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Genetics

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57318
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

Summary

La dos diferentes 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3' UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Abstract

Maduración de los mRNAs eucarióticos consiste en 3' final de formación, que consiste en la adición de una cola de poly(A). Para asignar el extremo 3' de un gen, el método tradicional de elección es 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE). Protocolos para 3' raza requieren el cuidado diseño y selección de primers anidados dentro de la región 3' no traducida (3' UTR) del gen Diana de interés. Sin embargo, con algunas modificaciones, el protocolo puede utilizarse para incluir el entero 3' UTR y secuencias dentro del marco de lectura abierto (ORF), proporcionando una visión más comprensiva de la relación entre el ORF y el 3' UTR. Se trata además de identificación de la señal de poliadenilación (PAS), así como el escote y poliadenilación sitio provisto por convencional 3' RACE. Ampliado 3' RACE puede detectar inusual 3' UTRs, incluyendo fusiones de genes dentro de los 3' UTR, y la información de secuencia puede utilizarse para predecir potenciales sitios de unión de miRNA como AU rica desestabilizar elementos que puedan afectar la estabilidad de la transcripción.

Introduction

La formación del extremo 3' es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción1.

Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3' extremos3. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3' UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3' UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3'. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3' de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3' carrera sigue siendo el método de elección4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3' raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3' UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3' RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado4,6. 3' carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas4,7. Esto ha permitido 3' carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3' de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3' UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3' carrera que incluye grandes porciones de 3' UTR y regiones flanqueantes 5', es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5' a sus 3' extremo8.

Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3' RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3' UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento9. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3' UTR10, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3' RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3' UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3' RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3' UTR como la longitud de los 3' UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función13. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3' protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.

Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3' UTR 3', el PAS y el 3' final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.

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Protocol

Usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad en todo momento mientras se realizan todos los procedimientos en el presente Protocolo. Asegúrese de que envases y tubos que contienen el reactivo de fenol y guanidina isotiocianato sólo se abren en una capilla certificada y disponer de los residuos de fenol en un contenedor designado. Utilizar reactivos, puntas y tubos estériles libre de DNasa/Rnasa.

1. cultivo celular

  1. Crecer la línea celular HeLa y dos suspensión manto linfoma de la célula líneas celulares, Granta-519 y Jeko-1, en DMEM con 10% FBS y 100 U/mL penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C. Diluir las células 1:10 y contar con un contador de partículas14.
  2. Para la extracción de RNA, la placa de 500.000 células/pocillo de una placa bien 6 (media de 2 mL por pozo). Después de la incubación por 24 h, recoger RNA de las células.

2. extracción de RNA

  1. Recolección de células
    Nota: Con excepción de la etapa de centrifugación, realice todos los pasos enumerados en una campana de cultivo de tejidos para mantener la esterilidad.
    1. Para las células de suspensión (Jeko-1 y Granta-519):
      1. Transferencia de las células (junto con 2 mL de medio) a un tubo de 15 mL y centrifugue a 1.725 x g por 5 min aspirar los medios de comunicación y dejar el precipitado de células en la parte inferior del tubo.
      2. Resuspender el pellet celular en 50 μl de 1 x de tampón de fosfato salino (PBS). Añadir 500 μl del reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mezclar bien y dejar a temperatura ambiente (RT) por 5 min al invertir el tubo de microcentrífuga cada 1 minuto.
    2. Para células adherentes (HeLa):
      1. Aspire los medios de cultivo celular de cada pocillo. Añadir 1 mL de PBS a cada pocillo para limpiar escombros.
      2. Retirar el PBS y agregar 500 μl de reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada pocillo.
      3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con suave balanceo. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Lisis de la célula
    1. Congelación de la mezcla de células isotiocianato fenol y guanidina a-20 ° C durante 1 h.
      Nota: Puede dejar la mezcla a-20 ° C durante la noche o hasta que se necesite.
    2. Descongelar el fenol y guanidina isotiocianato celular la mezcla en hielo. Añada 100 μl de cloroformo en el tubo de microcentrífuga en una campana PCR. Vórtice de la muestra para s 10-15 hasta que la mezcla es color rosa y opaco. Incubar la muestra en hielo (a 4 ° C) durante 15 minutos.
    3. Centrifugue la muestra durante 15 min a 20.800 x g a 4 ° C. Cuidadosamente Remueva la fase acuosa incolora superior (~ 200 μL) y traslado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Precipitación de RNA
    1. Añadir un volumen igual de isopropanol a cada muestra. Añadir 1 μl de coprecipitant (véase Tabla de materiales) a cada uno para actuar como un portador para el RNA de la muestra y ayuda a visualizar el ARN en los pasos posteriores. Incubar la muestra a-80 ° C durante al menos 4 h. Para mejores resultados, incubar durante una noche a-80 ° C.
    2. Transferir la muestra a una centrífuga refrigerada. Centrifugar durante 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; el RNA aparece como una mota azul en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el isopropanol de la muestra. Añadir 500 μl de etanol al 80% y resuspender el precipitado con brevemente un vórtex durante 3 s.
    3. Centrifugar la muestra a 20.800 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos eliminar el etanol de la muestra. Dejar la muestra secar por unos 10 minutos volver a suspender la muestra en 35 μl de agua libre de ARNasa. Colocar en un bloque de calor (65 ° C) durante 5 minutos para que el ARN sea completamente en solución y coloque inmediatamente el tubo en hielo.
    4. Determinar la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro como se describió anteriormente, excepto usar 1,5 μl de la muestra de RNA en lugar de 1 μl15. Opcionalmente, ejecute 1 μg de ARN total en gel de agarosa al 1% para determinar la integridad del RNA.

