Summary
Два разных 3' быстрого амплификация cDNA концы (3' гонки) протоколы описанных здесь делают использование двух разных ДНК полимеразы для сопоставления последовательности, которые включают сегмент кадр открытом чтения (ORF), стоп-кодон, и всего 3' УТР Стенограмма с помощью РНК полученные от разных рак клеточных линий.
Abstract
Созревание эукариотические мРНК включает в себя 3' конца образование, которое включает в себя добавление poly(A) хвост. Для того, чтобы карта 3' конца гена, традиционным методом выбора является 3' быстрого амплификация cDNA концы (3' гонки). Протоколы для 3' гонки требуют тщательного проектирования и выбора вложенных грунтовки в течение 3' непереведенные региона (3' УТР) целевого гена интереса. Однако с несколькими изменениями протокол может использоваться для включения всего 3' УТР и последовательности в рамках открытого чтение (ORF), обеспечивая более полное представление о взаимосвязи между ОРФ и 3' УТР. Это в дополнение к идентификации сплайсингу сигнала (ССА), а также на сайте расщепления и сплайсингу, предоставляемый обычных 3' гонки. Расширенный 3' РАСЫ может обнаружить необычные 3' необычных, включая гена сплавливания в течение 3' УТР, и последовательность информация может использоваться для прогнозирования потенциальных Мирна привязки сайтов, а также AU богатые дестабилизирующих элементов, которые могут повлиять на стабильность транскрипт.
Introduction
Формирование 3' конца является важнейшим шагом в мРНК созревания, который включает расщепления пре мРНК вниз по течению ПА с последующим добавлением ~ 250 untemplated adenines, которые составляют1,хвост poly(A)2. Poly(A) привязки белка (РАВР) связывается с poly(A) хвост, и это защищает мРНК Стенограмма от деградации и облегчает перевод1.
Текущие оценки показывают, что 70% генов человека несколько перевал и таким образом пройти альтернативный сплайсингу, что приводит к несколько 3' конца3. Таким образом важно определить, где хвост poly(A) придает остальной части 3' УТР, а так же определить PAS, используемые любой данной транскрипт. С появлением следующего поколения секвенирования привело к одновременной идентификации 3' необычных и перевал тысяч генов. Это увеличение возможности виртуализации требуется разработка bioinformatic алгоритмов для анализа данных, связанных с альтернативными сплайсингу 3' конца. Для обнаружения de novo или проверки системы служебной аттестации и следовательно сопоставления 3' конца отдельных генов из последовательности данных большого объема 3' гонки остается метод выбора4,5. Последовательностей, обычно включаются в cDNA продукции 3' РАСЫ включают только часть 3' УТР, содержащий poly(A) хвост, на сайте расщепления, ССА и последовательности вверх по течению ССА. В отличие от PCR, который требует разработки и использования конкретных прямого и обратного праймеров гена, 3' гонка требует только два гена конкретных вложенных вперед грунтовки. Следовательно PCR требует более детального знания нуклеотидной последовательности гена, усиленные4,6большого региона. С 3' гонка использует то же обратный грунтовка, что цели, poly(A) хвост для всех polyadenylated РНК стенограммы, только вперед грунтовки должны быть ген конкретные, таким образом, только требует знания значительно меньше региона мРНК. Это позволяет амплификацию регионов, чьи последовательности не являются полностью характеризуется4,7. Это позволило 3' гонки использоваться не только для определения 3' конца гена, но также определить и охарактеризовать крупных регионах вверх по течению ССА, которые составляют значительную часть 3' УТР. Объединив 5' гонки с модифицированных 3' раса, которая включает в себя большие части 3' УТР и фланкируя регионов, можно полностью последовательности или клонировать весь мРНК Стенограмма от 5' конца его 3' конца8.
