Summary
在这里描述的两种不同的 3 ' 快速扩增的 cDNA 结束 (3 ' 种族) 协议使用两种不同的 DNA 聚合酶来映射序列, 包括开放阅读框架 (ORF) 的一部分, 停止密码子, 和整个 3 ' UTR 的成绩单使用 RNA从不同的癌细胞系获得的。
Abstract
真核基因的成熟涉及 3 ' 端形成, 这涉及到增加一个聚 (a) 尾。为了图 3 ' 末端的基因, 传统的选择方法是 3 ' 快速扩增的 cDNA 末端 (3 ' 种族)。3 ' 种族协议需要仔细设计和选择嵌套底漆在 3 ' 未翻译的区域 (3 ' UTR) 的目标基因感兴趣。然而, 通过一些修改, 该协议可用于包括整个 3 ' UTR 和序列在开放阅读框架 (ORF), 提供了一个更全面的图片与 3 ' UTR 之间的关系。这是除了识别的 polyadenylation 信号 (PAS), 以及分裂和 polyadenylation 网站提供的常规 3 ' 种族。扩展 3 ' 种族能发现异常的 3 ' UTRs, 包括基因融合在 3 ' UTR 之内, 并且序列信息可以被使用预测潜在的 miRNA 结合的站点和不稳定的元素可能影响成绩单的稳定。
Introduction
3 ' 末端的形成是 mrna 成熟的一个关键步骤, 它包括 PAS 的前 mRNA 下游的分裂, 然后加上 250 untemplated adenines, 组成了聚 (a) 尾1,2。聚 (a) 结合蛋白 (PABP) 绑定到聚 (a) 尾, 这保护 mRNA 转录不退化, 并促进翻译1。
目前的估计表明, 70% 的人类基因有多个通过, 从而接受替代的 polyadenylation, 导致 3 ' 末端3。因此, 重要的是要确定多 (A) 尾附加到 3 ' UTR 的其余部分, 并确定任何给定的成绩单使用的考绩制度。下一代测序的出现导致了同时识别 3 ' UTRs 和成千上万基因的通过。这种测序能力的提高需要开发生物信息学算法来分析涉及 3 ' 端的替代 polyadenylation 的数据。对于 "从头" 检测或验证 PAS, 从而从大型序列数据中映射单个基因的 3 "结束", 3 ' 种族仍然是选择4,5的方法。在 3 ' 种族的 cDNA 产品中包含的序列通常只包括 3 ' UTR 的一部分, 其中包含了聚 (a) 尾、解裂部位、pas 和 pas 上游的序列。不像 PCR, 这需要设计和使用的基因特异正向和反向引物, 3 ' 种族只需要两个基因特定的嵌套前引物。因此, PCR 要求更详细地了解被放大的基因的大区域的核苷酸序列4,6。由于 3 ' 种族使用相同的反向底漆为所有 polyadenylated RNA 记录的聚 (A) 尾, 只有向前引物需要基因特异性, 因此, 只需要知识的 mRNA 的一个显着较小的区域。这使序列未完全特征化的区域放大4、7。这使得 3 ' 种族不仅用于确定一个基因的 3 ' 末端, 而且还确定和描述在 PAS 上游的大区域, 形成了 3 ' UTR 的重要部分。通过将 5 ' 种族与修改后的 3 ' 种族相结合, 其中包括 3 ' UTR 和侧翼区域的较大部分, 可以完全序列化或克隆从 5 ' 端到其 3 ' 端8的整个 mRNA 记录。
这种应用的修改 3 ' 种族的例子是最近鉴定的新的CCND1-MRCK融合基因转录从地幔细胞淋巴瘤细胞系和癌症患者。3 ' UTR 包括来自CCND1和MRCK基因的序列, 并被顽固地 miRNA 调节9。两个嵌套CCND1特定正向引物与CCND1停止密码子的相邻和下游区域互补。虽然整个转录测序连同特定的生物信息学工具可以用于检测 3 ' UTR 10 中的基因融合, 但许多实验室可能缺乏利用这项技术的财力资源或生物信息学专业知识.因此, 3 ' 种族是一个替代的诺新识别和验证的新型融合基因涉及 3 ' UTR。考虑到已报道的融合基因的数量急剧增加, 以及通过成绩单阅读, 3 ' 种族已经成为一个强大的工具, 以表征基因序列11,12。此外, 最近的研究表明, 在 3 ' UTR 和 3 ' UTR 的长度不同的序列可能影响 mRNA 转录稳定性, 本地化, 可译性和功能13。部分原因是对绘制转录的兴趣增加, 在实验室中开发的不同 DNA 聚合酶的数量有所增加。重要的是要确定哪些类型的修改可以对 3 ' 种族协议, 以利用现有的 DNA 聚合酶的曲目。
