Nel campo di vista è il muscolo allegato siti DVM II 2, DVM III 1 e DVM III 2. (B-F) Colore sovrapposizioni di cinque eventi di twitch individuali, ognuna mostrando il telaio prima della contrazione (magenta) e il primo fotogramma dell'evento twitch (verde). Si noti che le singole fibre di muscolo contrarsi in modo indipendente gli uni dagli altri. Le frecce evidenziano il movimento contrazioni. La risoluzione di tempo del film è 0,65 s. barre della scala sono 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Live imaging di proteine etichettate in modo endogeno
Simile a βPS-integrina-GFP, una grande collezione di proteine di fusione espressa in Drosophila sotto controllo endogeno è stato generato2,3,4. Queste linee di volare possono essere utilizzate per studiare ad esempio la localizzazione subcellulare o i profili di espressione di proteine di interesse. La collezione è particolarmente utile se gli anticorpi specifici non sono disponibili o proteina dinamiche devono essere studiati in vivo senza fissazione. Figura 5 vengono illustrati tre esempi di proteine di fusione in modo endogeno espresse dalla libreria TransgeneOme (fTRG) Vola, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figura 5A, B), Talin-GFP (Figura 5, D) e βTubulin60D-GFP ( Figura 5E, F). L'espressione di queste proteine può essere studiata in tutti i tessuti che li esprimono naturalmente. Qui, indichiamo l'epitelio del torace (Figura 5AC, E) e i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato (figura 5BD, F) come esempi.
Figura 5: Live imaging di endogenamente etichetta proteine. (A, B) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo Hts-GFP. (C, D) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo la Talin-GFP. (E, F) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo βTubulin60D-GFP. Pannelli A, C ed E mostrare l'epitelio del torace a 18, 24 e 18 h APF, rispettivamente e pannelli B, D e F mostrare i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato a 30 h APF. Barre della scala sono 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo presentato descrive come immagine morfogenesi muscolo-tendinee in vita Drosophila pupe utilizzando una varietà di proteine fluorescente etichettate. Questo in vivo imaging strategia può essere utilizzato per studiare i processi di sviluppo nel loro ambiente naturale dell'intero organismo.
È fondamentale per un esperimento riuscito trovare il punto corretto tempo inerente allo sviluppo per analizzare. Ad esempio, i muscoli di volo indiretto di dorsolongitudinal avviare attaccamento verso i loro obiettivi di tendine a ≈16 h APF23 mentre i muscoli addominali si sviluppano più tardi e allegare su entrambe le estremità solo tra 30 e 40 h APF26. Di conseguenza, la letteratura precedentemente pubblicata deve essere utilizzato per trovare i punti di momento di sviluppo per analizzare o, se il tessuto o la struttura di interesse non è stato studiato in dettaglio prima, lo sviluppo complessivo deve essere caratterizzato in primo luogo.
Per pupe di montaggio con successo sui vetrini in plastica su misura, è importante che le scanalature hanno dimensioni idonee: la necessità di scanalature di essere 1,0-1,5 mm larga e 0,3 - 0,4 mm di profondità. Questa profondità permette di regolare la distanza precisa per il coprioggetto superiore con distanziale coprioggetti come necessario. Tuttavia, almeno un vetrino coprioggetti distanziatore dovrebbero essere utilizzato per evitare un consumo eccessivo del glicerolo di 50% dal campione da forze capillari. Il corretto posizionamento delle pupe nella scanalatura richiede alcune esperienza e dovrebbe essere ottimizzati tale che la struttura di interesse è il più vicina possibile per il vetrino coprioggetti.
Se un gran numero di pupe è supposto per essere imaged in sessione uno microscopio, possono tutti essere montati in anticipo e poi conservati in un incubatore fino imaging per garantire la corretta tempi inerente allo sviluppo. Le pupe dovrebbero sopravvivere l'intera procedura e anche almeno cercare di eclose se mantenuto sulla diapositiva dopo formazione immagine. Il tasso di sopravvivenza può essere utilizzato come una lettura per verificare se le condizioni di imaging danneggiano le pupe.
Le impostazioni di imaging dovrebbero essere scelti con cura secondo i requisiti sperimentali. Per i film a breve termine, un frame rate elevato contro un elevato rapporto segnale-rumore deve essere bilanciata, mentre relativamente ad alta potenza laser può essere utilizzato senza danneggiare troppo le pupe. Tuttavia, per i film a lungo termine, la potenza del laser deve essere mantenuto ad un livello moderato e le pupe non dovrebbero essere imaged continuamente ma piuttosto a determinati punti di tempo, ad esempio, ogni 20 min. Per garantire che la struttura di interesse non si muove fuori del campo di vista, potrebbe essere necessario riadattare il posizionamento dello z-stack tra intervalli di tempo. A nostra conoscenza, l'apertura del caso pupal non pregiudica per sé tempistica inerente allo sviluppo. Tuttavia, una fase di temperatura controllata dovrebbe essere utilizzata per i film a lungo termine per garantire la corretta tempi inerente allo sviluppo. Tenendo presenti queste considerazioni, film altamente informativo può essere acquisito.
Il protocollo presentato consente di visualizzare non solo morfogenesi muscolo-tendinee, ma anche altri tessuti in via di sviluppo, ad esempio, l'ala epitelio29. Sono necessarie solo tre modifiche al presente protocollo: (1) l'apertura del caso pupal sopra l'ala invece il torace o dell'addome, (2) posizionamento di pupe con l'ala verso il coprioggetto superiore e (3) l'uso di proteine differenti marcatore fluorescente. Con l'avanzamento della CRISPR/Cas9-tecnologia, sempre più in modo endogeno con tag proteine fluorescenti sarà disponibile, perché è diventato più semplice per indirizzare endogeni loci nella Drosophila30,31 , 32. in futuro, questo vi permetterà di chiarire le dinamiche di numerose proteine, cellule e tessuti intero nel loro ambiente fisiologico in dettaglio.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringrazia Manuela Weitkunat per l'acquisizione di film S3. Siamo grati a Reinhard Fässler per il generoso sostegno. Questo lavoro è stato supportato da EMBO Young Investigator programma (F.S.), il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), la società Max Planck (S.B.L., F.S.), il Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), l'iniziativa di eccellenza OKTIM Università di Aix-Marseille (F.S.), informare LabEX (F.S.) e la Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
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