Summary
Здесь мы представляем простой в использовании и универсальный метод для выполнения живых визуализации процессов развития в целом и мышц сухожилие морфогенеза в частности жизни дрозофилы куколок.
Abstract
Мышцы, сухожилия и скелет включить животных, включая человека, чтобы переместить их части тела. Морфогенез мышц высоко сохраняется от животных к людям. Таким образом мощная система модель дрозофилы может использоваться для изучения концепции развития мышц и сухожилий, которые могут также применяться к биологии человека мышцы. Здесь мы подробно описать как морфогенеза взрослых мышц сухожилие системы может быть легко imaged в жизни, развивающихся куколок дрозофилы . Следовательно этот метод позволяет исследовать белков, клеток и тканей в их физиологической среде. В дополнение к шаг за шагом протокол с полезные советы мы предоставляем всесторонний обзор дневно тегами маркер белков, которые подходят для изучения системы мышц сухожилие. Чтобы подчеркнуть универсальность применения протокола, мы покажем пример фильмы, начиная от визуализации долгосрочных морфогенетических событий – происходящих на шкале времени, часов и дней – для визуализации краткосрочных динамических процессов, как мышечные подергивания место на шкале времени в секундах. Взятые вместе, этот протокол должен позволить читателю для проектирования и выполнения экспериментов жить изображений для расследования морфогенеза сухожилия мышц в организме нетронутыми.
Introduction
Сухожилия мышц аппарат позволяет животных, включая человека, чтобы переместить их части тела. Молекулярные строительные блоки системы мышц сухожилие высоко сохраняются. Таким образом концепции развития мышц сухожилие, отношение к биологии человека мышцы, например морфогенеза мышцы, мышцы и сухожилия привязанность и Миофибриллы самоорганизации, могут изучаться с помощью Drosophila melanogaster как легко доступной модель системы. Дрозофилы куколки система имеет несколько экспериментальных преимущества. Во-первых на стадии куколки – когда взрослый мышцы формируются – организм сидячие и поэтому легко изображения на микроскопе в течение часов или даже дней. Во-вторых форме многие мышцы достаточно под куколки поверхности близко, так что они могут быть imaged внутри организма нетронутыми, частично прозрачные. В-третьих мышцы могут быть исследованы в их естественной среде, где они подключены к формирования экзоскелет через сухожилия клеток и тканей напряженности построен. Это не возможно в системах культуры клеток мышцы. И наконец, множество генетических средств доступен в дрозофилы. Среди них много дневно тегами маркеров, которые позволяют маркировки типов конкретных клеток или внутриклеточных структур для обработки изображений в естественных условиях.
В таблице 1 приведены наиболее важные маркеры используются для изучения мышц сухожилие морфогенеза. Она включает маркеры, оверэкспрессировали с помощью GAL4-бас системы1 и эндогенно отмеченных белковых маркеров2,3,4. Преимущество GAL4-бас системы является то, что маркеры обычно выражаются на высоком уровне, что приводит к сильный сигнал, который может быть легко imaged в целом гора куколок. Кроме того специфичность ткани может быть достиган тщательно подходить к выбору GAL4 драйверы. Преимуществом синтез белков, выразил под внутреннего контроля является что динамики соответствующих белков могут быть изучены в естественных условиях, хотя они могут также использоваться в качестве маркеров для различных типов клеток или конкретных внутриклеточных структур, например, ΒPS-Интегрин-GFP для мышц вложение сайтов. Вместе эти маркеры обеспечивают высокую гибкость в экспериментальный дизайн и выбор исследовательских проблем, которые могут быть решены сейчас и в будущем.