此工作报告通过使用ANKHD1中ANKHD1部分中的嵌套底漆和两个不同的 DNA 聚合酶, 调整 3 ' 种族, 以映射整个 3 ' UTR、PAS 和 3 ' 末端解切站点成绩单。
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Protocol
在执行本协议中的所有步骤时, 始终佩戴实验室大衣、手套和安全眼镜。确保含有苯酚和异硫氰酸胍试剂的容器/管只在经认证的罩盖中打开, 并在指定容器中处理苯酚废料。使用 DNAse/RNAse 无菌管, 提示和试剂。
1. 细胞培养
- 生长的 HeLa 细胞线和两个悬浮地幔细胞淋巴瘤细胞系, Granta-519 和 Jeko-1, 在 DMEM 含有10% 血清和 100 U/毫升青霉素/链霉素在一个湿润的孵化器与 5% CO2在37°c。使用粒子计数器14稀释单元格1:10 并计数。
- 用于 RNA 提取, 板50万细胞/井在6井板 (每井2毫升介质)。孵化24小时后, 从细胞中收集 RNA。
2. RNA 提取
- 收获细胞
注: 除离心步骤外, 在组织培养罩中执行所有列出的步骤以保持不孕。- 对于悬浮细胞 (Jeko-1 和 Granta-519):
- 将细胞 (连同2毫升介质) 转移到15毫升管, 离心机在 1725 x g 处进行5分钟的抽吸培养基并将细胞颗粒留在管的底部。
- 并用重悬50µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的细胞颗粒。在1.5 毫升离心管中添加500µL 单相苯酚和异硫氰酸胍试剂到每个样品中。混合好, 并在室温下 (RT) 离开5分钟, 同时反转离心管每1分钟。
- 对于黏附细胞 (HeLa):
- 从每个井中吸入细胞培养介质。每井加1毫升的 PBS, 以洗涤残骸。
- 去除 PBS, 并在每个井中加入500µL 单相苯酚和异硫氰酸胍试剂。
- 在 RT 中孵育5分钟, 轻柔摇摆。转到1.5 毫升离心管。
- 对于悬浮细胞 (Jeko-1 和 Granta-519):
- 细胞裂解
- 将苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物冷冻-20 摄氏度, 1 小时。
注: 混合可在一夜之间留在-20 摄氏度或直到需要。 - 在冰上解冻苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物。在 PCR 罩中添加100µL 氯仿到离心管。涡流样品 10-十五年代, 直到混合物是粉红色和不透明的。在冰上孵化样品 (摄氏4摄氏度), 15 分钟。
- 离心样品为15分钟在 20800 x g 和4°c。小心移除上无色的水相 (~ 200 µL) 和转移到一个新的1.5 毫升离心管。
- 将苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物冷冻-20 摄氏度, 1 小时。
- RNA 降雨雪
- 在每个样品中加入相同数量的异丙醇。添加1µL 的 coprecipitant (参见材料表), 以作为 rna 的载体, 并帮助在后续步骤中可视化 rna。将样品孵育-80 摄氏度, 至少4小时。为了取得最佳效果, 在-80 摄氏度的夜间孵化。