3. DNasa tratamiento

  1. Después de la cuantificación del ARN, realizar tratamiento de DNasa en el ARN total para degradar cualquier DNA genomic. Para cada muestra, añadir los siguientes reactivos del kit libre de Rnasa DNasa al hacer una reacción total de 20 μl mezclar en un tubo de microcentrífuga separados:
    1. Mezcle 2 μl de DNasa 10 X buffer de reacción con 4,4 μg de ARN total. Llevar a un total de 14 μl con agua.
    2. Añadir 2 μl de DNasa Rnasa-libre. Incubar a 37 ° C por 30 min en presencia de 2 μl de inhibidor de la Rnasa (desde el Kit de transcripción inversa).
    3. Añadir 2 μl de solución de parada y calor en un bloque de calor 10 min a 70 ° C para inactivar la enzima DNasa.
      Nota: El tratamiento de DNasa es opcional.

4. síntesis de cDNA

Para un volumen final de reacción de 50 μl:

  1. Para un volumen final de reacción de 50 μl: transferencia 22 μL de la ADNsa tratados RNA a un tubo nuevo o transferencia 4 μg de ARN total con agua hasta un volumen total de 22 μL a un tubo nuevo. Añadir 2 μl del primer T7 oligo dT25 solución de imprimación de 10 μm. La secuencia de la cartilla de T7 oligo dT25 es 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. De la transcripción reversa kit añadir 2 μl de inhibidor de la Rnasa (20 U/μL), 8 μl del buffer de reacción de 5 x, 4 μL de 10 mM dNTPs y 2 μl de la transcriptasa reversa (200 U/μL).
    Nota: Configurar una reacción sin transcriptasa inversa para actuar como un control negativo.
  3. Incubar a 42 ° C por 1 h. transferencia directamente al hielo. Calentar el tubo a 75 ° C por 5 min y coloque el tubo en hielo.

