Summary
Hier präsentieren wir eine einfach zu bedienende und vielseitige Methode ausführen live imaging von Entwicklungsprozessen im allgemeinen und Muskel-Sehnen-Morphogenese insbesondere in lebenden Drosophila Puppen.
Abstract
Muskeln, Sehnen sowie das Skelett ermöglichen Tieren einschließlich des Menschen um ihre Körperteile bewegen. Muskel Morphogenese ist stark vom Tier auf den Menschen erhalten. Daher kann das leistungsstarke Drosophila -Modell-System verwendet werden, Konzepte der Muskel-Sehnen-Entwicklung zu studieren, auch die menschlichen Muskel Biologie angewendet werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Morphogenese der Erwachsenen Muskel-Sehnen-System im Wohnzimmer, leicht abgebildet werden kann Drosophila Puppen zu entwickeln. Daher kann die Methode, Proteine, Zellen und Gewebe in ihrer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Neben einer Schritt für Schritt-Protokoll mit hilfreichen Tipps bieten wir einen umfassenden Überblick über Gewebekulturen tagged Marker-Proteine, die für das Studium der Muskel-Sehnen-System geeignet sind. Um die vielseitigen Anwendungen des Protokolls zu markieren, zeigen wir Beispiel Filme reichen von der Visualisierung des langfristigen morphogenetischen Veranstaltungen – auf der Zeitskala der Stunden und Tage – Visualisierung von kurzfristigen dynamischen Prozessen wie Muskelzuckungen auftreten auf der Zeitskala von Sekunden auftreten. Zusammen genommen, sollte dieses Protokoll den Leser zu entwerfen und zu leben-Bildgebung Experimente durchführen, für die Untersuchung von Muskeln und Sehnen Morphogenese im intakten Organismus ermöglichen.
Introduction
Der Muskel-Sehnen-Apparat ermöglicht Tieren einschließlich des Menschen um ihre Körperteile bewegen. Die molekularen Bausteine der Muskel-Sehnen-System sind hoch konserviert. Daher können Konzepte der Muskel-Sehnen-Entwicklung für menschliche Muskel Biologie, z. B. Muskel Morphogenese, Muskel-Sehnenansatz und Myofibril Selbstorganisation, studiert werden mit Drosophila Melanogaster als eine leicht zugängliche Modellsystem. Die Drosophila pupal System hat mehrere experimentelle Vorteile. Erstens, wenn die Erwachsenen Muskeln gebildet werden – ist an das Puppenstadium – der Organismus Traubeneichen und daher leicht zu Bild am Mikroskop über einen Zeitraum von Stunden oder sogar Tage. Zweitens: viele Muskeln bilden nahe genug unter der pupal Oberfläche, so dass sie innerhalb des Organismus intakt, teilweise durchscheinenden abgebildet werden können. Drittens können die Muskeln in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden, wo sie die Formung Exoskelett über Sehnenzellen verbunden sind und Gewebespannung wird aufgebaut. Dies ist nicht möglich im Muskel Zellkultursysteme. Und zu guter Letzt gibt es eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen in Drosophila. Dazu gehören viele Eindringmittel tagged Markierungen, die es ermöglichen, Kennzeichnung von bestimmten Zelltypen oder subzellulären Strukturen für in-Vivoimaging.
Tabelle 1 fasst die wichtigsten Marker für das Studium der Muskel-Sehnen-Morphogenese verwendet. Es enthält Marker mit dem GAL4-UAS-System1 überexprimiert und endogen verschlagwortet Protein Marker2,3,4. Der Vorteil des GAL4-UAS-Systems ist, dass die Markierungen in der Regel ausgedrückt werden, auf einem hohen Niveau, wodurch ein starkes Signal, das leicht im ganzen-Mount Puppen abgebildet werden kann. Darüber hinaus kann Gewebespezifität durch Wahl GAL4 Treiber sorgfältig erfolgen. Der Vorteil von Fusionsproteinen ausgedrückt unter endogene Kontrolle ist zum Beispiel, dass die Dynamik der jeweiligen Proteine studierte in Vivo, werden können, während sie auch als Marker für verschiedene Zelltypen oder spezifische subzellulären Strukturen genutzt werden können, ΒPS-Integrin-GLP für Muskel-Anlage-Sites. Zusammen bieten diese Marker hohen Flexibilität bei der Versuchsplanung und Auswahl der Probleme, die jetzt und in Zukunft gelöst werden können.
