Summary
İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.
Abstract
Ökaryotik mRNA'ların olgunlaşma Poli(a) kuyruğu ilavesi içerir 3' son oluşumu içerir. Bir gen 3' sonu eşlemek için geleneksel seçim 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) yöntemidir. İletişim kuralları için 3' yarış dikkatli tasarım ve ilgi hedef gen 3' Çevrilmeyen bölgesi (3' UTR) içinde iç içe geçmiş astar yelpazesi gerektirir. Ancak, bir kaç değişiklik ile protokol tüm 3' UTR ve dizileri ORF ve 3' UTR ilişkisi, daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan açık okuma çerçevesi (ORF), içinde eklemek için kullanılabilir. Bu Poliadenilasyon sinyal (PAS), yanı sıra yanı sıra geleneksel 3' tarafından yarış sağlanan dilinim ve Poliadenilasyon site kimliğidir. Genişletilmiş 3' yarış alışılmadık 3' UTRs içinde 3' UTR, gen füzyon dahil olmak üzere, algılayabilir ve sırası bilgi AU transkript kararlılığını etkileyebilir öğeleri istikrarsızlaştırıcı zengin yanı sıra potansiyel miRNA bağlayıcı siteleri tahmin etmek için kullanılabilir.
Introduction
3' ucu oluşumu pre-mRNA aşağı Poli(a) kuyruğu1,2olun ~ 250 untemplated adenines ilavesi ve ardından bir pas bölünme oluşur mRNA olgunlaşma önemli bir adım var. Poli(a) kuyruğu Poli(a) bağlayıcı protein (PABP) bağlanır ve bu mRNA transkript bozulma korur ve çeviri1kolaylaştırır.
Mevcut tahminlere insan genlerinin % 70'i birden çok giriş ve böylece alternatif Poliadenilasyon, birden fazla 3' biter3' te sonuçlanan geçmesi öneririz. Böylece, nerede Poli(a) kuyruğu kalan 3' UTR verdiği tanımlamak gibi PAS tarafından verilen herhangi bir transkript kullanılan belirlemek önemlidir. Yeni nesil sıralama gelişiyle 3' eşzamanlı kimliği içinde UTRs ve genler binlerce PASs sonuçlandı. Bu artış sıralama özelliği, 3' uç alternatif Poliadenilasyon içeren verileri çözümlemek için bioinformatic algoritma geliştirme gerektirmiştir. De novo algılama veya PAS doğrulanmasını ve dolayısıyla 3' ucu bireysel genlerin büyük ölçekli sıralama veri eşleme için 3' yarış yönteminin seçimi4,5kalır. Normalde, 3' yarış cDNA ürünleriyle birlikte sıraları yalnızca bir bölümünü 3' Poli(a) kuyruğu, bölünme sitesi, PAS ve akıntıya karşı dizisi PAS içerir UTR'nin içerir. Tasarım ve gen belirli ileriye ve geriye doğru astar kullanımını gerektiren PCR 3' yarış sadece iki gen belirli iç içe ileri astar gerektirir. Dolayısıyla, PCR nükleotid dizisi güçlendirilmiş4,6olmak gen büyük bir bölgeye ilişkin daha ayrıntılı bir bilgi gerektirir. 3' yarış başlandığından beri aynı Poli(a) kuyruğu poliadenile RNA transkriptlerinizin için hedefleri, yalnızca ileri astar gen belirli, böylece, yalnızca mRNA önemli ölçüde daha küçük bir bölge bilgisi gerektiren gerekir astar ters. Bu kimin dizileri değil tam olarak karakterize4,7olan bölgelerdeki amplifikasyon sağlar. Bu 3' yarış sadece bir gen 3' sonu belirlemek için aynı zamanda belirlemek ve büyük bölgelerinde akıntıya karşı önemli bir kısmını 3' UTR formu PAS karakterize için kullanılmak üzere izin verdi. 5' ile değiştirilmiş 3' büyük bazı bölümleri 3' UTR ve kanat bölgeleri içeren yarış yarış birleştirerek, tamamen sıra ya da onun 3' son85' uç üzerinden tüm bir mRNA transkript klon mümkündür.