Пример этого применения модифицированных 3' гонка является недавнее идентификация Роман CCND1-MRCK фьюжн гена Стенограмма от линии Мантия клеточная лимфома клетки и больных раком. 3' УТР состояла из последовательностей из как CCND1 , так и MRCK генов и был непокорным Мирна правила9. Два вложенных CCND1 конкретных вперед грунтовки дополняют региона непосредственно прилегающих и вниз по течению от CCND1 остановки кодон. Хотя весь транскриптом последовательности вместе с конкретными bioinformatic инструменты могут использоваться для обнаружения гена сплавливания в течение 3' УТР10, многие лаборатории могут не хватает финансовых ресурсов или bioinformatic опыт, чтобы сделать использование этой технологии. Следовательно 3' гонка является альтернативой для de novo идентификации и проверки Роман фьюжн генов, связанных с 3' УТР. Учитывая резкое увеличение числа зарегистрированных фьюжн генов, а также прочитать транскрипты, 3' гонка стала мощным инструментом в характеристике генных последовательностей11,12. Кроме того недавние исследования показали, что различные последовательности в течение 3' УТР, а также длина 3' УТР может повлиять на стенограмму стабильность мРНК, локализации, переводимости и функции13. Отчасти объясняется повышенный интерес в сопоставлении транскриптом, наблюдается увеличение числа различных ДНК-полимеразы, разрабатываются для использования в лаборатории. Важно определить, какие типы изменений можно внести 3' гонка протокола для того, чтобы использовать доступные репертуар полимераз.
Эта работа, доклады адаптации 3' гонки на карте всего 3' УТР, PAS и 3' конца расщепления сайт ANKHD1 транскрипт с помощью вложенных грунтовки в рамках секции ANKHD1 транскрипт и два разных полимераз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Носите пальто лаборатории, перчатки и защитные очки во все времена во время выполнения всех процедур в этом протоколе. Убедитесь, что контейнеры/пробирки, содержащие фенол и гуанидина реагент Изотиоцианаты открыт только в сертифицированных капот и утилизации отходов фенола в указанный контейнер. Используйте DNAse/РНКазы свободный стерильных трубок, советы и реагенты.
1. клеточная культура
- Растут линии клетки HeLa и два подвеска мантии Сотовый лимфома клеточных линий, Granta-519 и Jeko-1, в среде DMEM, содержащие 10% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C. Разбавьте 1:10 клеток и рассчитывать, с помощью счетчика частиц14.
- Для извлечения РНК тарелка 500000 клеток/хорошо в 6 хорошо пластины (2 мл СМИ за хорошо). После инкубации в течение 24 ч Соберите РНК из клеток.
2. РНК добыча
- Клетки для сбора урожая
Примечание: За исключением шаг центрифугирования, выполните все перечисленные в культуре ткани капюшоном для поддержания стерильности.- Для подвески клеток (Jeko-1 и Granta-519):
- Передать 15 мл, клетки (совместно с 2 мл СМИ) и центрифуги в 1725 x g 5 мин аспирата СМИ и оставьте ячейку Пелле в нижней части трубки.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл 1 x Buffered фосфатный (PBS). Добавьте 500 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола и гуанидина монофазные каждого образца в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Хорошо перемешать и оставить при комнатной температуре (RT) за 5 мин при этом инвертирование пробки microcentrifuge каждые 1 мин.
- Для адэрентных клеток (HeLa):
- Аспирационная СМИ культуры клеток от каждой скважины. Добавьте 1 mL PBS в каждой скважине смыть мусора.
- Удаление PBS и добавьте 500 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола и гуанидина монофазные каждой скважины.
- Инкубируйте на RT на 5 мин с плавное покачивание. Переезд в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Для подвески клеток (Jeko-1 и Granta-519):
- Лизис клеток
- Заморозить смесь клеток Изотиоцианаты фенола и гуанидина при-20 ° C для 1 h.
Примечание: Смеси можно оставить при-20 ° C на ночь или пока он не понадобится. - Оттепель фенола и гуанидина смесь Изотиоцианаты клеток на льду. Добавьте 100 мкл хлороформ microcentrifuge трубки в капюшоне ПЦР. Вихрь образца для 10-15 s до тех пор, пока смесь не розовый и непрозрачным. Проинкубируйте образцы на льду (при 4 ° C) для 15 мин.
- Центрифугуйте образцы для 15 мин при 20800 x g и 4 ° C. Осторожно удалите верхний бесцветный водной фазе (~ 200 мкл) и передачи в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Заморозить смесь клеток Изотиоцианаты фенола и гуанидина при-20 ° C для 1 h.
- РНК осадков
- Добавьте равное количество изопропиловый спирт для каждого образца. 1 мкл coprecipitant (см. Таблицу материалы) для каждого образца в качестве носителя для РНК и помогают визуализировать РНК в последующих шагах. Инкубируйте образца при температуре-80 ° C для по крайней мере 4 ч. Для достижения наилучших результатов Инкубируйте на ночь-80 ° c.