| Beschriftete Struktur | Marker | Ausdruck und Lokalisierung | Klasse | Lagernummer | Kommentar | Ref. | ||||||
| Muskel | Mef2-GAL4 | alle Myoblasten und alle Muskeln in allen Phasen | Gal4-Linie | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | Erwachsenen Muskel Vorstufen und frühe Myotubes bis ≈24 h APF | Gal4 Linie, Enhancer-trap | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | Muskel auf Differenzierung zu springen | Gal4-Linie | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | indirekten Flugmuskeln ab ≈14 h APF | Gal4-Linie | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | indirekten Flugmuskeln ab ≈14 h APF | Act88F Enhancer / Projektträger driving Cameleon 3.1 | - | Ca2 + Kennzeichen | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | indirekten Flugmuskeln ab ≈14 h APF | GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur) | fTRG78 und fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Ihn- Nls-GFP | Erwachsenen Muskel Vorstufen, Kernenergie, bis ≈24 h APF in indirekten Flugmuskeln | Enhancer/Promotor mit Nls-GFP-reporter | - | 1,5 kb-Enhancer-fragment | 9 | |||||||
| MHC-Tau-GFP | Mikrotubuli in DLM Vorlagen und bei der Unterscheidung von Muskeln | Enhancer/Promotor mit Tau-GFP-reporter | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | Mikrotubuli in Myotubes (z. B. in indirekten Flugmuskeln aus ≈14 h AFP, stark rückläufig, nach ≈48 h APF) | GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GLP (weeP26) | Sarkomeren (Dicke Filament) in alle Körpermuskeln (z. B. in indirekten Flugmuskeln ab ≈30 h APF) | GFP-Falle | - | Verwenden Sie heterozygot, Etiketten eine Isoform Teilmenge | 11 | |||||||
| SLS-GFP | Sarkomeren (Z-Scheibe) in alle Körpermuskeln (z. B. in indirekten Flugmuskeln ab ≈30 h APF) | GFP-Trap (FlyTrap Linie) | - | G53, Verwendung heterozygot | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-Scheibe in alle Körpermuskeln | GFP-Trap (FlyTrap Linie) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-Scheibe in alle Körpermuskeln | GFP-Trap (FlyTrap Linie) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | Aktin Bindung; ausgedrückt in Epithel, Myoblasten und myotubes | GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | Epithelzelle Kreuzungen, Myoblasten und Membranen in den Muskeln auf allen Stufen | GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Muskel-Anlage-Website | ΒPS-Integrin-GFP | Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln) | GFP-Knock-in | - | 13 | |||||||
| Talin-GFP und -mCherry | Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln) | GFP-Trap (MiMIC Linie) | - | 3 | ||||||||
| Talin-GFP | Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln) | GFP-Fusion (TransgeneOme-Fliegenschnur) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| ILK-GFP | Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln) | GFP-Trap (FlyTrap Linie) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc-GFP und -RFP | Muskel Befestigung Websites (z. B. ab ≈18 h AFP in indirekten Flugmuskeln) | GFP-Fusion (Transgen) | - | 13 | ||||||||
| Sehne | SR-GAL4 | Thorax Sehnenzellen im gesamten Puppenstadium | Gal4 Linie, Enhancer-trap | BL 26663 | homozygot tödlich | 14 | ||||||
| Muskeln und Sehnen | DUF-GAL4 | Muskeln und Epithelien, früh einsetzende | Gal4-Linie | BL 66682 | Kirre-rP298, Gründer Zellmarkierung | 15 | ||||||
| FH-Reporter | FH- GFP-Gma | Actin-bindende | FH-Linie | BL 31776 | Actin-bindende Domäne des Moesin verschmolzen, GLP | 16 | ||||||
| FH- mCherry-Gma | Actin-bindende | FH-Linie | - | GMA verschmolzen, mCherry | 17 | |||||||
| FH- Lifeact-GFP | Actin-bindende | FH-Linie | BL 35544 | 18 | ||||||||
| FH- Lifeact-Ruby | Actin-bindende | FH-Linie | BL 35545 | 18 | ||||||||
| FH-CD8-GFP | Membran-Bindung | FH-Linie | verschiedene Aktien, z. B.: BL 32184 | 19 | ||||||||
| FH-CD8-mCherry | Membran-Bindung | FH-Linie | BL 27391 und 27392 | 20 | ||||||||
| FH-Palm-mCherry | Membran-Bindung durch palmitoylation | FH-Linie | BL 34514 | FH- brainbow | 21 | |||||||
Tabelle 1: Eindringmittel getaggt Protein Marker geeignet für Muskeln und Sehnen Morphogenese in Vivozu studieren.