- 将样品转移到冷却离心机上。离心机为35分钟, 在 20800 x 克/4 °c;RNA 会出现在管子底部的蓝色斑点上。小心地从样品中取出异丙醇。添加500µL 80% 乙醇和并用重悬颗粒由简要涡流 3 s。
- 离心样品在 20800 x g 在 RT 5 分钟. 从样品中取出所有的乙醇。让样品空气干燥约10分钟并用重悬样品在35µL 的 RNAse 无水。放置在热块 (65 °c) 为5分钟, 以确保 RNA 完全在溶液中, 并立即将管放在冰上。
- 使用以前描述的分光光度计确定总 RNA 的浓度, 除非使用 RNA 样本的1.5 µL, 而不是1µL15。可以选择在1% 琼脂糖凝胶上运行1µg 的总 rna, 以确定 rna 的完整性。
3. DNase 治疗
- 在对 rna 进行量化后, 对总 rna 进行 DNAse 处理, 以降解任何基因组 DNA。对于每个样品, 添加以下试剂从无 RNAse DNAse 试剂盒, 使20µL 总反应混合在一个单独的离心管:
- 混合2µL 的 DNase 10X 反应缓冲器与4.4 µg 的总 RNA。带水共14µL。
- 添加2µL 的无 RNase DNAse。在2µL RNase 抑制剂 (从反向转录试剂盒) 存在的情况下, 在37摄氏度孵育30分钟。
- 添加2µL 的停止溶液和热量在一个热量块10分钟70°c, 以使 DNAse 酶失效。
注: DNAse 治疗是可选的。
4. cDNA 合成
为最后反应容量50µL:
- 对于最终的反应体积为50µL: 转移22µL 的 DNase 处理的 rna 到一个新的管, 或转移4µg 的总 RNA 与增加的水到总容量22µL 到一个新的管子。从10µM 底漆溶液中添加2µL T7 寡核苷酸25底漆。T7 寡核苷酸25底漆的序列为 5 '-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 '。
- 从反向转录套件添加2µL 的 RNase 抑制剂 (20 U/µL), 8 µL 的5x 反应缓冲器, 4 µL 10 毫米 dNTPs, 和2µL 的逆转录酶 (200 U/µL)。
注意: 建立一个没有反向逆转录酶的反应作为一个阴性控制。 - 孵育在42°c 1 小时直接转移到冰。把管子加热75摄氏度5分钟, 然后将管子放在冰上。
5. 融合基因转录的底漆搜索
-
底漆设计
- 从集成基因组浏览器 (ENST00000360839.6/NM_017747) 下载 cDNA 序列, 并在停止密码器上游的目标记录 (ANKHD1) 的 ORF 中标识一个区域。复制并粘贴整个区域 (最多700核苷酸), 其中包含停止密码子的上游序列进入底漆设计软件 (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index >) 的序列输入区域。
- 选择 "显示自定义设计" 选项, 然后选择 "10" 以确定系统应生成的引物数 (返回结果), 并将所有其他参数设置为默认值。
- 选择五向前底漆和两个不重叠的反向底漆。命令引物和重建与 RNAse/DNAse 水的最终浓度为10µM。有关 PCR 的一般底漆设计的更多详细信息将在其他16中介绍。
-
PCR 识别潜在引物用于随后的 3 ' 种族
注: 为了确定在反应中使用的最终正向底漆, 通过在 pcr 罩中设置不同的正向和反向引物组合, 对所设计的底漆进行测试。- 将 cDNA (2 µL) 转移到新鲜的0.5 毫升 PCR 管。添加1µL 的前底漆和1µL 的反向底漆 (从10毫米底漆溶液)。通过添加8.5 µL 的核酸酶水, 使12.5 µL。添加12.5 µL 的 2x PCR 到凝胶主混合。