- Передать образец охлажденной центрифуге. Центрифуги для 35 мин при 20 800 x g / 4 ° C; РНК будет отображаться как голубое пятнышко на нижней части трубки. Осторожно удалите изопропиловый спирт из образца. Добавьте 500 мкл 80% этанола и Ресуспензируйте гранулы, кратко vortexing для 3 s.
- Центрифуга образца на 20 800 x g на RT на 5 мин удалить все этанола из образца. Пусть пример воздушно-сухой для около 10 мин Ресуспензируйте образца в 35 мкл РНКазы свободной воды. Место на блоке тепла (65 ° C) на 5 минут, чтобы обеспечить полностью РНК в растворе и сразу же поместить трубку на льду.
- Определите концентрацию общего РНК с помощью спектрофотометра, как описано ранее, за исключением использования 1.5 мкл пример РНК вместо 1 мкл15. При необходимости выполните 1 мкг всего РНК на геле агарозы 1% для определения целостности РНК.
3. DNase лечение
- После количественного определения РНК выполните DNAse лечение всего РНК ухудшить любые геномной ДНК. Для каждого образца добавьте следующие реагенты из комплекта свободных РНКазы DNAse сделать 20 мкл общая реакция Смешайте в отдельной microcentrifuge трубки:
- Смешайте 2 мкл DNase 10 X буфер реакции с 4,4 мкг всего РНК. Довести до в общей сложности 14 мкл с водой.
- 2 мкл DNAse РНКазы бесплатно. Инкубируйте при 37 ° C за 30 минут в присутствии 2 мкл АБС битор РНКазы (от обратного транскрипции Кит).
- Добавьте 2 мкл стоп решения и тепла на блоке тепла для 10 мин при 70 ° C для инактивации ферментов DNAse.
Примечание: DNAse лечение является обязательным.
4. синтез cDNA
Для окончательной реакции объем 50 мкл:
- Для окончательной реакции объем 50 мкл: 22 передачи мкл DNase лечение РНК к новой пробке или передачи 4 мкг всего РНК с добавлением воды до общего объема 22 мкл к новой пробке. 2 мкл T7 oligo dT25 грунт, от 10 мкм грунтовочный раствор. Последовательность для dT25 T7 oligo грунтовка 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
- От обратного транскрипции Кит добавить 2 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл), 8 мкл буфера реакции 5 x, 4 мкл дНТФ 10 мм и 2 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл).
Примечание: Настройка реакции без обратной транскриптазы в качестве отрицательного контроля. - Инкубируйте на 42 ° C в течение 1 ч. передачи прямо на льду. Тепловые трубки при 75 ° C за 5 мин и поместить трубку на льду.
5. грунтовка Поиск Транскрипт гена Fusion
-
Конструкция праймера
- Скачать последовательность кДНК из ансамбля генома браузер (ENST00000360839.6/NM_017747) и определить область в пределах ORF целевой Стенограмма (ANKHD1) вверх по течению стоп-кодон. Скопировать и вставить весь регион (до 700 нуклеотидов), содержащих последовательности вверх по течению стоп-кодон в регионе запись последовательности программного обеспечения дизайн праймера (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
- Выберите параметр пользовательский дизайн Показать и выберите 10 количество грунтовки система должна генерировать (результаты для возврата) и оставьте все остальные параметры присвоено значение по умолчанию.
- Выберите пять вперед грунты и два Обратный грунты, которые не перекрываются. Заказать грунты и воссоздания РНКазы/DNAse свободной водой до конечной концентрации 10 мкм. Подробнее об общих грунтовка дизайн для ПЦР покрыты других16.
-
ПЦР для выявления потенциальных Праймеры для использования в последующих 3' гонки
Примечание: Чтобы определить окончательный вперед Праймеры для использования в реакции, тест разработан праймеры, создав различные сочетания прямых и обратных праймеров для регулярного ПЦР в капюшоне ПЦР.- Передать свежие 0,5 мл ПЦР-пробирку cDNA (2 мкл). Добавьте 1 мкл вперед грунтовка и 1 мкл обратный праймера (от 10 мм грунтовочный раствор). Сделайте до 12,5 мкл, добавив 8.5 мкл воды, свободной от нуклеиназы. 12,5 мкл 2 x ПЦР гель Мастер микс.