Hier beschreiben wir im Detail wie Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in lebenden Puppen einfach und erfolgreich durchgeführt werden kann (Abbildung 1). Alternativ können die Puppen befestigt werden, seziert und Immunostained, wodurch mit Antikörpern auch Proteine, für die kein Marker Leben, beschriften sind verfügbar22. In diesem Fall ist die Bildqualität in der Regel höher, da gibt es keine Bewegung und die Struktur von Interesse in unmittelbarer Nähe zu dem Deckglas platziert werden kann. Jedoch Dissektion und Fixierung können führen zu Schäden und molekulare oder Gewebe Dynamik, z. B. Muskelzuckungen, kann nur im lebenden Organismus untersucht werden.
Protocol
1. Etappe-Puppen
- Richten Sie ein Kreuz mit 20-40 jungfräulichen Weibchen und ca. 20 Männchen pro Flasche fliegen Essen (Abbildung 1A). Alternativ, wenn Aktien verwendet werden, spiegeln Sie jede Aktie in neuen Flaschen. Um genug Puppen zu erhalten, erwägen Sie, zwei Flaschen pro Genotyp.
- Fünf bis sechs Tage (Abbildung 1 b) die Flaschen bei 25 ° C (oder 27 ° C nach den Versuchsplan) inkubieren.
Hinweis: Spiegeln Sie halten Sie die fliegen alle zwei bis drei Tage, um Überfüllung zu vermeiden und gewährleisten eine kontinuierliche Versorgung mit Puppen. - Verwenden Sie einen nassen Pinsel, um weiße Prepupae von den Wänden der Flaschen zu sammeln und übertragen Sie sie auf den Objektträger (Abbildung 1). Zeit die Inszenierung, so dass die Puppen die gewünschte erreichen Alter beim live imaging unter die Lupe genommen.
Hinweis: Diese Prepupae sehen aus wie ältere Puppen in Bezug auf ihre Form, aber sie sind immer noch weiß wie Larven. Das Auftreten der prepupal Bühne ist definiert als 0 h nach Puppenkammer Bildung (0 h APF). - Klumpen von fliegen Essen festhalten an die Puppen mit einem nassen Pinsel zu entfernen und der Bauchseite die Puppen auf dem Objektträger mit einem Stereomikroskop (Abbildung 1) zu orientieren. Entsorgen Sie Puppen, die sind noch in Bewegung (zu jung) oder, die inzwischen zu bräunen (zu alt). Dadurch wird sichergestellt, dass alle Puppen im gleiche Alter (0 - 1 h APF) haben.
- Beschriften Sie die Folien mit Genotyp, Datum und Zeit der Sammlung. Übertragen Sie die Glas-Folien auf eine Petrischale und fügen Sie einem feuchten Tuch um die Puppen Austrocknen verhindert wird (Abbildung 1E hinzu).
- Speichern Sie die Puppen in einem Inkubator bei 25 ° C und 27 ° C, bis sie das gewünschte Alter erreichen. Weiter mit den nächsten Schritten 1 h vor Bildgebung, so dass die Puppen das gewünschte Alter beim live Imaging (Schritt 3), zum Beispiel um 13 h APF für den Film gezeigt in der Abbildung 2A-Dstarten.
Hinweis: Die frühesten möglich Zeit Ausgangspunkt ist nach Kopf-Eversion der Puppen, die bei 8-10 h APF bei 27 ° C.
2. bereiten Sie Puppen für die Bildgebung
- Stellen Sie sicher, dass die Puppen nun auf den Objektträger kleben, so wie sie natürlich an den Wänden der Flaschen wegen verbleibenden fliegen Essen halten. Kein zusätzlicher Kleber ist erforderlich. Wenn die Puppen nicht gut genug wegen der hohen Luftfeuchtigkeit halten, öffnen Sie die Petrischale für ein paar Minuten trocknen lassen. Alternativ auf doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger übertragen, aber dies ist in der Regel nicht notwendig.
-
Offenes Fenster im pupal Fall für die Darstellung von indirekten Flugmuskeln (Abbildung 1F; Wechseln Sie zum Abschnitt 2.3 für die Bildgebung der Bauchmuskeln.)
- Richten Sie die Puppen auf dem Objektträger mit den vorderen abgewandten des Forschers unter einem Stereomikroskop kleben. Stellen Sie den Zoom, 2 X.
- Mit einem Ende der Biologie Klasse #5 Zange vorsichtig poke ein Loch in den pupal Fall dorsal an den Flügel, wo das Abdomen endet, und Thorax beginnt.
- Um offene pupal Fall schneiden, sanft bewegen Sie die Zange bis zum vorderen Ende des Thorax entlang der Flügel zu, aber nicht zu beschädigen das Gewebe anfällig Flügel.
Hinweis: Wenn Flüssigkeit aus der Puppe Austritt, es beschädigt ist; verwerfen und neu zu beginnen mit einer anderen Puppe. - Abschnitt der pupal Fall über den Brustkorb heben Sie mit der Zange und dann abgeschnitten in diesem Abschnitt wird mit einer feinen, scharfen Schere auf der gegenüberliegenden Seite der dorsalen Mittellinie.