- 使用以下 PCR 热循环条件:95 °c 为2分钟跟随29个周期95°c 为三十年代, 60 °c 三十年代和72°c 为 1 min. 设置最后周期在68°c 为7分钟。
- PCR 后, 运行的产品在1% 琼脂糖凝胶染色的溴溴。电泳的详细信息如前所述, 有一些修改17。
- 在250毫升的烧瓶中, 将1克琼脂糖溶于100毫升的三醋酸 (泰) 缓冲器中。用微波炉煮。
- 离开冷却1分钟, 并添加7.5 µL 的溴溴化溶液 (10 毫克/毫升股票) 在一个通风罩。将烧瓶旋转, 倒入卧式凝胶装置, 搅拌均匀。在通风罩的 RT 中留出至少30分钟, 使凝胶凝固。
- 用1x 泰式缓冲液盖住凝胶, 将 PCR 产物的10µL 加在琼脂糖凝胶上, µL 3-5 的 DNA 分子量阶梯。运行在 175 V 10 分钟. 使用成像仪可视化产品, 如果需要进一步分离产品, 则运行凝胶以增加 5-10 分钟。
-
3 ' 种族的嵌套引物选择
- 分析 pcr 琼脂糖凝胶的结果, 选择具有独特、强、单一 PCR 波段的引物。使用 5 '-最底漆 (ANKHD15 '-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3 ') 连同 T7 oligodT25底漆在第一次 PCR 运行。
- 选择位于第一个底漆下游的嵌套底漆 (ANKHD1 5 '-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 '), 并在第二套 PCR 反应中使用 T7 底漆 (5 '-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3 ')。
6. 利用两种不同的酶优化 3 ' 种族来映射 3 ' UTR
注: 用于 PCR 的 DNA 聚合酶的多样性有所增加;因此, 我们想确定的标准条件, 可以应用, 即使在使用不同的酶 3 ' 种族 PCR 反应。任何成绩单的反向引物保持不变;唯一的更改在嵌套的向前引物中, 特定于目标记录。
-
协议 1: 3 ' 种族使用改进的脱氧核糖核酸聚合酶从Pyrococcus furiosus (Pfu)
- 第一 PCR
- 将1µL 的 cDNA 转移到 PCR 管, 并添加5µL 10x Pfu反应缓冲器。添加1µL 的第一个嵌套正向底漆, 1 µL 的 T7 oligodT25底漆, µL 1 dNTPs (从 10 mM 解决方案)。
- 增加40µL 的水, 使49µL 总体积。添加1µL 的Pfu DNA 聚合酶并混合良好。在表 1中使用 pcr 配置文件运行 pcr。
- 二次 PCR
- 将2µL 的产品从第一 pcr 转化为新的 pcr 管, 并与5µL 10x Pfu超 II 反应缓冲器混合使用。添加1µL 的第二套 PCR 底漆, 1 µL 的 T7 底漆, 1 µL dNTPs (10 毫米溶液)。
- 增加39µL 的水, 使µL 总反应量达到49。添加1µL 的Pfu DNA 聚合酶。使用与第一个 pcr 设置相同的 pcr 配置文件 (表 1) 运行 pcr。
- 第一 PCR
-
协议 2: 3 ' 种族使用嵌合体 dna 聚合酶组成的 dna 结合域融合到Pyrococcus类校对聚合酶 PCR 主混合
- 第一 PCR
- 将1µL 的 cDNA 转移到 PCR 管上。添加1µL 的第一个嵌套正向底漆和1µL 的 T7 oligodT25底漆。增加22µL 的水, 使25µL。
- 添加25µL 的 2x PCR 大师混合和混合良好。使用表 2中描述的 PCR 循环条件。
- 二次 PCR
- 将2µL 的产品从第一 pcr 转到新的 pcr 管。添加1µL 的第二嵌套 PCR 底漆连同1µL 的 T7 反向底漆。
- 增加22µL 的水, 使25µL。添加25µL 的 2X PCR 主组合。使用与第一个 pcr 设置相同的 pcr 配置文件 (表 2) 运行 pcr。