- Используйте следующие тепловой Велоспорт условия PCR: 95 ° C в течение 2 мин, после чего 29 циклов 95 ° c за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 1 мин установлен окончательный цикл на 68 ° C за 7 мин.
- После ПЦР запустите продукцию на окрашенных бромидом ethidium гель агарозы 1%. Подробная информация о электрофореза как описано несколько модификаций17.
- Растворите 1 g агарозы в 100 мл буфера Tris-ацетат (ТЭ) в 250 мл флакон. Отварить в микроволновую печь.
- Оставить, чтобы охладить в течение 1 мин и 7,5 мкл раствора бромид ethidium (10 мг/мл бульона) в зонта. Смешайте хорошо закрученного колбу и вылить в горизонтальной гель аппарат. Оставьте на RT в вытяжной шкаф для по крайней мере 30 минут, чтобы позволить гель для закрепления.
- Покрытие гель с 1 x TAE буфера и загрузить 10 мкл продукта ПЦР на гель агарозы вместе с 3-5 мкл лестница ДНК молекулярной массой. На 175 V за 10 мин визуализировать и продуктов с использованием формирователь изображений и если необходима дальнейшая разделения продуктов, Побегите гель для еще 5-10 мин.
-
Выбор вложенных Праймеры для 3' гонки
- Анализировать результаты ПЦР геля агарозы для выбора грунты, которые имеют собственный, сильный, одной группы ПЦР. Используйте 5'-большинство грунт (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') вместе с T7 oligodT25 грунт в первый PCR запуска.
- Выберите вложенные грунт, который расположен ниже по течению от первого праймера (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') и использовать его с праймером T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') во втором наборе реакций PCR.
6. Оптимизация 3' гонки на карте 3' УТР, с использованием двух различных ферментов
Примечание: Наблюдается увеличение разнообразия ДНК полимеразы используемые для ПЦР; Таким образом мы хотели, чтобы определить стандартные условия, которые могут применяться даже при использовании разных ферментов для 3' гонка ПЦР-реакции. Обратный Праймеры для любого Стенограмма являются неизменным; Единственные изменения находятся в вложенные вперед грунты, которые являются специфическими для целевого транскрипт.
-
Протокол 1:3 ' гонка с использованием измененных ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus (ОРП)
- Первый PCR
- Передача 1 мкл cDNA в ПЦР-пробирку и 5 мкл 10 x Pfu реакции буфера. Добавьте 1 мкл первого вложенного вперед праймера, 1 мкл T7 грунтовка oligodT25 и 1 мкл дНТФ (из раствора 10 мм).
- Сделайте до 49 мкл общий объем, добавив 40 мкл воды. 1 мкл Pfu ДНК полимеразы и хорошо перемешать. Запустите PCR, используя профиль ПЦР в таблице 1.
- Второй ПЦР
- Передать новые ПЦР-пробирку 2 мкл продукции от первого ПЦР и смешать с 5 мкл 10 x PfuUltra II реакция буфера. Добавьте 1 мкл второй вложенных праймера PCR, 1 мкл T7 праймера и 1 мкл дНТФ (10 мм раствор).
- Сделайте до 49 мкл общая реакция тома путем добавления 39 мкл воды. 1 мкл Pfu ДНК полимеразы. Запустите PCR, используя один и тот же профиль PCR как первый PCR установки (Таблица 1).
- Первый PCR
-
Протокол 2:3 ' гонка с помощью химерных ДНК-полимеразы, состоящий из домена связывания ДНК сливается с Pyrococcus-как корректура полимеразы PCR Мастер микс
- Первый PCR
- Передача 1 мкл cDNA в ПЦР-пробирку. Добавьте 1 мкл первый грунтовочный слой вложенных вперед и 1 мкл T7 oligodT25 праймера. Сделайте до 25 мкл, добавив 22 мкл воды.
- 25 мкл 2 x ПЦР мастер смесь и хорошо перемешать. Использование ПЦР Велоспорт условия, описанные в таблице 2.
- Второй ПЦР
- Передать 2 мкл продукции от первого ПЦР новый ПЦР-пробирку. 1 мкл второй вложенных праймера PCR вместе с 1 мкл T7 обратный праймера.
- Сделайте до 25 мкл, добавив 22 мкл воды. 25 мкл 2 X ПЦР Мастер микс. Запустите PCR, используя один и тот же профиль PCR как первый PCR установки (Таблица 2).