-
Offenes Fenster im pupal Fall für die Bildgebung der Bauchmuskeln (Abbildung 1)
- Richten Sie die Puppen auf dem Objektträger mit der vorderen nach unten in Richtung des Forschers unter einem Stereomikroskop kleben. Stellen Sie den Zoom, 2 X.
- Mit einem Ende der Biologie Klasse #5 Zange vorsichtig poke ein Loch in den pupal Fall dorsal an den Flügel, wo der Thorax endet, und Abdomen beginnt.
- Zum Öffnen den pupal Fall schneiden, sanft bewegen der Zange am hinteren Ende des Bauches.
Hinweis: Wenn Flüssigkeit aus der Puppe Austritt, es beschädigt ist; verwerfen und neu zu beginnen mit einer anderen Puppe. - Abschnitt der pupal Fall über dem Zwerchfell mit der Zange anheben und dann mit feinen, scharfen Schere auf der gegenüberliegenden Seite der dorsalen Mittellinie dieses Abschnitts abgeschnitten.
-
Mount-Puppen (Abbildung 1 H)
- Verwenden Sie einen nassen Pinsel um bis zu fünf Puppen auf eine Kunststoff-Folie mit einer Nut (Custom-Built, wiederverwendbar, siehe Diskussion und Materialliste) zu übertragen. Fügen Sie ein oder zwei Abstandhalter Deckgläsern, auf jeder Seite je nach Tiefe der Nut und der Dicke der Puppen. Setzen Sie einen kleinen Tropfen unterhalb jeder Abstandhalter Deckglas zu machen, halten Sie sich an der Folie und lassen Sie etwas Platz zwischen den Groove und die Abstandhalter Deckgläsern auf jeder Seite.
Hinweis: Die Abstandhalter Deckgläsern können auch dauerhaft auf die Folie mit Superkleber, vorab befestigt werden. - Die Puppen zu orientieren, so dass die Öffnung im pupal Fall Gesichter nach oben mit dem Pinsel. Sorgfältige Positionierung der Puppen im richtigen Winkel für gute Bildqualität zu gewährleisten. Optimieren Sie den Winkel für jedes Gewebe und Entwicklungszeit.
Hinweis: Eine kleine Menge Wasser in die Nut Positionierung der Puppen einfacher macht. Überschüssiges Wasser mit dem Pinsel danach zu ertrinken zu vermeiden. - Halten Sie ein Deckglas (18 x 18 mm) über die Puppen, ohne sie zu berühren. Kleine Tröpfchen (ca. 0,5 µL) 50 % Glycerin-Lösung über jedem pupal Fall öffnet sich das Deckglas mit einer 20 µL Pipette zu platzieren.
Hinweis: Dieses Verfahren wird sichergestellt, dass die Tropfen den gleichen Abstand wie die Puppen haben. - Umdrehen Sie das Deckglas und positionieren Sie es über die Puppen von Hand oder mit einer Pinzette (standard #5) beim stillstehen einseitig das Deckglas auf den Abstandhalter Deckgläsern neben der Puppen. Als nächstes fallen Sie sanft das Deckglas auf die Puppen. Sicherstellen Sie, dass die pupal Fall Öffnungen ordnungsgemäß mit 50 % Glycerin für gute Bildqualität und die Puppen vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Falten Sie ein Stück Klebeband über ein Ende und greifen sie mit der Pinzette (standard #5) zu diesem Zweck. Legen Sie das Maßband sanft, so dass es eine Kante des oberen Deckglas, die Abstandhalter-Coverslip(s) und die Kunststoff-Folie auf der einen Seite abdeckt. Drücken Sie das Band nicht noch aus. Zuerst die Folie umdrehen und auf der anderen Seite wiederholen.
- Verwenden Sie beide Zeigefinger auf beiden Seiten das Band gleichzeitig drücken. Dieses Verfahren wird sichergestellt, dass die Puppen nicht verdrängt werden.
- Überprüfen Sie, ob die Puppen auch in Kontakt mit dem Deckglas sind. Für optimale Bildqualität sollte die Puppen sanft unter dem Deckglas gedrückt werden. Passen Sie die Anzahl der Spacer Deckgläsern, falls erforderlich.
- Beschriften Sie die Folie durch das Schreiben auf das Klebeband.