Son kimliği roman CCND1-MRCK füzyon gen transkript Mantle hücreli Lenfoma hücre satırlarından ve kanser hastaları bu uygulanması değiştirilmiş 3' yarış bir örnektir. 3' UTR üzerinden CCND1 ile MRCK gen dizilerinin oluşuyordu ve miRNA Yönetmeliği9' a inatçı. İki iç içe geçmiş CCND1 belirli ileri astar hemen bitişik ve CCND1 kodonu aşağı bölgeye tamamlayıcı. Her ne kadar bütün transcriptome sıralama belirli bioinformatic araçları ile birlikte gene füzyon103' UTR içinde algılamak için kullanılan, birçok labs mali kaynak veya yapmak için bioinformatic uzmanlık eksikliği bu teknoloji kullanın. Bu nedenle, 3' yarış de novo tanıma ve onaylama 3' UTR içeren roman füzyon genlerin yerine kullanılabilir. Köklü bildirilen füzyon genlerin sayısını artırmak gibi transkript okuma göz önüne alındığında, 3' yarış gen dizileri11,12karakterize güçlü bir araç haline gelmiştir. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu farklı diziler içinde 3' UTR yanı sıra uzunluğu 3' UTR mRNA transkript istikrar, yerelleştirme, translatability ve işlev13etkileyebilir göstermiştir. Kısmen artan ilgi nedeniyle transcriptome eşleme, orada laboratuar olarak kullanılmak üzere geliştirilen farklı DNA polimerazlar sayısındaki bir artış olmuştur. Ne tür değişiklikler 3' için DNA polimerazlar kullanılabilir repertuar yararlanmak için sipariş yarış protokolünde yapılabilir belirlemek önemlidir.
Bu eser 3' tüm 3' UTR eşlemek için yarış uyum raporları, PAS ve 3' sonu bölünme bir site kullanarak ANKHD1 transkript astar transkript ve iki farklı DNA polimerazlar ANKHD1 bölümünde iç içe geçmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük bu protokol için tüm yordamları gerçekleştirirken her zaman giymek. Konteyner/tüpler fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif içeren yalnızca bir Sertifikalı hood ve dispose fenol atık belirlenmiş bir kap içinde açılan emin olun. Dnaz/RNAse-Alerjik steril tüpler, ipuçları ve Kimyasalları kullanın.
1. hücre kültürü
- HeLa hücre satır ve iki süspansiyon manto hücre Lenfoma hücre hatları, Granta-519 ve Jeko-1, % 10 içeren DMEM büyümek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir kuluçka Hücreleri 1:10 sulandırmak ve parçacık sayaç14kullanarak say.
- RNA çıkarma için 500.000 hücreler/iyi 6 iyi plaka (2 mL medya iyi başına) plaka. 24 h için kuluçka sonra RNA hücrelerden toplamak.
2. RNA çıkarma
- Hücre hasat
Not: Santrifüjü adım dışında bir doku kültürü hood kısırlık korumak için listelenen adımları gerçekleştirin.- Süspansiyon hücreleri (Jeko-1 ve Granta-519):
- Hücreleri (birlikte medya 2 mL) 15 mL tüp için transfer ve 5 dk. aspiratı medya 1,725 x g, santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tüpün dibinde bırakın.
- Hücre Pelet 1 fosfat Buffered Saline (PBS) x 50 µL resuspend. Monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp her örnek ekleyin. Mix iyi ve her 1 dk. terk microcentrifuge tüp ters çevirme sırasında oda sıcaklığında (RT) 5 min için.
- (HeLa) yapışık hücreleri için:
- Her şey hücre kültür ortamından Aspire edin. Enkaz yıkamak için her şey için PBS 1 mL ekleyin.
- PBS kaldırın ve her şey için monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL ekleyin.
- RT hafif sallanan ile 5 min için kuluçkaya. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
- Süspansiyon hücreleri (Jeko-1 ve Granta-519):
- Hücre lizis
- Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı 1 h için-20 ° C'de dondurmak.