- Первый PCR
7. Проверьте второй продукт PCR 3' гонки.
- Принимать 5-10 мкл второй продукт PCR (а также продукт от первого раунда ГКДЗ Если стенограмма обильно выражается) и запустите на геле агарозы. Настройка гель и запустить как описано электрофореза (шаги 5.2.3.1 для 5.2.3.3). Визуализируйте результаты на формирователь изображений.
8. продукт очистки и последовательности
- Очищение геля продукты PCR от второй ПЦР с использованием геля и ПЦР фрагментов ДНК Clean-Up системы согласно протоколу производителя.
- Выполнять Сэнгер последовательности (в качестве альтернативы, отправить гель очищенная образцы продуктов ПЦР и соответствующей последовательности грунтовки в лабораторию последовательности). Анализ последовательности данных после Сэнгер последовательности.
- Скачать программное обеспечение анализа последовательности (см. Таблицу материалы) и импортировать файлы трассировки в программное обеспечение. Использование отдельных чистая база QVs (значения качества) для получения базы вызова информации18. Скачайте хроматограммы с высоким качеством трассировки для просмотра.
Дополнительно: Гель очищенный продукт можно клонировать с помощью соответствующей клонирования kit и изолированные клоны, отправлены для Сэнгер последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поиск вложенных вперед грунтовка:
Гель агарозы от Рисунок 1 показывает два отдельных продуктов ПЦР гель (дорожки 1 и 2), которые используют то же вперед грунтовка, но разные обратный грунтовки. Майна 3 имеет собственный продукт PCR и имеет собственный прямого и обратного грунтовка. Идеальный Праймеры для реакции PCR на основе являются те, которые дают один собственный продукт PCR (3 полосы). Форвард грунтовка используется в дорожки 1 и 2 дает группе сильнейших и дает крупнейших продукты PCR (ожидается) и используется как первый грунтовочный слой вперед. Второй вложенных грунтовка для второй набор реакций PCR в 3' гонка является вперед грунт от переулок 3.
Различные ДНК полимеразы используемые в 3' гонка производить аналогичные результаты:
Два разных полимераз производится же размера продукты PCR, несмотря на наличие различных Велоспорт условия PCR для 3' гонка (рис. 2). Существует только один собственный группа для ожидаемого продукта PCR. Все негативный контроль обратной транскриптазы (-) минус не имеют группы, показаны загрязнения не геномной РНК в синтез cDNA, а также последующих течению реакций.
Сэнгер последовательности результатов:
Продукты PCR были гель очищенной и отправлены для Сэнгер последовательности. Результаты, показанные на рисунке 3а Показать часть последовательности хроматограф от Сэнгер последовательности. Представитель последовательность определяет расположение стоп-кодон, предполагаемый сплайсингу сигнал и на сайте расщепления, а также поли () хвост в продукте гонка 3' (рис. 3B).
Рисунок 1: идентификация праймеров два вложенных гена конкретных вперед для использования в 3' гонки. Показан пример продуктов ПЦР из различных комбинаций генов конкретных вперед и обратного грунтовки с помощью HeLa cDNA работать на бромид ethidium, окрашенных агарозном геле с молекулярной массой (МВт) лестницы. Дорожки 1 и 2 являются продукты PCR от же гена конкретных вперед грунтовка, но разные обратный грунтовки. Стрелки указывают на ожидаемое продукт PCR для каждой полосы. Помимо группы для ожидаемого продукта PCR существует дополнительная группа. Один продукт PCR в переулок 3 от различных генов конкретных вложенных вперед и обратного грунт и показывает ожидаемое однодиапазонный.