- Verwenden Sie einen nassen Pinsel um bis zu fünf Puppen auf eine Kunststoff-Folie mit einer Nut (Custom-Built, wiederverwendbar, siehe Diskussion und Materialliste) zu übertragen. Fügen Sie ein oder zwei Abstandhalter Deckgläsern, auf jeder Seite je nach Tiefe der Nut und der Dicke der Puppen. Setzen Sie einen kleinen Tropfen unterhalb jeder Abstandhalter Deckglas zu machen, halten Sie sich an der Folie und lassen Sie etwas Platz zwischen den Groove und die Abstandhalter Deckgläsern auf jeder Seite.
3. live Imaging von Puppen
- Die Montage-Methode ermöglicht Bildgebung die Puppen sowohl auf invertierte Mikroskope (Abbildung 1I) aufrechte Mikroskope (Abbildung 1J). Besonders geeignet für live Imaging Scannen konfokale Mikroskope, zwei-Photonen-Mikroskope und drehenden Scheibe konfokale Mikroskope unabhängig davon, ob sie seitenverkehrt sind oder aufrecht. Verwenden Sie für langfristige Filme eine temperaturgeführte Bühne Falls vorhanden.
- Suchen Sie mit Hilfe des Okulars und eine UV-Lampe oder leichte Übertragung, eine Puppe und konzentrieren sich im Inneren der Puppe.
- Mit der Kamera, finden Sie die gewünschte Struktur zu und passen Sie die Zoom-Stufe.
- Definieren Sie für langfristige Filme einen Z-Stapel, der die Struktur von Interesse gut (z. B. die indirekten Flugmuskeln, ihre Anlage-Websites, der Sehnenzellen oder eine Kombination der oben genannten) umfasst, und wählen Sie ein Zeitintervall. Erwägen Sie für bessere Bildqualität durchschnittlich. Wählen Sie für schnelle, kurzfristige Filme einer Z-Ebene, eine hohe Bildrate zu erreichen.
- Passen Sie die Leistung des Lasers, das bestmögliche Signal aber wenig Sättigung zu geben. Allerdings kann auch hohe Laserleistung die Puppe im Laufe der Zeit beschädigen.
- Starten Sie Imaging und wieder von Zeit zu Zeit überprüfen den Film und die Z-Stapel-Positionierung, ggf. nachjustieren.
Abbildung 1: Workflow für live Aufnahmen von Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen. Siehe Protokoll für Details. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Representative Results
Verschiedenen Geweben abgebildeten in Vivo bei der Entwicklung von fliegen Puppen, so dass sie ein ideales Modellsystem Morphogenese der Erwachsenen Organe zu studieren kann. Dazu gehören die indirekten Flugmuskeln, den Brustkorb Epithel einschließlich der Sehnenzellen, das Flügel-Epithel, Abdominal-Muskeln und Herz22,23,24,25,26 , 27. hier, wir konzentrieren uns auf live Bildgebung der Muskel und die Sehne Morphogenese. Für eine detaillierte Beschreibung der indirekte Flüge Muskel- und Bauchmuskel Morphogenese und zusätzliche Methoden für das Studium Muskel Biologie in Drosophilaverweisen wir den Leser auf Weitkunat und Schnorrer 201422.
Leben der indirekten Flugmuskeln imaging
Für das Studium äußerte sich die langfristige Entwicklung der indirekten Flugmuskeln, bestehend aus den Dorsolongitudinal Muskeln (DLMs) und die dorsoventral Muskeln (DVMs), kugelige Moesin Aktin-bindende Domäne getaggt mit GFP (FH -GFP-Gma) in allen Muskeln mit der Myozyten Enhancer Faktor 2 (Mef2)-GAL4-Treiber (Abbildung 2A-D, Film S1). Vor Bildgebung, wurde ein Fenster im pupal Fall über den Brustkorb geöffnet, wie in Abbildung 1Fgezeigt. Auf einem zwei-Photonen-Mikroskop wurden Z-Stapel alle 20 min. für 21 h ab ≈11 h nach Puppenkammer Bildung (11 h APF) erworben. In diesem Zeitrahmen, der DLMs (grün Überlagerungen in Abbildung 2A'-D') zunächst Bindung an die Sehnenzellen (Abbildung 2A) zu initiieren und dann aufgeteilt, während die Muskel-Anlagen (Abb. 2 b) Reifen. Als nächstes verkürzen die Myotubes (Abbildung 2), bis sie schließlich die maximal verdichtete Stufe 30 h APF (Abb. 2D) erreichen. Zusammengenommen, zeigt dieser Film die dramatischen Veränderungen im Muskel Morphologie, die in dem Zeitraum von Stunden auftreten.