5. primer búsqueda de transcripción del gen de fusión

  1. Primer diseño
    1. Descargar la secuencia de cDNA desde el navegador de genoma conjunto (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar una región dentro de la ORF de la transcripción blanco (ANKHD1) aguas arriba del codón de parada. Copiar y pegar toda la región (hasta 700 nucleótidos) que contienen secuencias aguas arriba del codón de parada en la región de entrada de secuencia de lo software de diseño de la cartilla (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Seleccione la opción Mostrar todos los particulares y 10 para el número de cartillas que el sistema debe generar (resultados a devolver) y salen todos los otros parámetros fijados por defecto.
    3. Elija cinco cartillas hacia adelantados y dos cartillas inversos que no se superponen. Iniciadores de la orden y reconstituir con agua libre de DNasa/Rnasa a una concentración final de 10 μm. Más detalles sobre el diseño de la cartilla general de PCR están cubiertos en otra parte16.
  2. PCR para identificar potenciales cebadores para su uso en posteriores 3' RACE
    Nota: Para determinar los iniciadores avance finales en la reacción, pruebe los cebadores diseñados por establecer diferentes combinaciones de cebadores de adelante y atrás para regular PCR en una campana PCR.
    1. Transferir el cDNA (2 μL) a un tubo PCR de 0.5ml dulce. Añadir 1 μl del primer delantero y 1 μl del primer inverso (de una solución de imprimación de 10 mM). Hacer hasta 12.5 μl agregando 8,5 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 12.5 μl de 2 x Gel de PCR Master Mix.
    2. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmicas PCR: 95 ° C por 2 min seguida de 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1 minuto Seleccione el final a 68 ° C por 7 min.
    3. Después de la polimerización en cadena, ejecute los productos en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio. Detalles de la electroforesis se describen previamente con unas cuantas modificaciones17.
      1. Disolver 1 g de agarosa en 100 mL de tampón Tris acetato (TAE) en un matraz de 250 mL. Hervir en el microondas.
      2. Dejar enfriar durante 1 minuto y agregar 7,5 μl de solución de bromuro de etidio (bolsa de 10 mg/mL) en una campana de humos. Mezclar bien agitando el frasco y vierta en un aparato de gel horizontal. Dejar a temperatura ambiente en la campana por lo menos 30 minutos permitir que el gel se solidifique.
      3. Cubrir el gel con 1 x TAE tampón y cargar 10 μl del producto PCR en el gel de agarosa con 3-5 μl de la escala del peso molecular de ADN. Corren 175 V para 10 minutos visualizar los productos usando a un sensor y si se necesita más separación de productos, ejecutar el gel para un 5-10 minutos adicionales.
  3. Selección de primers anidados para 3' RACE
    1. Analizar los resultados del gel de agarosa PCR para seleccionar los iniciadores que tienen una banda distinta, fuerte, sola de PCR. Utilice la cartilla más 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') junto con la cartilla de25 oligodT T7 en la primera PCR ejecutar.
    2. Seleccione la cartilla anidada que se encuentra aguas abajo de la primera cartilla (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') y con la cartilla de T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') en el segundo conjunto de las reacciones de PCR.

6. optimización de 3' de carrera a los 3' UTR mediante dos enzimas diferentes

Nota: Ha habido un aumento en la diversidad de las polimerasas de la DNA utilizada para PCR; por lo tanto, quisimos determinar condiciones estándar que pueden aplicarse incluso cuando se utiliza diferentes enzimas para 3' reacciones de PCR de raza. Los cebadores de reversos para cualquier transcripción se mantienen constantes; los únicos cambios son en los cebadores anidados adelantados que son específicos para la transcripción de destino.

  1. Protocolo 1:3 ' usando una ADN polimerasa modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu) de la raza
    1. Primera PCR
      1. 1 μl de cDNA de transferir a un tubo PCR y añadir 5 μl de tampón de reacción de Pfu de x 10. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada, 1 μl del primer T7 oligodT25 y 1 μl de dNTPs (de una solución 10 mM).
      2. Hacer hasta 49 μl total volumen añadiendo 40 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu y mezclar bien. Ejecute la polimerización en cadena usando el perfil de la polimerización en cadena en la tabla 1.
    2. Segunda PCR
      1. Transferir 2 μl de los productos de la PCR primer a un nuevo tubo PCR y mezclar con 5 μl de 10 x PfuUltra II reacción tampón. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada, 1 μl del primer T7 y 1 μl de dNTPs (solución 10 mM).
      2. Hacer hasta 49 μl reacción total volumen añadiendo 39 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu . Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 1).
  2. Protocolo 2:3 ' carrera usando una ADN polimerasa quimérica que consiste en un dominio de unión a ADN fusionado a un Pyrococcus-como corrección de la mezcla principal de la polimerización en cadena de polimerasa
    1. Primera PCR
      1. Transferencia de 1 μl de cDNA en un tubo PCR. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada y 1 μl de la cartilla de25 oligodT de T7. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua.
      2. Añadir 25 μl de 2 x PCR Master Mix y mezclar bien. Utilizar las condiciones PCR ciclo descritas en la tabla 2.
    2. Segunda PCR
      1. Transferencia de 2 μl de los productos de la PCR primera a un nuevo tubo PCR. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada junto con 1 μl del primer revés T7.
      2. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua. Añada 25 μl de 2 X PCR Master Mix. Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 2).

7. Verifique que el segundo producto PCR de 3' de carrera.

  1. Tomar 5-10 μl de la segunda producto de la polimerización en cadena (como producto de la primera ronda de PCR si la transcripción se expresa abundantemente) y correr en un gel de agarosa. Configurar el gel y correr la electroforesis como se describió anteriormente (pasos 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizar los resultados en un reproductor de imágenes.