| Приклеенные этикетку структура | Маркер | Выражение и локализация | Класс | Инвентарный номер | Комментарий | Исх. | ||||||
| Мышца | Mef2-GAL4 | все сомитов и все мышцы на всех этапах | GAL4 линия | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | Взрослый мышцы прекурсоров и раннего myotubes до ≈24 h НФА | GAL4 линия, усилитель ловушка | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | Перейти мышц после дифференциации | GAL4 линия | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | косвенные полет мышцы, начиная ≈14 h НФА | GAL4 линия | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | косвенные полет мышцы, начиная ≈14 h НФА | Act88F усилитель / промоутер вождения Cameleon 3.1 | - | CA2 + индикатор | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | косвенные полет мышцы, начиная ≈14 h НФА | GFP-Фьюжн (Муха TransgeneOme линия) | fTRG78 и fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Ему- nls-GFP | Взрослый мышцы прекурсоров, ядерного, до ≈24 h НФА в мышцах косвенные рейса | усилитель/промоутер с nls-GFP репортер | - | фрагмент усилитель 1.5 kb | 9 | |||||||
| MHC-Тау-GFP | микротрубочки в DLM шаблоны и дифференциации мышц | усилитель/промоутер с Тау-GFP репортер | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | микротрубочки в myotubes (например, в косвенной полет мышцы от ≈14 h AFP, сильно уменьшается после ≈48 h НФА) | GFP-Фьюжн (Муха TransgeneOme линия) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GFP (weeP26) | sarcomeres (толщиной нити накала) в всех мышц тела (например, в косвенной полет мышцы начиная с ≈30 h НФА) | GFP-ловушка | - | Используйте гетерозиготных, этикетки изоформы подмножество | 11 | |||||||
| SLS КГВ | sarcomeres (Z-диска) в всех мышц тела (например, в косвенной полет мышцы начиная с ≈30 h НФА) | GFP-ловушка (мухоловка линия) | - | G53, использование гетерозиготных | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-диск все мышцы тела | GFP-ловушка (мухоловка линия) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-диск все мышцы тела | GFP-ловушка (мухоловка линия) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | Актин привязки; в эпителии, сомитов и myotubes | GFP-Фьюжн (Муха TransgeneOme линия) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | Перекрестки эпителиальных клеток, сомитов и мембраны в мышцах на всех этапах | GFP-Фьюжн (Муха TransgeneOme линия) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Мышцы вложения сайт | ΒPS-Интегрин GFP | мышцы вложение сайтов (например, начиная ≈18 h AFP в мышцах косвенные полета) | GFP-стук в | - | 13 | |||||||
| Талин GFP и - mCherry | мышцы вложение сайтов (например, начиная ≈18 h AFP в мышцах косвенные полета) | GFP-ловушка (мнемосхемы линия) | - | 3 | ||||||||
| Талин GFP | мышцы вложение сайтов (например, начиная ≈18 h AFP в мышцах косвенные полета) | GFP-Фьюжн (Муха TransgeneOme линия) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| ILK-GFP | мышцы вложение сайтов (например, начиная ≈18 h AFP в мышцах косвенные полета) | GFP-ловушка (мухоловка линия) | Киото 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Преодолимый GFP и - RFP | мышцы вложение сайтов (например, начиная ≈18 h AFP в мышцах косвенные полета) | GFP-Фьюжн (трансген) | - | 13 | ||||||||
| Сухожилие | SR-GAL4 | грудной клетки сухожилия, всей стадия куколки | GAL4 линия, усилитель ловушка | BL 26663 | гомозиготная смертоносное | 14 | ||||||
| Мышцы и сухожилия | DUF-GAL4 | мышцы и эпителия, раннее начало | GAL4 линия | BL 66682 | kirre-rP298, основатель ячейке маркер | 15 | ||||||
| Уан Репортеры | Уан- GFP-Gma | Актин привязки | UAS линия | BL 31776 | Актин связывающий домен Moesin сливается с GFP | 16 | ||||||
| Уан- mCherry-Gma | Актин привязки | UAS линия | - | GMA сливается с mCherry | 17 | |||||||
| Уан- Lifeact-GFP | Актин привязки | UAS линия | BL 35544 | 18 | ||||||||
| Уан- Lifeact-Рубин | Актин привязки | UAS линия | BL 35545 | 18 | ||||||||
| Уан-CD8-GFP | мембрана привязки | UAS линия | различные акции, например: BL 32184 | 19 | ||||||||
| Уан-CD8-mCherry | мембрана привязки | UAS линия | BL 27391 и 27392 | 20 | ||||||||
| Уан-ладонь-mCherry | мембрана привязки через palmitoylation | UAS линия | BL 34514 | Уан- brainbow | 21 | |||||||
Таблица 1: Дневно меткой белковых маркеров для изучения мышц сухожилие морфогенеза в естественных условиях.