Not: Mix-20 ° c gece veya ihtiyaç kadar bırakılabilir. - Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı buz çözme. Kloroform 100 µL PCR başlıklı microcentrifuge tüp ekleyin. Girdap karışımı pembe ve opak kadar 10-15 s için örnek. Örnek 15 dakika (4 ° C'de) buz üzerinde kuluçkaya.
- Örnek 20,800 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatli bir şekilde çıkarın üst renksiz sulu faz (~ 200 µL) ve yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak.
- Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı 1 h için-20 ° C'de dondurmak.
- RNA Yağış
- İsopropanol eşit bir hacmi her örnek için ekleyin. Coprecipitant 1 µL ekleyin (her bir taşıyıcı RNA olarak davranmaya örnek ve sonraki adımda RNA görselleştirmek yardımcı Malzemeler tablobkz:). Örnek-80 ° c en az 4 h için kuluçkaya. En iyi sonuçlar için gecede-80 ° C'de kuluçkaya
- Örnek için soğutmalı santrifüj aktarın. 20,800 x g, 35 dk santrifüj / 4 ° C; RNA tüp altındaki mavi bir nokta görünür. Dikkatli bir şekilde alınan örneğin isopropanol çıkarın. 500 µL % 80 etanol ekleyin ve kısa bir süre için 3 vortexing tarafından Pelet resuspend s.
- 5 dakika süreyle santrifüj örneği de RT 20,800 x g ' örnek tüm etanol kaldırın. Let örnek kuruması için RNAse free su 35 µL içinde örnek yaklaşık 10 dk. Resuspend. RNA tam çözümde olduğundan emin olmak 5 min için bir ısı blok (65 ° C) yerleştirin ve hemen tüp Buza koyun.
- Toplam RNA daha önce açıklanan, RNA Örnek 1,5 µL yerine 1 µL15kullanmak dışında bir Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirlemek. İsteğe bağlı olarak, toplam RNA'ın 1 µg RNA bütünlük belirlemek için % 1'özel jel üzerinde çalıştırın.
3. Dnaz tedavi
- Sonra miktar RNA'ın Dnaz tedavi genomik DNA aşağılamak için toplam RNA üzerinde gerçekleştirin. Her örnek için bir ayrı microcentrifuge tüp içinde karıştırın bir 20 µL Toplam tepki yapmak RNAse free Dnaz Takımı'ndan aşağıdaki reaktifler ekleyin:
- Mix 2 µL Dnaz 10, reaksiyon arabellek X 4,4 µg toplam RNA ile. Su ile 14 µL toplam getirmek.
- Dnaz RNase free 2 µL ekleyin. RNase inhibitörü (ters transkripsiyon takımı)'ndan 30 dakika 2 µL huzurunda 37 ° C'de kuluçkaya.
- Dnaz enzim devre dışı bırakabilirsiniz için 70 ° c 10 min için bir ısı blokta 2 µL çözüm durdurmak ve ısı ekleyin.
Not: Dnaz tedavi seçime bağlıdır.
4. cDNA sentezi
50 µL son tepki hacmi için:
- 50 µL son tepki hacmi için: Transfer 22 µL Dnaz, yeni tüp veya transfer 4 µg yeni bir tüp için 22 µL toplam hacmiyle ekledi su ile toplam RNA'ın RNA tedavi. T7 oligo dT25 astar 2 µL 10 µM astar çözümden ekleyin. 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 sırasıdır T7 oligo dT25 astar için '.
- Ters transkripsiyon teçhizat--dan 2 µL RNase inhibitörü (20 U/µL), 5 x reaksiyon arabelleğinin 8 µL, 10 mM dNTPs 4 µL ve transkriptaz (200 U/µL) 2 µL ekleyin.
Not: bir tepki ters transkriptaz olmadan bir negatif kontrol hareket için ayarlayın. - 42 ° c için 1 h. Transfer doğrudan buz kuluçkaya. Tüp 5 min için 75 ° C'de ısı ve tüp Buza koyun.