8. secuenciación y purificación del producto

  1. Purificar los productos PCR del gel de la segunda polimerización en cadena usando el Gel y sistema de limpieza de ADN PCR fragmento según protocolo del fabricante.
  2. Realizar Sanger secuenciación (alternativamente, enviar el gel purificada muestras de productos PCR y secuenciación adecuados primers a un laboratorio de secuenciación). Analizar los datos de la secuencia después Sanger secuenciación.
  3. Descargar software de análisis de secuencia (véase Tabla de materiales) e importar los archivos de trazas en el software. Uso el QVs individuales de Base puro (valores de calidad) para obtener la Base llamada información18. Descargar el cromatograma con rastros de alta calidad para la visión.
    Opcional: El producto purificado de gel puede ser clonado utilizando un kit de clonación adecuado y los clones aislados para Sanger secuenciación.

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Representative Results

Búsqueda anidada Primer avance:

El gel de agarosa de La figura 1 muestra dos distintas gel productos de la PCR (carriles 1 y 2) que utilizan la misma adelante cartilla pero diferentes primers inversas. Carril 3 tiene un producto PCR distinto y distinto primer avance y retroceso. Los iniciadores ideal a utilizar para la reacción de PCR basado en son los que dan un producto PCR diferente (carril 3). El primer avance en los carriles 1 y 2 da la banda más fuerte da los productos PCR más grande (esperados) y se utiliza como la primera cartilla hacia adelante. La segunda cartilla anidada para el segundo conjunto de reacciones de PCR en 3' RACE es el primer avance de carril 3.

Polimerasas de la DNA diferente utilizan en 3' raza producen resultados similares:

Dos diferentes polimerasas de la DNA producen los mismos productos PCR tamaño a pesar de tener diferentes PCR ciclo las condiciones para la prueba (figura 2) 3'. Hay sólo una banda distinta para el producto PCR esperado. Todos de menos de la transcriptasa reversa controles negativos (-) no tiene una banda, que muestra sin contaminación genómica del ARN que se utiliza en la síntesis de cDNA, así como en posteriores reacciones posteriores.

Resultados de la secuenciación de Sanger:

Los productos PCR fueron gel purificado y enviado por Sanger secuenciación. Los resultados se muestra en la Figura 3A muestran una porción de un cromatógrafo de secuencia de Sanger secuenciación. Una secuencia representativa identifica la ubicación del codón de parada, putativo poliadenilación señal y el sitio de la hendidura, así como el poli (A) cola en el producto de raza de 3' (figura 3B).

Figure 1
Figura 1: identificación de los dos iniciadores avance específicos genes anidados en 3' RACE. Es un ejemplo de productos de PCR de diferentes combinaciones de genes específicos y cartillas inversas usando cDNA de HeLa ejecutan en un bromuro de etidio teñido el gel de agarosa con la escala de peso molecular (mw). Carriles 1 y 2 son productos de la polimerización en cadena desde el mismo primer avance específico gene pero diferentes primers inversas. Las flechas señalan el producto PCR esperado para cada carril. Además del producto de PCR esperado, hay una banda adicional. El único producto PCR en el carril 3 es de un primer gen distinto específico anidado hacia adelante y hacia atrás y la única banda que muestra.

Figure 2
Figura 2: verificación de productos de la raza del 3' de la segunda serie de reacciones de PCR. Productos de la segunda reacción de la polimerización en cadena con polimerasa (A) Pfu ADN polimerasa y ADN quimérico (B) se corrieron en un gel de agarosa con bromuro de etidio. Carriles descritos (-) son de la muestra de control negativo para cada línea celular síntesis de cDNA del ARN se llevó a cabo en ausencia de la enzima transcriptasa inversa. Carriles 1 y 2 son productos de la polimerización en cadena de réplicas biológicas de cada línea celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: asignación de los productos PCR de 3' raza. (A) A la porción de un cromatograma de la secuencia de un purificada 3' raza producto del gel que muestra la señal de poliadenilación predicha y la ubicación de la cola de poly(A). (B) representante de las secuencias de datos de secuenciación de Sanger que el codón de parada, la señal de poliadenilación (PAS), el sitio escote y accesorio de la cola de poly(A), así como una sección de las secuencias de la cola poly (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso de ciclo Temperatura y duración Número de ciclos de
Desnaturalización inicial 95 ° C durante 3 min. 1
Recocido y extensión 50 ° C por 5 min y 72 ° C por 10 min. 1
Subcyles (desnaturalización, recocido y extensión) 95 ° C por 40 s, 50 ° C por 1 min y 72 ° C durante 3 min. 20
Final ciclo (desnaturalización, recocido y extensión) 95 ° C por 40 s, 50 ° C por 1 min y 72 ° C durante 15 min. 1
Mantenga 4 ° C, ∞

Tabla 1: Pfu ADN polimerasa PCR ciclismo condiciones 3' RACE.