Здесь, мы подробно описать, как визуализация мышц сухожилие морфогенеза в живых куколок может выполняться легко и успешно (рис. 1). Кроме того, куколок может быть исправлено, расчленены и immunostained, который позволяет с помощью антител также маркировать белки, для которых не живут маркеры являются доступны22. В этом случае изображений качество как правило, выше, потому что нет никакого движения и структуры интереса могут быть размещены в непосредственной близости от coverslip. Однако рассечение и фиксации может привести к повреждение и молекулярных или ткани динамика, например, мышечные подергивания, можно изучать только в живом организме.
Protocol
1. стадии куколки
- Настройка крест с 20-40 девственной около 20 мужчины и за бутылку летать пищи (Рисунок 1A). Кроме того если будет использоваться запасов, флип каждой акции в новые бутылки. Чтобы получить достаточное количество куколок, рассмотреть вопрос о создании двух бутылок в генотип.
- Инкубируйте бутылки при 25 ° C (или 27 ° C согласно экспериментальный дизайн) на пять-шесть дней (рис. 1B).
Примечание: Держите листать мух каждые два-три дня во избежание переполненности тюрем и обеспечить непрерывную поставку куколок. - Использование мокрой кистью для сбора белые prepupae от стен бутылки и перенести их в стеклянных скольжениях (рис. 1 c). Время постановки, таким образом, что куколки достичь желаемого возраст при запуске живых изображений под микроскопом.
Примечание: Эти prepupae выглядят как старые куколки с точки зрения их формы, но они по-прежнему белый, как личинки. Начало этапа prepupal определяется как 0 h после формирования puparium (0 h НФА). - Удалить Купы летать пищи, придерживаясь куколки с мокрой кистью и ориентировать вентральной стороне куколок сторону стекла слайд с помощью стереомикроскопом (рис. 1 d). Отказаться от куколок, по-прежнему движемся (слишком молодых) или что начали повернуть коричневый (слишком стар). Это гарантирует, что все куколки у того же возраста (0 - 1 h НФА).
- Ярлык слайды с генотипом, Дата и время сбора. Переложите стеклянных скольжениях одной Петри блюдо и добавьте влажной ткани, чтобы предотвратить куколки от высыхания (Рисунок 1E).
- Храните куколки в инкубаторе при 25 ° C или при 27 ° C, до тех пор, пока они достигают нужного возраста. Продолжать последующие шаги 1 ч до изображений, так что куколки имеют требуемый возраст при запуске живых изображений (шаг 3), например в 13 h APF-фильтр для фильма показано на рисунок 2A-D.
Примечание: Ранние возможно время точкой отсчета является после головы выворот куколок, происходящих на 8-10 ч НФА в 27 ° C.
2. Подготовьте куколок для изображений
- Убедитесь, что куколки теперь придерживаться стекла слайд, так же, как они естественно прилипнет к стенкам бутылки из-за остаточного летать пищи. Без дополнительных клея не требуется. Если куколки не втыкать достаточно хорошо из-за высокой влажности, откройте Петри за несколько минут позволить им высохнуть. Кроме того, перевести их на двухсторонний скотч на слайде стекла, но обычно это не является необходимым.
-
Открытое окно в куколки случае для визуализации косвенных рейса мышц (Рисунок 1F; Перейти к разделу 2.3 для визуализации брюшных мышц.)