Рисунок 2: Проверка 3' гонка продуктов из второго набора реакций PCR. Изделия из второй реакции PCR с (A) Pfu ДНК полимеразы и (B) химерных ДНК полимеразы были запущены на геле агарозы бромидом ethidium. Полосы изображены (-), от отрицательного контроля образец для каждой ячейки строки, когда синтез cDNA от РНК была проведена в отсутствие фермента обратной транскриптазы. Дорожки 1 и 2 являются продукты PCR от биологических реплицирует каждой ячейки строки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: отображение продуктов PCR 3' гонки. (A) A часть последовательности Хроматограмма гель очищенной 3' гонка продукта показаны прогнозируемые сплайсингу сигнал и расположение poly(A) хвост. (B) представитель последовательностей от Сэнгер последовательности данных показаны стоп-кодон, сплайсингу сигнала (ССА), расщепление и вложения сайт poly(A) хвост, а также раздел последовательностей хвост поли (А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаг цикла | Температура и продолжительность | Количество циклов |
| Первоначальный денатурации | 95 ° C 3 мин | 1 |
| Первоначальный отжига и расширение | 50 ° C за 5 мин и 72 ° C для 10 мин | 1 |
| Subcyles (денатурация, отжига и расширение) | 95 ° C 40 s, 50 ° C за 1 мин и 72 ° C 3 мин | 20 |
| Последний цикл (денатурация, отжига и расширение) | 95 ° C 40 s, 50 ° C за 1 мин и 72 ° C 15 мин | 1 |
| Удерживайте | 4 ° C, ∞ |
Таблица 1: Pfu ДНК полимеразы PCR Велоспорт условия для 3' гонки.
| Шаг цикла | Температура и продолжительность | Количество циклов |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C 3 мин | 1 |
| Первоначальный отжига и расширение | 50 ° C за 5 мин и 72 ° C для 10 мин | 1 |
| Subcyles (денатурация, отжига и расширение) | 98 ° C за 30 s, 50 ° C за 1 мин и 72 ° C для 4 мин | 20 |
| Последний цикл (денатурация, отжига и расширение) | 98 ° C за 30 s, 50 ° C за 1 мин и 72 ° C 15 мин | 1 |
| Удерживайте | 4 ° C, ∞ |
Таблица 2: Химерных ДНК полимеразы PCR Велоспорт условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на появление массивной параллельной последовательности технологий, на основе гена в геном, 3' гонки по-прежнему остается наиболее простой и экономичный метод для идентификации PAS и нуклеотидов, прилегающих к poly(A) хвост. Адаптация, описанные здесь расширяется с помощью 3' гонки как усиливать, так и карта последовательности, которые включают часть ORF, стоп-кодон и всего 3' УТР Стенограмма мРНК ANKHD1 . Основным преимуществом 3' гонка является, что с несколько незначительных адаптации, можно клонировать изделия из 3' гонки в другие векторы для облегчения течению допроса 3' УТР функции, включая Мирна ориентации, анализов стабильности, а также другие механистический анализов. Это может быть сделано путем включения энзима ограничения сайтов внутри вложенных грунтовка последовательности9,10. Включить только 3' УТР без любой последовательности из ORF для клонирования для 3' УТР функциональных анализов5можно внести поправки.
Важным фактором, определяющим успех 3' гонка является развитие вложенных грунты, которые нацелены гена интереса. CDNA последовательности из Ensembl генома браузер рекомендуется лучше определить регионы без полиморфизмов для разработки оптимального грунтовки. В идеале несколько вложенных вперед грунтовки также, как по крайней мере два Обратный грунтовки в течение гена интереса может проверяться с помощью стандартных ПЦР для выявления лучших два вложенных гена конкретных Праймеры для использования. В этом исследовании первый ген конкретных вперед грунтовочный слой выбран для 3' гонки изначально дал две полосы с Стандартное PCR обычно используются в лаборатории. К сожалению конструкция праймера было ограничено значительное количество ОНП в стенограмме интерес. ОНП в целевой Стенограмма привести к несоответствие между праймеры и цель, которая может привести к неэффективной отжига и усиление и следует уменьшить до минимальной19. Наличие по крайней мере четыре ОНП в одном грунт, или возникновение сочетанием пяти несоответствия (три в одном грунт и два в другой) может привести к полном торможении реакции PCR, и поэтому единственный вариант заключается в разработке более грунтовки20. Вместо разработки более грунтовки, чтобы получить один из одной полосы для стандарта, что PCR используется для поиска грунт в экспериментах, сообщили здесь, Велоспорт условия PCR и ДНК-полимеразы, впоследствии используется в 3' гонки были изменены с целью оптимизации вероятность получение одной конкретной группы. Температура денатурации было увеличено до 98 ° C для одного из ДНК полимеразы (увеличение от 95 ° C используется в грунт Поиск). Для обеих полимераз используется в 3' гонка PCR, первоначальный денатурации продолжительность была увеличена до 3 мин вместо рекомендованных 30 s до 2 мин для того, чтобы полностью денатурировать cDNA шаблон. T7 oligo dT25 грунтовка например прогнозируется потенциально формы слабых вторичных структур, которые могут уменьшить доступность грунтовки21. Увеличение длины первоначальный денатурации и температуры ломает любые вторичные структуры и помогает принести конкретные однодиапазонный после окончательной цикла 3' гонки. Кроме того группа неспецифической была легче, чем ожидаемый полос, предполагая, что она появилась в выше циклов PCR (до 35 циклов); ограничение циклов PCR только 20 уменьшает усиление неспецифической группы.