- 第一 PCR
7. 验证第二次 PCR 产品的 3 ' 种族。
- 采取 5-10 µL 的第二个 PCR 产品 (以及产品从第一轮 PCRs, 如果记录是丰富的表达) 和运行在琼脂糖凝胶。设置凝胶并运行以前描述的电泳 (步骤5.2.3.1 到 5.2.3.3)。在成像仪上可视化结果。
8. 产品提纯和测序
- 根据制造商的协议, 用凝胶和 PCR 片段 DNA 清理系统从二次 pcr 中纯化凝胶 pcr 产物。
- 执行桑格测序 (或者, 将凝胶纯化的 PCR 产品样品和适当的测序底漆发送到测序实验室)。对测序数据进行分析。
- 下载序列分析软件 (请参阅材料表) 并将跟踪文件导入软件中。使用单个纯基 QVs (质量值) 获取基本调用信息18。下载的色谱与高品质的痕迹, 以供观赏。
可选: 可使用适当的克隆试剂盒克隆纯化的产品, 并为桑格测序发送独立克隆。
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Representative Results
嵌套正向底漆搜索:
琼脂糖凝胶来自图 1显示两种不同的 PCR 凝胶产品 (车道1和 2), 使用相同的正向底漆, 但不同的反向底漆。3车道有一个独特的 PCR 产品, 并有一个明显的向前和反向底漆。用于 pcr 反应的理想引物是那些给出一个独特的 pcr 产品 (车道 3)。在1和2车道上使用的正向底漆给出了最强的波段, 并给出了最大的 PCR 产品 (预期), 并被用作第一前沿底漆。第二套 3 ' 种族 PCR 反应的巢式底漆是3车道的正向底漆。
不同的 DNA 聚合酶用于 3 ' 种族产生相似的结果:
两种不同的 DNA 聚合酶产生了相同大小的 pcr 产品, 尽管有不同的 pcr 循环条件为 3 ' 种族 (图2)。预期的 PCR 产品只有一个不同的波段。所有的负逆转录酶阴性对照 (-) 没有一个波段, 显示没有基因组污染的 RNA 用于 cDNA 合成以及随后的下游反应。
桑格测序结果:
PCR 产物经凝胶纯化, 并送到了桑格测序。图 3A中显示的结果显示了来自桑格排序的序列色谱仪的一部分。有代表性的序列标识停止密码子的位置、假定的 polyadenylation 信号和解切站点, 以及 3 ' 种族产品 (图 3B) 中的聚 (A) 尾。
图 1: 在 3 ' 种族中使用的两个嵌套基因特定正向引物的标识.以分子量 (兆瓦) 阶梯为溴的溴化酶染色琼脂糖凝胶, 以 HeLa cDNA 为例, 对不同基因特异正向和反向引物组合的 PCR 产物进行了研究。车道1和2是 PCR 产品从同一基因特异正向底漆, 但不同的反向引物。箭头指向预期的 PCR 产品为每条车道。除了为预期的 PCR 产品带, 还有一个额外的波段。单 PCR 产品在车道3是从不同的基因特定嵌套正向和反向底漆, 并显示了单一的预期波段。
图 2: 验证 3 ' 种族产品从第二套 PCR 反应.从第二次 PCR 反应的产品 (A) Pfu dna 聚合酶和 (B) 嵌合 dna 聚合酶在琼脂糖凝胶上运行, 溴溴。由 (-) 描述的车道是从阴性对照样本的每一个细胞线时, RNA 合成的基因在没有逆转录酶的情况下进行。车道1和2是 PCR 产品从生物复制每个细胞线。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 映射 3 ' 种族的 PCR 产品.(A) 凝胶纯化的 3 ' 种族产品序列色谱的一部分, 显示预测的 polyadenylation 信号和聚 (A) 尾的位置。(B) 来自 polyadenylation 序列数据的具有代表性的序列, 它显示了停止密码子、信号 (PAS)、聚 (a) 尾的解理和附着位置以及聚 (a) 尾序列的一部分。请单击此处查看此图的较大版本.