- Ориент куколок, наклеивания на стекло слайд с передней стороне от исследователь под стереомикроскопом. Измените масштаб 2 X.
- Используя один конец биологии сорт #5 щипцы, аккуратно засуните отверстие в куколки дело спинной крыло, где заканчивается живота и грудной клетки начинается.
- Срез открытым куколки дела, аккуратно переместите щипцы в передней конец грудной клетки вдоль крыла но избежать повреждения ткани уязвимых крыла.
Примечание: Если жидкость просачивается из куколки, он поврежден; отменить его и начать все заново с различных куколки. - Поднимите разделе куколки дела выше грудной клетки с щипцами и затем отрезать этот раздел с тонкой, острые ножницы, на противоположной стороне спинной срединной.
-
Открытое окно в куколки случае для визуализации мышц брюшного пресса (Рис. 1 g)
- Ориент куколок, наклеивания на стекло слайд с передней лицом к исследователь под стереомикроскопом. Измените масштаб 2 X.
- Используя один конец биологии сорт #5 щипцы, аккуратно засуните отверстие в куколки дело спинной крыло, где заканчивается грудной клетки и живота начинается.
- Для среза открытым куколки дела, осторожно перемещайте щипцами в конце заднего брюшка.
Примечание: Если жидкость просачивается из куколки, он поврежден; отменить его и начать все заново с различных куколки. - Поднимите разделе куколки дела выше живота с щипцами и затем отрезать этот раздел с тонкой, острые ножницы, на противоположной стороне спинной срединной.
-
Гора куколок (Рис. 1 H)
- Использование мокрой кистью для передачи до пяти куколки в пластиковых слайд с пазом (заказ, многократно, см. обсуждение и список материалов). Добавьте один или два coverslips прокладку для каждой стороны в зависимости от глубины паза и толщина куколок. Положите небольшое падение воды под каждую распорку coverslip сделать его придерживаться слайд и оставить пространство между паза и coverslips прокладку на каждой стороне.
Примечание: Coverslips прокладка может быть окончательно присоединен к слайду с супер клей, заранее. - Ориент куколок, таким образом, чтобы отверстие в куколки случае смотрело вверх с помощью кисти. Обеспечить тщательное позиционирование куколок на правильный угол для хорошего качества изображений. Оптимизируйте угол для каждой ткани и этапе развития.
Примечание: Небольшое количество воды в groove делает позиционирования куколки легче. Слейте лишнюю воду с помощью кисти, потом, чтобы избежать утопления. - Провести coverslip (18 x 18 мм) выше куколок, не касаясь их. Место мелких капель раствора глицерина 50% над каждой куколки дело, выходит на coverslip, с помощью пипетки 20 мкл (около 0.5 мкл).
Примечание: Данная процедура гарантирует, что капли имеют такое же расстояние, что куколки. - Переверните coverslip и разместите его над куколок вручную или с помощью щипцов (Стандартный #5) во время отдыха с одной стороны coverslip на прокладку coverslips рядом с куколок. Далее аккуратно удалите coverslip на куколок. Убедитесь, что куколки случае отверстия должным образом покрыты 50% глицерина для хорошего качества изображения и для предотвращения куколки от высыхания.
- Сложите более одного конца кусок клейкой ленты и захватить его с щипцами (Стандартный #5) в этом направлении. Осторожно поместите ленту, таким образом, что она охватывает один край верхней coverslip, coverslip(s) прокладку и пластиковых слайдов на одной стороне. Пока не нажимайте клавишу вниз ленты. Во-первых превратить слайд вокруг и повторите для другой стороны.
- Используйте оба индекса пальца для Прижмите ленту одновременно с обеих сторон. Эта процедура гарантирует, что куколки не смещаются.
- Проверьте ли куколки хорошо контактируют с coverslip. Для оптимального качества изображения куколки следует слегка сжал под coverslip. При необходимости настройте количество coverslips прокладку.