Paso de ciclo Temperatura y duración Número de ciclos de
Desnaturalización inicial 98 ° C durante 3 min. 1
Recocido y extensión 50 ° C por 5 min y 72 ° C por 10 min. 1
Subcyles (desnaturalización, recocido y extensión) 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 1 min y 72 ° C durante 4 min 20
Final ciclo (desnaturalización, recocido y extensión) 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 1 min y 72 ° C durante 15 min. 1
Mantenga 4 ° C, ∞

Tabla 2: ADN quimérico polimerasa PCR ciclo las condiciones.

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Discussion

A pesar del advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, sobre una base de gen por gen, 3' carrera sigue siendo el método más fácil y más económico para identificar la PAS y nucleótidos adyacentes a la cola de poly(A). La adaptación descrita aquí expande utilizando 3' carrera a amplificar tanto mapa secuencias que incluyen una porción del ORF, el codón de parada y el entero 3' UTR de la transcripción del mRNA de ANKHD1 . Una ventaja de 3' RACE es que con algunas adaptaciones menores, productos de 3' RACE pueden clonarse en otros vectores para facilitar el posterior interrogatorio de dirigidos a miRNA, ensayos de estabilidad así como otros análisis mecanicistas de las función de la UTR 3'. Esto puede hacerse incluyendo los sitios de la enzima de la restricción dentro de la cartilla anidados secuencias9,10. Pueden hacerse ajustes para incluir sólo el 3' UTR sin cualquier secuencia del ORF de clonación para 3' UTR ensayos funcionales5.

Un determinante del éxito de 3' de carrera es el desarrollo de cebadores anidados que el gen de interés. Las secuencias de cDNA desde el navegador de genoma de Ensembl se recomiendan para mejor identificar las regiones sin polimorfismos para desarrollar cartillas óptima. Idealmente, varios anidados adelante cartillas, así como al menos dos cartillas inversas dentro del gene de interés pueden proyectará utilizando PCR estándar para identificar el mejor dos iniciadores específicos de genes anidados a utilizar. En este estudio el primer gene adelante primer específico seleccionado inicialmente para 3' RACE dio dos bandas con PCR estándar utilizado rutinariamente en el laboratorio. Por desgracia, el primer diseño fue limitado por el gran número de SNPs en la transcripción de interés. SNPs en la transcripción de destino llevan a desajuste entre los iniciadores y el destino, que puede resultar en recocido ineficiente y amplificación y debe reducirse a un mínimo de19. La presencia de al menos cuatro SNPs en una cartilla, o la ocurrencia de una combinación de cinco uniones mal hechas (cartilla de tres en uno y dos en el otro) puede resultar en la completa inhibición de la reacción de PCR, y por lo tanto la única opción es el diseño más cartillas20. En lugar de diseñar primers más para obtener una sola banda para el estándar de que PCR utilizado para la búsqueda de la cartilla en experimentos divulgados aquí, las condiciones del ciclo de PCR y las polimerasas de ADN utilizadas posteriormente en 3' carrera fueron alteradas para optimizar la probabilidad de conseguir una banda específica. La temperatura de desnaturalización se incrementó a 98 ° C para una de las polimerasas de la DNA (un aumento de 95 ° C utilizado en la búsqueda de la cartilla). Para ambas polimerasas de la DNA usados en el 3' RACE PCR, la duración de desnaturalización inicial fue aumentado a 3 minutos en lugar de la recomendada 30 s a 2 min para desnaturalizar completamente la plantilla de cDNA. La cartilla de T7 oligo dT25 por ejemplo se prevé que potencialmente forma débiles estructuras secundarias, que pueden reducir la disponibilidad de cebadores21. Aumentando la longitud inicial de la desnaturalización y la temperatura rompe las estructuras secundarias y ayuda a producir la única banda específica después del ciclo final de 3' RACE. Además, la banda no específico era más ligera que las bandas esperadas, sugiriendo que apareció en mayor ciclos PCR (35 ciclos); limitar los ciclos de PCR con solamente 20 reduce la amplificación de la banda no específicos.