5. Astar arama Fusion Gene transkript için
-
Astar tasarım
- CDNA sıra Ensemble genom tarayıcı (ENST00000360839.6/NM_017747) indirmek ve hedef transkript (ANKHD1) akıntıya karşı kodonu ORF içinde bir bölge tanımlar. Kopyalama ve yapıştırma dizisi akıntıya karşı kodonu içine astar tasarım yazılımı sıra giriş bölgesi içeren tüm bölgenin (700 nukleotid) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
- Göster özel tasarım seçeneğini seçip 10 astar sayısı için sistem (sonuçlar dönmek için) üretmek ve tüm diğer parametreleri ayarla varsayılan olarak bırakın.
- Beş ileri astar ve örtüşmeyen iki ters astar seçin. Astar sipariş ve RNAse/Dnaz-ücretsiz su 10 µM son bir konsantrasyon ile yeniden oluşturma. PCR için genel astar tasarım hakkında daha fazla bilgi başka bir yerde kaplıdır16.
-
PCR kullanılmak üzere sonraki 3' yarış potansiyel astar tanımlamak için
Not: tepki olarak kullanmak için son ileri astar, tasarlanmış astar PCR başlıklı düzenli PCR ileriye ve geriye doğru astar farklı birleşimlerini ayarlayarak sınayın.- CDNA (2 µL) taze 0.5 mL PCR tüp aktarın. 1 µL ileri astar ve 1 µL ters astar (bir çözümden 10 mM astar) ekleyin. İlâ 12.5 µL 8,5 µL nükleaz ücretsiz su ekleyerek getirin. 12.5 µL PCR jel Master Mix x 2 ekleyin.
- Aşağıdaki PCR termal bisiklet koşullarını kullanın: 95 ° C için 2 dk ardından 29 devredir 30 95 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 1 dk. için 7 dk. 68 ° C'de son döngüsü ayarlamak.
- PCR sonra ürünler arasında etidyum bromür ile lekeli bir % 1'özel jel çalıştırın. Elektroforez ayrıntılarını daha önce bir kaç değişiklik17ile açıklanmıştır.
- Özel Tris-asetat (TAE) arabellekte bir 250 mL şişe 100 ml 1 g geçiyoruz. Bir mikrodalga fırında kaynatın.
- 1 dakika serin ve etidyum bromür çözüm (10 mg/mL stok) 7.5 µL duman mahallede eklemek için izin. De şişeye dönen tarafından mix ve bir yatay jel aparatı dökün. RT duman mahalle kuvvetlendirmek jel izin vermek en az 30 dk için bırakın.
- Jel 1 x TAE arabellek ile kapak ve 10 µL PCR ürünü özel jel ile birlikte 3-5 µL DNA molekül ağırlığı merdivenin üzerine yükleyin. 10 dk. görselleştirmek için bir görüntüleyici kullanarak ürün 175 V çalıştırıyorsa ve daha fazla ürün ayrılması gerekiyorsa, ek bir 5-10 dk için jel.
-
İç içe geçmiş astar için 3' ırk seçimi
- Farklı, güçlü ve tek PCR müzik grubunuz mu var astar seçmek için PCR özel jel sonuçlarını çözümlemek. 5'-en astar kullanmak (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') ile birlikte çalıştırmak ilk PCR T7 oligodT25 astar.
- Nehrin aşağısında bulunduğu ilk astar iç içe geçmiş astar seçin (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') ve T7 astar ile kullanabilirsiniz (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR reaksiyonları ikinci kümedeki.
6. 3' yarış 3' UTR iki farklı enzimler kullanarak eşleştirmek için en iyi duruma getirme
Not: PCR için kullanılan DNA polimerazlar çeşitliliği bir artış olmuştur; Bu nedenle, farklı enzimler 3' için yarış PCR reaksiyonları kullanırken bile uygulanan standart koşullar belirlemek istedim. Herhangi bir transkript için ters astar sabit tutulur; Tek değişiklikler için hedef transkript özgü iç içe ileri astar bulunmaktadır.