- Метка слайда, написав на липкой ленте.
- Использование мокрой кистью для передачи до пяти куколки в пластиковых слайд с пазом (заказ, многократно, см. обсуждение и список материалов). Добавьте один или два coverslips прокладку для каждой стороны в зависимости от глубины паза и толщина куколок. Положите небольшое падение воды под каждую распорку coverslip сделать его придерживаться слайд и оставить пространство между паза и coverslips прокладку на каждой стороне.
3. жить изображений из куколок
- Метод монтажа позволяет изображений куколок, как на Перевернутый микроскопы (Рисунок 1I), так и на вертикальном микроскопы (Рисунок 1J). Особенно подходит для сканирования изображений живой конфокальные микроскопы, Микроскопы двух Фотон и вращающийся диск конфокальные микроскопы независимо от ли они инвертированы или вертикально. Для долгосрочной фильмов используйте стадии контролируемой температуры, если доступны.
- С помощью окуляра и УФ-лампа или передачи света, найдите куколки и фокус внутри куколки.
- С помощью камеры, найти нужную структуру и отрегулируйте уровень масштабирования.
- Для долгосрочной фильмов определить z стека, которая охватывает структуры интерес хорошо (например, мышцы косвенным рейса, их сайты вложений, сухожилие клетки или сочетание вышеупомянутых) и выберите интервал времени. Рассмотреть возможность усреднения для лучшего качества изображения. Для высокоскоростных, краткосрочные фильмов выберите один z самолет для достижения высокой частота.
- Отрегулируйте мощность лазера дать лучшие возможные сигнала, но мало насыщения. Однако слишком высокие лазерного луча может повредить куколки с течением времени.
- Начало обработки изображений и вернуть время от времени проверять фильм и скорректировать позиционирование z стека, при необходимости.
Рисунок 1: рабочий процесс для живых изображений мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы . Смотреть протокол для деталей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Representative Results
Фотосъемка в естественных условиях в разработке летать куколок, что делает их идеальной модели системы к изучению морфогенеза органов взрослых может быть различных тканей. Среди них являются косвенные полет мышцы, грудной клетки эпителия, включая клетки сухожилия, крыло эпителия, брюшных мышц и сердца22,23,24,25,26 , 27. здесь, мы ориентируемся на живых изображений мышцы и сухожилия морфогенеза. Подробное описание косвенных полета мышц и мышц живота морфогенеза и дополнительные методы для изучения биологии мышц у дрозофилымы отсылаем читателя к Weitkunat и шноррер 201422.
Жить, визуализации косвенных рейса мышц
Для изучения долгосрочного развития мышц косвенные рейса, состоящий из dorsolongitudinal мышц (DLMs) и dorsoventral мышц (DVMs), шаровых Moesin меткой актин связывающий домен с GFP (UAS -GFP-Gma) была выражена во всех мышцы с помощью Myocyte усилитель фактор 2 (Mef2)-GAL4 драйвер (рисунок 2A-D, Фильм S1). До обработки изображений, окно в куколки случае был открыт выше грудной клетки, как показано на рисунке 1F. На двух Фотон микроскопа z стеки были приобретены каждые 20 мин для 21 h, начиная ≈11 h после формирования puparium (11 h НФА). В этот период времени, DLMs (зеленый оверлеев в рисунке 2A'-D') сначала инициировать привязанность к сухожилия клетки (рисунок 2A) и затем разделить хотя Зрелые мышцы насадки (рис. 2B). Далее myotubes сократить (рис. 2 c), пока они, наконец, достичь максимально сжатой стадии в 30 h APF (Рисунок 2D). Взятые вместе, этот фильм подчеркивает резкие перемены в морфологии мышцы которые происходят на шкале времени часов.