| 循环步骤 | 温度和持续时间 | 周期数 |
| 初始变性 | 95°c 为3分钟 | 1 |
| 初始退火和扩展 | 50°c 为5分钟和72°c 为10分钟 | 1 |
| Subcyles (变性、退火和延伸) | 95°c 为四十年代, 50 °c 为1分钟和72°c 为3分钟 | 20 |
| 最终周期 (变性、退火和延伸) | 95°c 为四十年代, 50 °c 为1分钟和72°c 为15分钟 | 1 |
| 举行 | 4°c, ∞ |
表 1: Pfu DNA 聚合酶 PCR 循环条件为 3 ' 种族。
| 循环步骤 | 温度和持续时间 | 周期数 |
| 初始变性 | 98°c 为3分钟 | 1 |
| 初始退火和扩展 | 50°c 为5分钟和72°c 为10分钟 | 1 |
| Subcyles (变性、退火和延伸) | 98°c 为三十年代, 50 °c 为1分钟和72°c 为4分钟 | 20 |
| 最终周期 (变性、退火和延伸) | 98°c 为三十年代, 50 °c 为1分钟和72°c 为15分钟 | 1 |
| 举行 | 4°c, ∞ |
表 2: 嵌合体 DNA 聚合酶 PCR 循环条件。
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Discussion
尽管大规模并行测序技术的出现, 在基因的基础上, 3 ' 种族仍然是最简单和最经济的方法, 以确定的 PAS 和核苷酸相邻的聚 (a) 尾。这里描述的适应扩展使用 3 ' 种族放大和地图序列包括部分的 ORF, 停止密码子, 和整个 3 ' UTR 的ANKHD1 mRNA 转录。3 ' 种族的一个主要优势是, 有几个小的适应, 从 3 ' 种族的产品可以克隆成其他载体, 以促进下游审讯 3 ' UTR 功能, 包括 miRNA 靶点, 稳定性检测以及其他机械化验。这可以通过在嵌套底漆序列中包含限制酶站点9、10来完成。可以进行调整, 只包括 3 ' UTR 没有任何序列从 ORF 克隆 3 ' UTR 功能化验5。
3 ' 赛跑成功的一个主要决定因素是开发嵌套的引物, 目标是感兴趣的基因。推荐 Ensembl 基因组浏览器中的 cDNA 序列, 以最好的识别无多态性的区域, 以发展最佳引物。理想的情况下, 有几个嵌套正向底漆以及在感兴趣的基因内至少两个反向底漆可以使用标准 PCR 筛选, 以确定最佳的两个嵌套基因特异引物使用。在这项研究中, 第一个基因特定的前向底漆选择 3 ' 种族最初给了两个带标准 PCR 常规使用的实验室。不幸的是, 底漆设计受到了大量的 SNPs 在感兴趣的成绩单。在目标记录中的 SNPs 导致引物和目标之间的不匹配, 这可能导致低效的退火和放大, 并且应该减少到最小的19。在一个底漆中至少有四个 SNPs, 或者五不匹配 (三在一个底漆和另外两个) 中出现, 可能导致对 PCR 反应的完全抑制, 因此唯一的选择是设计更多的引物20。而不是设计更多的引物, 以获得一个单一波段的标准 pcr 用于底漆搜索在这里报道, pcr 循环条件和 DNA 聚合酶随后使用的 3 ' 种族被改变, 以优化概率得到一个特定的乐队。变性温度增加了到98°c 为其中一个脱氧核糖核酸聚合酶 (增量从95°c 使用在底漆查寻)。对于两种 DNA 聚合酶使用的 3 ' 种族 PCR, 最初变性持续时间增加到3分钟, 而不是建议的三十年代到2分钟, 以便完全变性 cDNA 模板。例如, T7 寡核苷酸 dT25底漆可能形成弱二次结构, 这可能会减少引物21的可用性。增加初始变性长度和温度打破任何次级结构, 并帮助产生的单一特定波段后的最后一个周期的 3 ' 种族。此外, 非特异带比预期波段轻, 表明它出现在更高的 PCR 周期 (最多35个周期);将 PCR 周期限制在 20, 减少了非特定波段的放大。