-
1:3 protokol ' den Pyrococcus furiosus (Pfu) değiştirilmiş DNA polimeraz kullanarak yarış
- İlk PCR
- CDNA 1 µL PCR tüp aktarmak ve 10 x Pfu tepki arabelleği 5 µL ekleyin. İlk iç içe ileri astar 1 µL, 1 µL T7 oligodT25 astar ve dNTPs 1 µL (10 mM eriyik--dan) ekleyin.
- 49 µL Toplam hacim 40 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 1' de PCR profili kullanarak PCR çalıştırın.
- İkinci PCR
- 2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarmak ve 10 x PfuUltra II tepki arabellek 5 µL ile karıştırın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL, 1 µL T7 astar ve dNTPs (10 mM çözüm) 1 µL ekleyin.
- 49 µL toplam reaksiyon cilt 39 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 1) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.
- İlk PCR
-
2:3 protokol ' için Pyrococcuserimiş bir DNA bağlayıcı etki oluşan chimeric DNA polimeraz kullanarak yarış-polimeraz PCR ana mix yazım denetleme gibi
- İlk PCR
- CDNA 1 µL PCR tüp aktarın. 1 µL ilk iç içe ileri astar ve T7 oligodT25 astar 1 µL ekleyin. En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin.
- 25 µL PCR Master Mix x 2 ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 2' de açıklanan PCR bisiklet koşullarını kullanın.
- İkinci PCR
- 2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL T7 ters astar ile birlikte 1 µL ekleyin.
- En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin. 25 µL PCR Master Mix X 2 ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 2) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.
- İlk PCR
7. ikinci PCR ürünü olan 3' yarış doğrulayın.
- Almak 5-10 µL ikinci PCR ürünü (yanı sıra ürün Eğer transkript bol ifade PCR ilk turda) ve bir özel jel kaçıyor. Jel ayarla ve daha önce açıklandığı gibi Elektroforez (Adım 5.2.3.1-5.2.3.3) çalıştırın. Bir Imager sonuçlarına görselleştirin.
8. ürün arıtma ve sıralama
- Jel ve PCR parçası DNA temizleme sistemi başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanarak ikinci PCR jel PCR Urun arındırmak.
- Sanger gerçekleştirmek sıralama (alternatif olarak, jel saf PCR ürün örnekleri ve uygun sıralama astar bir sıralama laboratuara gönder). Sanger sonra sıralama verileri analiz sıralama.
- Sıra analiz yazılımı indirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve izleme dosyaları yazılım alın. Kullanım bireysel saf Bankası QVs (Kalite Bankası elde etmek için değerler) bilgi18ara. Kromatografik ile yüksek kaliteli izlemeler görüntülemek için indirin.
İsteğe bağlı: Jel arıtılmış ürün uygun bir klonlama kiti ve Sanger için gönderilen izole klonlar kullanma klonlanmış sıralama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İç içe geçmiş ileri astar arama:
Özel jel Şekil 1 , hangi kullanım aynı ama farklı ters astar astar ileri iki ayrı PCR jel ürün (şerit 1 ve 2) gösterir. Lane 3 ayrı bir PCR ürünü ve farklı ileriye ve geriye doğru astar vardır. Dayalı PCR reaksiyon için kullanmak için ideal astar bir ayrı PCR ürün (Lane 3) vermek bunlar. Şerit 1 ve 2 kullanılan ileri astar en güçlü grup verir ve (beklenen) en büyük PCR ürünleri verir ve ilk ileri astar kullanılır. PCR reaksiyonları içinde 3' yarışı ikinci kümesi için ikinci iç içe geçmiş astar Lane 3 ileri ilk okuma kitabıdır.
Farklı DNA polimerazlar 3' yarış benzer sonuçlar üretmek kullanılan:
İki farklı DNA polimerazlar farklı PCR bisiklet koşullarını için 3' yarış (Şekil 2) olmasına rağmen aynı büyüklükte PCR ürünleri üretti. Beklenen PCR ürünü için tek bir ayrı grup vardır. Tüm eksi transkriptaz negatif denetimleri (-) hiçbir genomik kirlenme cDNA sentezi de olduğu gibi sonraki akış yönündeki tepkiler kullanılan RNA'ın gösterilen bir grup yok.