Рисунок 2: Live изображений косвенных полет мышцы и сухожилия морфогенеза. (A-D) Времени точек от двух Фотон фильм (кино S1) с помощью Mef2-GAL4, бас- GFP-ГОМС как маркер для актина в мышцах косвенные рейса, состоящий из dorsolongitudinal мышц (DLMs, выделены зеленым цветом в A'-D') и dorsoventral мышцы ( DVMs, выделены синим цветом в A'-D'). Масштаб гистограммы являются 100 µm. (E-H) моменты времени от двух Фотон фильм (кино S2) с помощью Duf-GAL4бас-CD8-ГФП в качестве маркера для косвенных полет мышцы и грудной клетки эпителия, включая клетки сухожилия. Панелей E'-H' Показать наложение с моделью системы мышц сухожилие в каждый момент времени, подчеркнув давно сотовой расширения формируется сухожилия эпителия (пурпурный) при контакте с мышц (зеленый). Масштаб гистограммы являются 100 мкм (по оценкам от размер образа структур). (I Л) Время очка от двух цвет, спиннинг диск конфокальный кино (фильм S3) упором на мышцы сухожилие вложение посвящения. Сухожилия клетки помечены с sr-GAL4бас-ладонь-mCherry (пурпурный) и косвенные dorsolongitudinal полет мышцы с Mhc -Тау-GFP (зеленый). Масштаб гистограммы являются 10 мкм. время обозначается как HH: mm после формирования puparium (АТФ). Обратите внимание, что не все фильмы были приобретены на сцене с контролируемой температурой, следовательно, развития сроки могут различаться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Для изучения сухожилия и мышцы морфогенеза в то же время, мембрана прыгните GFP (UAS -CD8-GFP) была выражена с помощью Dumbfounded (Duf)-GAL4 как водитель, который выражается в клетки сухожилия и косвенные полет мышцы (Рисунок 2E -H, фильм S2). Z стека было принято два фотона Микроскоп каждые 20 мин, начиная с 16 h APF-фильтр для 20 h. В то время как компактные myotubes (зеленый оверлея в рисунке 2E'-H'), сухожилия клетки формы долго сотовой расширений, которые удлиненное со временем (пурпурный оверлея в рисунке 2E'-H'). Взятые вместе, этот фильм подчеркивается тесное взаимодействие между сухожилия и мышечные клетки в естественных условиях.
Для изучения взаимодействия сухожилия мышцы более подробно, два цвета, высокого увеличения изображений была выполнена. Куколки с тяжелой цепи миозина (Mhc)-Тау-ГФП в DLMs и бла -palmitoylated-mCherry (бас -ладонь mCherry) обусловлен полосой (sr)-GAL4 в сухожилиях были образы каждые 5 мин, начиная с 12 h APF-фильтр для 4,5 ч на вращающийся диск Конфокальный микроскоп (Рисунок 2I-L, фильм S3). В 12 ч НФА myotubes мигрировать их клетки-мишени сухожилие при формировании длинные filopodia на их советы (Рисунок 2I). Впоследствии мышцы и сухожилия тканей interdigitate (Рисунок 2J, K) сформировать стабильное вложение. Как вложение созревает, меньше формы filopodia и мышц сухожилие интерфейс выравнивает (рис. 2 L). Таким образом два цвета, высокого увеличения изображений может использоваться раскрыть сотовой динамика в деталях в живом организме.
Жить, визуализации мышц брюшного пресса
Для живой томография брюшной мышцы (рис. 3фильм S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP был использован в качестве маркера и окно было открыто выше живота в куколки случае, как подробно указано в Рисунок 1 g. Подобно фильм мышц косвенные рейса, представлены на рисунке 2A-D, формирования и роста мышц живота может следовать в течение многих часов развития (55 h в кино S4). В это время сомитов предохранитель в форме растущей myotubes (рис. 3A). Советы myotube перенести их сухожилия цели, и после присоединения к клеткам сухожилия, образуются сократительной единицы мышц, sarcomeres, (рис. 3B-D).