Otro potencial de 3' de carrera, como otras reacciones de PCR basado, es incompleta amplificación de la región de destino22. Por lo tanto, para ambas enzimas termófilas la temperatura de recocido inicial fue fijada en 50 ° C por 5 min optimizar el recocido de los iniciadores en el destino y esto fue seguido por una temperatura inicial de extensión a 72 ° C durante 10 minutos. El último ciclo PCR para cada enzima tuvieron un momento de extensión final de 15 minutos a 72 ° C. Estos pasos de extensión eran más largos que los recomendados por los fabricantes de las polimerasas de la DNA. El paso de extensión larga (alargamiento) permite síntesis completa de amplicones de incompleta, lo que permite la extensión completa de los productos de amplificación inicial y final16.

Pasos de la PCR que se producen en 3' RACE son muy sensibles, por lo que puede detectar el ADN genómico (u otra contaminación de ADN) en lugar de la transcripción de mRNA blanco, dando por resultado varias bandas inesperados el gel22. Una forma para prevenir la contaminación es realizar el trabajo PCR en una campana PCR dedicada, guantes y usar reactivos limpiamos y esterilizados tubos estériles y puntas de pipeta. En PCR normal, se pueden diseñar cartillas de avance y retroceso por lo que se encuentran en diferentes exones (a través de cartillas de intrón); de esta manera, un producto PCR anormalmente grande significaría que una región que contiene un intrón se ha ampliado. Sin embargo, esto puede no siempre ser factible en el caso de que sólo el 3' secuencia UTR, situado en el mismo exón terminal, es el blanco para la amplificación de raza de 3'. Como alternativa, el ARN puede ser previamente tratado con la enzima DNasa antes de síntesis de cDNA. El uso de la cartilla T7 oligo dT25 a la reacción de la transcriptasa reversa en lugar de una hexanucleotide al azar para la primera síntesis de strand cDNA del ARN también disminuye la amplificación de los productos genómicos. Por último pero no menos importante, establecer un control negativo (el "–" carriles en la figura 2), donde síntesis de cDNA se establece en ausencia de la transcriptasa reversa es muy recomendable. El control somete a medidas idénticas a las otras muestras en los procedimientos posteriores de 3' RACE. La presencia de una banda en este control significa potencial contaminación del ADN genómica.

A pesar de los retos antes mencionados, 3' RACE es una poderosa herramienta en la cartografía de extremos 3' de cada gen individual. El advenimiento de la tecnología de última generación ha conducido a un aumento en el repertorio de las transcripciones que tienen alternativa 3' extremos resultantes de poliadenilación alternativa, que puede o no puede implicar de splicing alternativo. Para agregar a la complejidad, en las células de cáncer, los cambios cromosómicos son frecuentes y pueden resultar en genes oncogénicos fusión productos23. La fusión entre los dos genes puede implicar el ORF o, en algunos casos, involucran únicamente secuencias dentro de los 3' UTR9,10. Además, son siameses/co-transcribed genes que se transcriben al mismo tiempo pero pueden ser traducidos a proteínas diferentes11. 3' carrera se puede adaptar a todos estas transcripciones únicas, anormales, así como transcripciones normales. Esto es importante porque estas transcripciones anormales pueden acabar sirviendo como biomarcadores específicos de enfermedad o medicamento específico metas, por ejemplo, el medicamento Imatinib apunta el gen de fusión BCR-ABL1 en cáncer.

Por lo tanto, 3' RACE es una técnica muy versátil que puede utilizarse para amplificar transcritos normales, identificación de novela 3' UTRs y fusiones gene nuevo dentro de los 3' UTR5,9. En este informe, 3' raza fue utilizada para amplificar y mapa del codón de parada, el PAS y el entero 3' UTR de la transcripción de ANKHD1 utilizando diferentes polimerasas de la DNA. El enfoque descrito se puede utilizar para asignar el extremo 3' de cualquier transcripción de cofia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer a Bettine Gibbs por su ayuda técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

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Genética número 133 transcripciones extremo 3' 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) reacción en cadena de polimerasa señal de poliadenilación (PAS) poliadenilación
Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer
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Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' … More

Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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