Sanger sıralama sonuçlar:
PCR ürünleri saflaştırılmış ve Sanger için gönderilen jel edildi sıralama. Sonuçlar şekil 3A içinde bir sıra Kromatograf Sanger göstermek sıralama. Temsil edici bir sıra kodonu, sözde Poliadenilasyon sinyal ve bölünme sitesi yanı sıra Poli (A) kuyruğu (şekil 3B) 3' yarış ürün konumunu tanımlar.
Şekil 1: 3' yarış kullanmak için iki iç içe geçmiş gen belirli ileri astar tanımlaması. Gösterilen farklı gen kombinasyonları PCR ürünlerinin bir örnek ileri özeldir ve özel jel molekül ağırlığı (mw) merdiven ile lekeli bir etidyum bromür ters astar HeLa cDNA kullanarak çalıştırın. Şerit 1 ve 2 aynı gen belirli ileri astar ama farklı ters astar PCR ürünlerdir. Okları her lane için beklenen PCR ürünü üzerine gelin. Beklenen PCR ürünü için grubun yanı sıra, ek bir bant vardır. Lane 3 tek PCR ürünü bir farklı gen belirli iç içe geçmiş ileriye ve geriye doğru astar ve tek beklenen bant gösterir.
Şekil 2: 3' yarış Urun PCR reaksiyonları ikinci kümesi doğrulanması. (A) Pfu DNA polimeraz ve (B) Chimeric DNA polimeraz ile ikinci PCR reaksiyon ürünleri arasında etidyum bromür ile bir özel jel işletilmiştir. Tasvir (-) tarafından yolları vardır her hücre satırı için negatif kontrol örnekten cDNA sentez RNA üzerinden transkriptaz enzimi yokluğunda gerçekleştirilmiştir. Şerit 1 ve 2 her hücre satırın biyolojik çoğaltır PCR ürünleri vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: eşleme PCR ürünlerinin 3' yarışı. (A) A bölümü bir sıra Kromatografik öngörülen Poliadenilasyon sinyal ve Poli(a) kuyruğu konumunu gösteren bir ürünün saf jel 3' yarışı. (B) temsilcisi gösterilen kodonu, Poliadenilasyon sinyal (PAS), Poli(a) kuyruğu bölünme ve eki sitenin yanı sıra bir bölümü Poli (A) kuyruğu sıralarının Sanger sıralama veri dizileri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Döngüsü adım | Sıcaklığı ve süresi | Döngü sayısı |
| İlk denatürasyon | 3 dk. için 95 ° C | 1 |
| İlk tavlama ve uzantısı | 50 ° C 5 min için ve 10 dk 72 ° C | 1 |
| Subcyles (denatürasyon, tavlama ve uzantısı) | 40 95 ° C s, 50 ° C için 1 dakika ve 3 dk 72 ° C | 20 |
| Son döngüsü (denatürasyon, tavlama ve uzantısı) | 40 95 ° C s, 50 ° C için 1 dakika ve 15 dakika 72 ° C | 1 |
| Basılı tutun | 4 ° C, ∞ |
Tablo 1: Pfu DNA polimeraz PCR bisiklet koşullarını için 3' yarışı.