Рисунок 3: Live томография брюшной мышцы морфогенеза. (A-D) Времени точек из фильма (фильм S4) с помощью Mef2-GAL4бас-CD8-GFP как маркер следовать морфогенеза брюшной мышцы. Панелей A'-E' Показать оверлеи с моделями брюшной мышцы набора (зеленый), который образует de novo на стадии куколки. Масштаб гистограммы являются 100 µm. время обозначается как HH: mm НФА. Фильм был приобретен при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Живут изображений из подергивание мышц
В отличие от Рисунок 2 и на рисунке 3, на рисунке 4 показана динамика мышц, происходящих на шкале времени секунд: живая запись сокращения мышц. Куколки, выражая βPS-Интегрин-GFP под внутреннего контроля были образы с разрешением время 0.65 s в одной плоскости z на конфокального микроскопа (Фильм S5). В этом примере отображены на рисунке 4вложение сайты трех DVMs (рис. 4A) были образы за 10 мин, начиная с 42 h НФА. В это время, пять дергаться события были замечены (рис. 4B-F), показаны, что sarcomeres уже собраны достаточно хорошо для поддержки согласованных сокращений в этот момент времени в процессе развития. Следовательно изображения подергивания мышц может использоваться как функциональной считывания для sarcomerogenesis уже во время косвенные полет мышцы развития28, противоположность например летных испытаний, которые могут выполняться только после eclosion.
Рисунок 4: Live изображений подергивания мышц. (A) первый момент из фильма (фильм S5) показаны подергивания мышц dorsoventral косвенные рейса на 42 h НФА с помощью βPS-Интегрин-GFP как маркер. В поле зрения являются мышцы вложение сайты DVM II 2, DVM III 1 и DVM III 2. (B-F) Цвет оверлеи, пяти отдельных дергаться событий каждый показаны перед дергаться (пурпурный) и первым кадром дергаться события (зеленый). Обратите внимание, что отдельные волокна мышцы дергаться независимо друг от друга. Стрелки подчеркнуть twitching движения. Время разрешения фильма являются 0,65 бара s. масштаба 25 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Жить, визуализации эндогенно тегами белков
Похож на βPS-Интегрин-GFP, большая коллекция синтез белков, выраженная в дрозофилы под контролем эндогенного был созданный в2,3,4. Эти летать линии может использоваться для изучения например субцеллюлярные локализации или выражение профили протеинов интереса. Коллекция является особенно полезным, если специфические антитела не доступны или динамики белков должны быть исследованы в естественных условиях без фиксации. Рисунок 5 показывает три примера из летать библиотеки TransgeneOme (fTRG), Ху ли Тай Шао (Hts) эндогенно синтез белков-ГФП (Рисунок 5A, B), Талин-GFP (рис. 5 c, D) и βTubulin60D-GFP ( Рисунок 5E, F). Выражение этих белков могут изучаться во всех тканях, которые выражают их естественно. Здесь мы покажем грудной клетки эпителия (Рисунок 5AC, E) и косвенные полет мышцы или их привязанность сайтов (Рисунок 5BD, F) в качестве примеров.
Рисунок 5: живая визуализация эндогенно меткой белков. (А, Б) Максимальная прогнозы z стеки, принятых из куколок, выражая Hts-GFP. (C, D) Максимальная прогнозы z стеки, принятых из куколок, выражая Талин-GFP. (E, F) Максимальная прогнозы z стеки, принятых из куколок, выражая βTubulin60D-GFP. Панелей A, C и E показывают грудной клетки эпителия в 18, 24 и 18 h НФА, соответственно и панелей B, D и F Показать мышцы косвенным рейса или их привязанность сайтов в 30 h НФА. Масштаб гистограммы являются 25 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Представленные протокол описывает изображение мышц сухожилие морфогенеза в жизни дрозофилы куколок, с использованием различных дневно тегами белков. Это в vivo imaging стратегия может использоваться для изучения процессов развития в их естественной среде всего организма.