Abbildung 2: Live-Bildgebung der indirekte Flüge Muskel und die Sehne Morphogenese. (A-D) Zeitpunkten aus einem zwei-Photonen-Film (Movie S1) mit Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma als Marker für Actin in der indirekten Flugmuskeln, bestehend aus den Dorsolongitudinal Muskeln (DLMs, Grün in A markiert "-D") und die dorsoventral Muskeln ( DVMs, hervorgehoben in blau in A'-D'). Maßstabsleisten sind 100 µm. (E-H) Zeitpunkten aus einem zwei-Photonen-Film (Movie S2) mit Duf-GAL4UAS-CD8-GFP als Marker für indirekten Flugmuskeln und den Brustkorb Epithel einschließlich Sehnenzellen. Paneele E'-H' zeigen einer Überlagerung mit einem Modell der Muskel-Sehnen-System zu jedem Zeitpunkt, Hervorhebung der lange zellulären Erweiterungen durch die Sehne Epithel (Magenta) in Kontakt mit den Muskeln (grün) gebildet. Maßstabsleisten sind 100 µm (geschätzt von der Größe des abgebildeten Strukturen). (I-L) Zeitpunkten Sie aus einem Zweifarben-drehenden Scheibe konfokale Film (Movie S3) mit Schwerpunkt auf Muskel-Sehnen-Anlage-Einleitung. Die Sehnenzellen werden beschriftet mit sr-GAL4UAS-Palm-mCherry (Magenta) und indirekte Dorsolongitudinal Flug Muskeln mit Mhc -Tau-GLP (grün). Maßstabsleisten sind 10 µm. Zeit wird angegeben als HH: mm nach Puppenkammer Bildung (APF). Beachten Sie, dass nicht alle Filme wurden auf einer Bühne temperaturgeführte erworben, daher Entwicklungsstörungen Timing kann abweichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Für die Untersuchung von Sehnen und Muskeln Morphogenese zur gleichen Zeit, Membrane-springen GFP (FH -CD8-GFP) drückte mit Dumbfounded (Duf)-GAL4 als Fahrer, die sowohl in der Sehnenzellen und die indirekten Flugmuskeln (Abbildung 2E zum Ausdruck kommt -H, Film-S2). Ein Z-Stack wurde alle 20 Minuten ab 16 Uhr APF für 20 h auf einem zwei-Photonen-Mikroskop genommen. Während der Myotubes kompakt (grüne Overlay in Abbildung 2E'-H'), die Sehne Zellen Form lange zellulären Erweiterungen, die mit der Zeit zu verlängern (Magenta Overlay in Abbildung 2E"-H"). Zusammen genommen, zeigt dieser Film das enge Zusammenspiel zwischen den Sehnen und Muskel Zellen in Vivo.
Um Muskel-Sehnen-Interaktion näher zu untersuchen, wurde zweifarbig, hoher Vergrößerung Bildgebung durchgeführt. Puppen mit Myosin heavy Chain (Mhc)-Tau-GFP im DLMs und FH -Palmitoylated-mCherry (FH -Palm-mCherry) angetrieben von Streifen (sr)-GAL4 in den Sehnen wurden alle 5 min. ab 12 Uhr APF für 4,5 h auf einer drehenden Scheibe abgebildet confocal Mikroskop (Abb. 2I-L, Film S3). Um 12 Uhr APF migrieren, die Myotubes in Richtung ihrer Sehne-Ziel-Zellen und bilden lange Filopodien an ihren Enden (Abb. 2I). Anschließend den Muskel und die Sehne Gewebe interdigitate (Abbildung 2J, K), eine stabile Befestigung zu bilden. Im Laufe der Zeit die Anlage glättet weniger Filopodien Form und die Muskel-Sehnen-Schnittstelle (Abbildung 2 L). So kann Zweifarben-, hoch-Vergrößerung Bildgebung verwendet werden, um zelluläre Dynamik im Detail im lebenden Organismus zu offenbaren.
Live-imaging der Bauchmuskeln
Für live Aufnahmen von der Bauchmuskulatur (Abbildung 3Film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP diente als Marker und ein Fenster über dem Zwerchfell im pupal Fall als detaillierte in Abbildung 1. Ähnlich wie bei der indirekten Flug Muskel Film dargestellt in Abbildung 2A-D, die Bildung und das Wachstum der Bauchmuskeln können über viele Stunden der Entwicklung (55 Std. im Film S4) verfolgt werden. Während dieser Zeit verschmelzen die Myoblasten Form wächst Myotubes (Abb. 3A). Myotube Tipps zu ihren Zielen der Sehne zu migrieren, und nach dem Anfügen an der Sehnenzellen, die kontraktilen Einheiten der Muskeln, den Sarkomeren gebildet werden (Abb. 3 b-D).