| Döngüsü adım | Sıcaklığı ve süresi | Döngü sayısı |
| İlk denatürasyon | 3 dk 98 ° C | 1 |
| İlk tavlama ve uzantısı | 50 ° C 5 min için ve 10 dk 72 ° C | 1 |
| Subcyles (denatürasyon, tavlama ve uzantısı) | 98 ° C 30 s, 50 ° C için 1 dakika ve 4 dakika 72 ° C | 20 |
| Son döngüsü (denatürasyon, tavlama ve uzantısı) | 98 ° C 30 s, 50 ° C için 1 dakika ve 15 dakika 72 ° C | 1 |
| Basılı tutun | 4 ° C, ∞ |
Tablo 2: Chimeric DNA polimeraz PCR bisiklet koşullarını.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir gen gen olarak büyük paralel sıralama teknolojileri gelişiyle rağmen 3' yarış PAS ve nükleotid Poli(a) kuyruğu bitişik tanımlamak için en kolay ve en ekonomik yöntem kalıyor. Burada açıklanan adaptasyon kullanarak 3' yarış hem yükseltmek ve ORF, kodonu ve tüm 3' UTR ANKHD1 mRNA transkript, bir bölümünü içeren dizileri eşlemek için genişler. 3' yarış bir büyük avantajı birkaç küçük uyarlamalar ile diğer vektörel çizimler aşağı akım sorgulama işlevinin miRNA hedefleme, istikrar deneyleri gibi diğer mekanik deneyleri de dahil olmak üzere 3' UTR kolaylaştırmak için Urun 3' yarış klonlanmış olmasıdır. Bu-ebilmek kılınmak içinde iç içe geçmiş astar dizileri9,10restriksiyon enzimi siteleri dahil olmak üzere. Sadece 3' UTR 3' UTR işlevsel testleri5için klonlama için ORF üzerinden herhangi bir dizileri olmadan dahil etmek için ayarlamalar yapılabilir.
3' yarış başarısı önemli bir belirleyici gen ilgi hedef iç içe astar gelişmedir. CDNA dizileri Ensembl genom tarayıcı en iyi en iyi astar geliştirmek için polimorfizmleri olmadan bölgeleri tanımlamak için tavsiye edilir. İdeal olarak, çeşitli iç içe astar gen ilgi içinde en az iki ters astar kullanmak için en iyi iki iç içe geçmiş gen belirli astar tanımlamak için standart PCR kullanarak ekranlı yanı sıra ileri. Bu çalışmada 3' için yarış başlangıçta seçili ilk gen belirli ileri astar laboratuarda rutin olarak kullanılan standart PCR ile iki grup verdi. Ne yazık ki, astar tasarım faiz transkript SNPs önemli sayısı sınırlı. Hedef transkript SNPs astar ve verimsiz tavlama ve amplifikasyon neden olabilir ve en az19azaltılması gereken hedef, arasında uyumsuzluk için neden. Bir astar olarak en az dört SNPs varlığı veya beş uyuşmazlıkları (üç tek astar ve iki diğer) bir kombinasyonu oluşumunu PCR reaksiyon tam inhibisyonu neden olabilir ve bu nedenle tek seçenek daha fazla astar20tasarlamaktır. PCR astar arama rapor burada deneyler yapmak için kullanılan standart bir tek bant almak için daha fazla astar tasarımı yerine, PCR bisiklet koşullarını ve daha sonra 3' yarış kullanılan DNA polimerazlar olasılığını en iyi duruma getirmek için değiştirilmiş bir özel grup alma. Denatürasyon sıcaklık 98 ° c (95 ° c artış astar aramada kullanılan) DNA polimerazlar biri için yükseltilmiştir. 3' kullanılan her iki DNA polimerazlar için yarış PCR, ilk denatürasyon süresi artış oldu 3 dk önerilen 30 yerine s tam denatüre cDNA şablonu için 2 dakika. T7 oligo dT25 astar astar21kullanılabilirliğini azaltabilir potansiyel olarak formu zayıf ikincil yapılar için örneğin tahmin edilmektedir. Herhangi bir ikincil yapılar ilk denatürasyon uzunluğu ve sıcaklık artan keser ve yardımcı olur tek belirli bant 3' yarışı son döngüsü sonra verim. Buna ek olarak, non-spesifik band yüksek PCR döngüsü (35 döngüleri); sırasında ortaya çıktı düşündüren beklenen bantları daha hafif Sadece 20 için PCR devir sınırlayıcı non-spesifik grup amplifikasyon azaltır.