Это важно для успешного эксперимента, чтобы найти точку развития правильное время для анализа. Например dorsolongitudinal косвенные полет мышцы инициировать привязанность к цели их сухожилия на ≈16 h НФА23 пока мышцы живота развиваться позже и прикрепить на обоих концах только между 30 и 40 h НФА26. Следовательно ранее опубликованной литературы должны использоваться найти нужное время точки развития для анализа или, если ткани или структуры интереса не было изучено в деталях до, общего развития должна характеризоваться сначала.
Для монтажа куколок успешно на заказ пластиковых слайдов, важно, что пазы имеют подходящие размеры: канавки должны быть 1,0-1,5 мм широкий и 0,3 - 0,4 мм глубиной. Эта глубина позволяет настроить точное расстояние до верхней coverslip с coverslips прокладку при необходимости. Однако по крайней мере один заполнитель coverslip должен использоваться во избежание слива 50% глицерина от образца капиллярных сил. Правильное позиционирование куколки в паз требует некоторых опыт и должны быть оптимизированы таким образом, что структура интерес как можно ближе к coverslip.
Если большое количество куколок, как предполагается, будут отражаться в Микроскоп одной сессии, они могут быть установлены заранее и затем хранятся в инкубаторе до изображений для обеспечения надлежащего развития сроки. Куколки должен пережить всю процедуру и также по крайней мере попытаться Эклоз, если на слайде после съемки. Выживаемость может использоваться как индикация для проверки ли визуализации условия вреда куколок.
Параметры обработки изображений должны быть выбраны тщательно экспериментальной требованиям. Для краткосрочных фильмов высокая частота по сравнению с высоким соотношением сигнал шум должна быть сбалансированной, в то время как относительно высокие лазерного луча может использоваться без повреждения куколки слишком много. Однако для долгосрочных фильмов, мощность лазера должен храниться на среднем уровне и куколки не должно быть постоянно imaged а в определенные моменты времени, например, каждые 20 мин. Чтобы гарантировать, что структура интерес не перемещается из поля зрения, было бы необходимо скорректировать позиционирование z стека между моментами времени. К нашему знанию открытие куколки дела само по себе не влияет на сроки развития. Однако контролируемой температурой стадии следует используется для долгосрочного фильмов для обеспечения надлежащего развития сроки. Учитывая эти соображения, весьма информативным фильмы могут быть приобретены.
Представленные протокол может использоваться для визуализации не только мышцы сухожилие морфогенеза, но и другие развивающиеся ткани, например, крыло эпителия29. Только три изменения настоящего протокола требуются: (1) открытие куколки дела выше крыло вместо грудной клетки или живота, (2) позиционирование куколки с крылом к верхней coverslip и (3) использование белков различных флуоресцентных маркеров. С выдвижением ТРИФОСФАТЫ/Cas9-технологии более эндогенно Теги флуоресцентные белки будут доступны, потому что он стал проще для эндогенного локусов в дрозофилы30,31 , 32. в будущем, это позволит, изучение динамики многочисленных белков, клеток и весь тканей в их физиологической среде в деталях.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Manuela Weitkunat за приобретение фильм S3. Мы благодарны Reinhard Фасслер за щедрую поддержку. Эта работа была поддержана, ЭМБО молодой следователь программы (ф.с.), Европейский исследовательский совет по седьмой рамочной программы Европейского союза (FP/2007-2013) / ERC Грант 310939 (ф.с.), Общество Макса Планка (S.B.L., ф.с.), Национальный центр де ла Recherche Scientifique (CNRS) (ф.с.), инициатива совершенства AMIDEX университета Экс-Марсель (Ф.С), LabEX-Информ (ф.с.) и Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
- Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
- Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), Cambridge, England. 3333-3341 (1997).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
- Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
- Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
- Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
- Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
- Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
- Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
- Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
- Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
- Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), Cambridge, England. 621-626 (2008).
- Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
- Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), Cambridge, England. 1261-1272 (2017).
- Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
- Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
- Classen, A. -K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), Bethesda. 2409-2418 (2014).
- Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