Еще один потенциал 3' гонки, как и другие на основе ПЦР-реакции, является неполной усиление целевого региона22. Следовательно для обоих теплолюбивая ферментов начальной температуры отжига был установлен на 50 ° C за 5 мин для оптимизации отжиг праймеров к целевому и последовало первоначальное расширение температуре 72 ° C в течение 10 мин. Последний цикл PCR для каждого фермента имел время окончательное расширение 15 мин на 72 ° C. Эти расширения шаги были длиннее, чем рекомендованные производителями полимераз. Длинные расширение (удлинения) шаг позволяет полный синтез неполной ампликонами, позволяя полное расширение начальное и конечное усиление продукции16.
Шаги PCR, которые происходят в 3' гонка весьма чувствительны, поэтому они могут обнаружить геномной ДНК (или другие загрязнения ДНК) вместо целевой Стенограмма мРНК, что приводит к несколько неожиданных полос на гель22. Одним из способов предотвращения загрязнения является выполнять работу ПЦР в выделенный ПЦР капот, носить перчатки и использовать чистые реагентов и автоклавного стерильных трубок и Пипетка советы. В обычных PCR прямого и обратного грунты могут быть сконструированы так, что они расположены на различных экзонов (через Интрон грунты); Таким образом ненормально большой продукт PCR будет означать, что регион, содержащий Интрон были усилены. Однако это не всегда возможно в том случае, если только 3' УТР последовательности, расположен в пределах же терминал экзона, является мишенью для 3' гонки амплификации. Кроме того РНК может быть предварительно обработанные с DNAse фермента до синтеза cDNA. Использование T7 oligo dT25 грунтовка премьер реакция обратной транскриптазы вместо случайных hexanucleotide для первого синтеза cDNA стренги РНК также уменьшается амплификацию геномных продуктов. Последнее, но не менее важно, создание отрицательного контроля (» – «полосы на рис. 2), где синтез cDNA настроен в отсутствие обратной транскриптазы настоятельно рекомендуется. Элемент управления проходит одинаковые шаги для других образцов в гонке процедурах последующих 3'. Присутствие группы в этом элементе управления означает потенциальное загрязнение геномной ДНК.
Несмотря на вышеупомянутые проблемы 3' гонка является мощным инструментом в сопоставлении 3' заканчивается на основе отдельных генов. Появление технологии следующего поколения привело к увеличению в репертуаре стенограмм, которые имеют альтернативные 3' концы, вытекающие из альтернативных сплайсингу, который может или не может включать Альтернативный сплайсинг. Чтобы добавить сложности в раковых клетках, хромосомных перестроек частые и может привести к онкогенных генов фьюжн продуктов23. Сплавливание между двух генов может включать ORF или, в некоторых случаях, связаны с последовательностями только в течение 3' УТР9,10. Кроме того есть также соединился/co-transcribed генов, которые являются одновременно транскрипции, но может быть переведен на11различных белков. 3' гонки могут быть приспособлены к карте все эти уникальные, ненормально стенограмм, а также нормальной стенограммы. Это важно, потому что эти ненормальные стенограммы может в конечном итоге в качестве биомаркеров конкретные болезни или конкретных лекарственных препаратов, например, препарата иматиниб цели гена BCR-ABL1 фьюжн в рак.
Следовательно 3' гонки это универсальный метод, который может использоваться для усиливать нормальные стенограммы, выявления роман 3' необычных и Романа Джин сплавливания в течение 3' УТР5,9. В настоящем докладе 3' гонка была использована усилить и карта стоп-кодон, PAS и всего 3' УТР Стенограмма ANKHD1 , с использованием различных полимераз. Описанный подход может использоваться для сопоставления 3' концу любого polyadenylated транскрипт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы признать Bettine Gibbs за ее техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
- Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