Abbildung 3: Live-Bildgebung der Bauchmuskel Morphogenese. (A-D) Zeitpunkten aus einem Film (Movie S4) mit Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP als Marker Bauchmuskel Morphogenese folgen. Seitenteile A'-E' zeigen Überlagerungen mit Modellen der Bauchmuskel Fahrgast-/ (grün), die de Novo während das Puppenstadium bildet. Maßstabsleisten sind 100 µm. Zeit als HH: mm APF gekennzeichnet ist. Der Film wurde bei Raumtemperatur erworben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Live-imaging von zuckenden Muskeln
Im Gegensatz zu Abbildung 2 und Abbildung 3 Abbildung 4 zeigt Muskel Dynamik in dem Zeitraum von Sekunden auftreten: die live-Aufnahme von Muskelkontraktionen. Puppen mit dem Ausdruck βPS-Integrin-GFP unter endogene Kontrolle wurden abgebildet, mit einer zeitlichen Auflösung von 0,65 s in einer Z-Ebene auf einem confocal Mikroskop (Film S5). Im Beispiel in Abbildung 4dargestellt wurden die Anlage Stätten der drei DVMs (Abb. 4A) für 10 min ab 42 h APF abgebildet. Während dieser Zeit wurden fünf zucken Ereignisse beobachtet (Abbildung 4 b-F), zeigt, dass die Sarkomeren bereits gut genug montiert werden, um koordinierte Kontraktionen zu diesem Zeitpunkt in der Entwicklung zu unterstützen. Daher kann Bildgebung von Muskelzuckungen als eine funktionale Auslesung für Sarcomerogenesis bereits während indirekte Flüge Muskel Entwicklung28, im Gegensatz zu z. B. Flugtests herangezogen werden nur nach Bewegungsapparate durchgeführt werden können.
Abbildung 4: Live-Darstellung der Muskeln zucken. (A) zuerst Zeit-Punkt aus einem Film (Movie S5) βPS-Integrin-GFP als Marker zeigt Zucken der dorsoventral indirekten Flugmuskeln 42 h mit APF. In das Sichtfeld sind des Muskels Anlage Stätten der DVM II 2, DVM III 1 und DVM III 2. (B-F) Farbe Überlagerungen von fünf einzelnen Twitch Veranstaltungen jeweils zeigt den Rahmen vor das Zucken (Magenta) und den ersten Frame der Twitch-Veranstaltung (grün). Beachten Sie, dass die einzelnen Muskelfasern unabhängig voneinander zucken. Pfeile markieren die zuckende Bewegung. Die zeitliche Auflösung des Films ist 0,65 S. Maßstabsleisten sind 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Live-imaging von endogen tagged Proteine
Ähnlich wie βPS-Integrin-GFP, wurde eine große Sammlung von Fusionsproteinen ausgedrückt in Drosophila endogenen kontrolliert generierten2,3,4. Diese Fliegenschnüre können verwendet werden, zum Beispiel die subzelluläre Lokalisation oder der Expressionsprofile interessierender Proteine zu studieren. Die Kollektion ist besonders hilfreich, wenn spezifische Antikörper nicht verfügbar sind oder Proteindynamik untersuchten in Vivo ohne Fixierung sein müssen. Abbildung 5 zeigt drei Beispiele von endogen ausgedrückten Fusionsproteinen aus der Fliege TransgeneOme (fTRG) Bibliothek, Hu li Tai Shao (Hts)-GLP (Abbildung 5A, B), Talin-GLP (Abbildung 5, D) und βTubulin60D-GLP ( Abbildung 5E, F). Die Expression dieser Proteine kann in allen Geweben untersucht werden, die sie natürlich ausdrücken. Hier zeigen wir den Brustkorb Epithel (Abbildung 5AC, E) und die indirekten Flugmuskeln oder verlinkten Anlage (Abbildung 5 bD, F) als Beispiele.
Abbildung 5: Live imaging von endogen Proteine markiert. (A, B) Maximale Projektionen der Z-Stapel von Puppen mit dem Ausdruck Hts-GFP genommen. (C, D) Maximale Projektionen der Z-Stapel von Puppen mit dem Ausdruck Talin-GFP genommen. (E, F) Maximale Projektionen der Z-Stapel von Puppen mit dem Ausdruck βTubulin60D-GFP genommen. Paneele A, C und E zeigen die Thorax-Epithel bei 18, 24 und 18 h APF, bzw., und Platten B, D und F zeigen die indirekten Flugmuskeln oder verlinkten Anlage 30 h APF. Maßstabsleisten sind 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Muskel-Sehnen-Morphogenese in lebenden Bild Drosophila Puppen mit einer Vielzahl von Eindringmittel tagged Proteine. Dieses in-Vivo imaging-Strategie kann verwendet werden, um Entwicklungsprozesse in ihrer natürlichen Umgebung des gesamten Organismus zu studieren.