3' ırk, diğer temel PCR reaksiyonları gibi başka bir potansiyel hedef bölge22eksik amplifikasyon var. Bu nedenle, her iki termofilik enzimler için ilk tavlama sıcaklığı 50 ° c hedefe astar, tavlama optimize etmek 5 min için kuruldu ve bu bir ilk uzantısı sıcaklık 10 dk 72 ° C'de izledi. Her enzim son PCR çevriminde bir son uzantısı zaman 15 dk 72 ° C'de vardı. Uzantısı adımları bu DNA polimerazlar üreticileri tarafından önerilen daha uzun. Uzun uzatma (uzatma) adım tam eksik amplicons, ilk ve son amplifikasyon ürünleri16tam uzantısı etkinleştirme sentezi sağlar.
Eğer genomik DNA (ya da diğer DNA kirlenme) hedef mRNA transkript yerine birkaç beklenmedik bantları jel22sonuçlanan tespit bu yüzden 3' yarış ortaya çıkan PCR adımların son derece duyarlıdır. Kontaminasyonu önlemek için bir özel bir PCR mahallede PCR çalışmayı gerçekleştiren, eldiven ve temiz reaktifler ve autoclaved steril tüpler kullanın ve ipuçları pipet için yoludur. (İntron astar arasında); farklı ekzonlar üzerinde bulundukları bu yüzden düzenli PCR içinde-ebilmek var olmak ressam ileriye ve geriye doğru astar Bu şekilde, anormal derecede büyük bir PCR ürünü bir intron içeren bir bölge güçlendirilmiş anlamına. Sadece 3' UTR sırası, aynı terminal exon içinde yer alan 3' yarış amplifikasyon için hedeftir durumunda olduğunu ancak, bu her zaman mümkün olmayabilir. Alternatif olarak, RNA Dnaz enzim önce cDNA sentezi ile önceden işlenmiş olabilir. T7 oligo dT25 ilk RNA ilk strand cDNA sentezi için rasgele bir hexanucleotide yerine ters transkriptaz tepkiden Başbakan için kullanımı da genomik ürünleri amplifikasyon azaltır. Son fakat en az değil, bir negatif kontrol ayarı ("-" şerit Şekil2), nerede cDNA sentez transkriptaz yokluğunda kurmak şiddetle tavsiye edilir. Denetimin diğer örnekleri sonraki 3' yarış yordamlar için aynı adımları uğrar. Bu denetimi bir grupta varlığı potansiyel genomik DNA kirlenme anlamına gelir.
Söz konusu zorluklara rağmen 3' yarış 3' ucunda bir genin olarak eşleme güçlü bir araçtır. Yeni nesil teknolojisi gelişine veya Alternatif işlenim içerebilir değil alternatif Poliadenilasyon kaynaklanan alternatif 3' ucu var transkript repertuar bir artışa yol açmıştır. Kanser hücreleri, karmaşıklığı eklemek için kromozomal düzenlemeler sıktır ve oncogenic gen füzyon ürünleri23' neden olabilir. Füzyon arasında iki gen ORF dahil veya bazı durumlarda, sadece 3' UTR9,10içinde dizileri içerir. Ayrıca, ayrıca aynı anda transkripsiyonu ama farklı proteinler11tercüme edilebilir yapışık/co-transcribed gen vardır. 3' yarış tüm bu benzersiz, anormal transkript yanı sıra normal transkript eşlemek için uygun olabilir. Bu önemli çünkü bu anormal transkript hastalığı belirli biyolojik veya özel uyuşturucu hedefler, örneğinolarak hizmet sonunda olabilir, uyuşturucu Imatinib BCR-ABL1 füzyon gen kanser hedefler.
Bu nedenle, 3' yarış normal transkript yükseltmek, roman 3' UTRs ve roman gen füzyon 3' UTR5,9tanımlamak için kullanılan bir çok yönlü bir tekniktir. Bu raporda, 3' yarış kodonu, PAS ve tüm 3' UTR farklı DNA polimerazlar kullanarak ANKHD1 transkript, Haritası ve yükseltmek için kullanıldı. Açıklanan yaklaşım herhangi bir poliadenile transkript 3' sonu eşleştirmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bettine Gibbs teknik yardım kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
- Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