另一个 3 ' 种族的潜力, 像其他 PCR 反应一样, 是目标区域22的不完全放大。因此, 对于两种高温酶, 初始退火温度设置在50°c 5 分钟, 以优化引物的退火到目标, 这是随后的初始延长温度在72°c 10 分钟。最后的 PCR 周期为每个酵素有最后的延长时间15分钟在72°c。这些扩展步骤比 DNA 聚合酶制造商推荐的要长。长扩展 (伸长) 步骤允许完全合成不完整的 amplicons, 使初始和最终放大产品的完全扩展16。
PCR 步骤, 发生在 3 ' 种族是高度敏感的, 所以他们可能发现基因组 dna (或其他 DNA 污染), 而不是目标 mRNA 转录, 导致在凝胶22上的几个意想不到的带。防止污染的一种方法是在专用的 pcr 罩中进行 pcr 工作, 戴上手套, 并使用清洁试剂和蒸气灭菌管和吸管贴士。在常规 PCR 中, 正向和反向引物可以设计, 使它们位于不同的外显子 (跨内含物引物);这样, 一个异常大的 PCR 产品就意味着含有内含子的区域已经被放大。然而, 这可能并不总是可行的, 如果只有 3 ' UTR 序列, 位于同一终端外显子, 是目标的 3 ' 种族放大。另外, 在 cDNA 合成前, 可以用 DNAse 酶预处理 RNA。使用 T7 寡核苷酸 dT25底漆以质数逆转录酶反应, 而不是随机 hexanucleotide 的第一链 cDNA 合成从 RNA 也减少基因组产品的放大。最后但并非最不重要的一点是, 在图 2中设置一个负控制 ("-" 车道), 强烈建议在没有逆转录酶的情况下建立 cDNA 合成。该控件在随后的 3 "种族程序" 中对其他示例执行相同的步骤。这个控制带的存在意味着潜在的基因组 DNA 污染。
尽管有上述的挑战, 3 ' 种族是一个强大的工具, 绘制 3 ' 结束的个人基因基础。下一代技术的出现导致了 polyadenylation 的记录的增加, 有替代性的3的结果, 这可能是或可能不涉及替代剪接。为了增加复杂性, 在癌细胞中, 染色体重排频繁, 可能导致致癌基因融合产品23。这两个基因之间的融合可能涉及 ORF, 或者, 在某些情况下, 只涉及 3 ' UTR9,10中的序列。此外, 还有连体/共转录基因, 同时转录, 但可转化为不同的蛋白质11。3 ' 比赛可以量身定做所有这些独特的, 不正常的成绩单, 以及正常的成绩单。这一点很重要, 因为这些不正常的记录可能最终成为疾病特异的生物标志物或特定的药物靶点,例如, 药物尼替尼靶向癌症中的BCR-ABL1融合基因。
因此, 3 ' 种族是一个高度多才多艺的技术, 可以用来放大正常成绩单, 识别新的 3 ' UTRs, 和新的基因融合在 3 ' UTR5,9。在本报告中, 3 ' 种族被用来放大和地图的停止密码, PAS, 和整个 3 ' UTR 的ANKHD1转录使用不同的 DNA 聚合酶。所描述的方法可用于映射任何 polyadenylated 记录的 3 ' 结尾。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们想感谢 Bettine 吉布斯的技术帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
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