Es ist entscheidend für ein gelungenes Experiment, den richtigen Entwicklungszeit zu analysieren Punkt zu finden. Zum Beispiel initiieren Dorsolongitudinal indirekten Flugmuskeln Bindung an ihre Ziele Sehne ≈16 h APF23 während Bauchmuskeln später entwickeln und befestigen Sie an beiden Enden nur zwischen 30 und 40 h APF26. Daher zuvor veröffentlichter Literatur sollte verwendet werden, zu den richtigen Zeitpunkten der Entwicklung zu analysieren, oder wenn das Gewebe oder die Struktur des Interesses nicht vor detailliert untersucht worden ist, hat die gesamte Entwicklung zunächst charakterisiert werden.
Für Montage Puppen erfolgreich auf den speziell angefertigten Kunststoff-Folien, ist es wichtig, dass die Nuten geeignetste Abmessungen haben: die Nuten müssen 1,0-1,5 mm breit und 0,3 - 0,4 mm tief. Dieser Tiefe ermöglicht die genaue Distanz zu den oberen Deckglas mit Abstandhalter Deckgläsern nach Bedarf anpassen. Jedoch sollten mindestens einen Abstandhalter Deckglas verwendet werden, um entladen 50 % Glycerin aus der Probe zu verhindern durch Kapillarkräfte. Die richtige Positionierung der Puppen in der Nut erfordert etwas Erfahrung und sollten optimiert werden, so dass die Struktur des Interesses so nah wie möglich an das Deckglas ist.
Wenn eine große Anzahl von Puppen in einem Mikroskop Sitzung abgebildet werden soll, können sie alle vorher montiert und dann gespeichert im Inkubator bis imaging um richtige Entwicklungsstörungen Timing sicherzustellen. Die Puppen sollten das gesamte Verfahren zu überleben und auch zumindest versuchen, Eclose, wenn auf der Folie nach dem Imaging gehalten. Die Überlebensrate kann als eine Anzeige verwendet werden, um zu überprüfen, ob die bildgebenden Bedingungen die Puppen Schaden.
Die bildgebenden Einstellungen sollte sorgfältig nach den experimentellen Anforderungen gewählt werden. Für kurzfristige Filme muss eine hohe Bildrate gegen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis ausgeglichen werden, während relativ hohe Laserleistung verwendet werden kann, ohne dass die Puppen zu viel. Für langfristige Filme, die Laserleistung hat jedoch auf einem moderaten Niveau zu halten und die Puppen sollten nicht kontinuierlich sondern zu bestimmten Zeitpunkten, z.B. alle 20 min. abgebildet werden. Um sicherzustellen, dass die Struktur des Interesses nicht aus dem Blickfeld bewegt, könnte es passen Sie die Position der Z-Stapel zwischen Zeitpunkten erforderlich. Nach unserer Kenntnis beeinflusst die Eröffnung der pupal Fall schlechthin nicht Entwicklungsstörungen Timing. Jedoch sollte eine temperaturgeführte Bühne für langfristige Filme verwendet werden, um richtige Entwicklungsstörungen Timing sicherzustellen. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen, können sehr informative Filme erworben werden.
Die vorgestellte Protokoll kann verwendet werden, nicht nur Muskeln und Sehnen Morphogenese, sondern auch andere entwickelnden Gewebe, z. B. die Flügel Epithel29zu visualisieren. Es sind nur drei Änderungen dieses Protokolls erforderlich: (1) Eröffnung der pupal Fall über die Flügel statt den Brustkorb oder Bauch, (2) Positionierung der Puppen mit dem Flügel in Richtung der oberen Deckglas und (3) die Verwendung von verschiedenen fluoreszierenden Marker-Proteine. Mit der Weiterentwicklung der CRISPR/Cas9-Technologie werden mehr und mehr endogen tagged fluoreszierende Proteine verfügbar sein, weil es einfacher zu endogenen Loci in Drosophila30,31 Ziel geworden ist , 32. in Zukunft dadurch Aufklärung die Dynamik von zahlreichen Proteinen, Zellen und ganze Gewebe in ihrer physiologischen Umgebung im Detail.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Manuela Weitkunat für den Erwerb von Film S3. Wir sind dankbar für die großzügige Unterstützung Reinhard Fässler. Diese Arbeit wurde unterstützt von EMBO Young Investigator Programm (f.), der Europäische Forschungsrat unter dem siebten Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP/2007-2013) / ERC-Grant-310939 (f.), der Max-Planck-Gesellschaft (S.B.L., f.s.), dem Centre National De La Recherche Scientifique (CNRS) (f.), der Exzellenzinitiative Aix-Marseille Universität AMIDEX (f.), die LabEX informieren (f.) und der Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
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