Summary
Två olika 3' snabb förstärkning av cDNA ändar (3' RACE) protokoll beskrivs här gör användning av två olika DNA-polymerases mappa sekvenser som innehåller ett segment av ramen öppen läsning (ORF), den stop kodon och den hela 3' UTR av en avskrift som använder RNA erhållits från annan cancer cellinjer.
Abstract
Mognaden av eukaryota mRNA innebär 3' slutet-formationen, vilken innebär tillägg av en poly(A) svans. För att kartlägga 3' ände en gen, är den traditionella metoden för val 3' snabb förstärkning av cDNA slutar (3' RACE). Protokoll för 3' RACE kräver noggrann design och urval av kapslade primers inom 3' oöversatta regionen (3' UTR) av målgenen sevärdheter. Men, med några ändringar i protokollet kan användas till att omfatta hela 3' UTR och sekvenser inom ramen öppen läsning (ORF), som ger en mer heltäckande bild av förhållandet mellan ORF och den 3' UTR. Detta är förutom identifiering av polyadenylation signalen (PAS), liksom webbplatsen klyvning och polyadenylation som tillhandahålls av konventionella 3' RACE. Utökad 3' RACE kan upptäcka ovanliga 3' utr, inklusive genfusioner inom den 3' UTR, och sekvens informationen kan användas för att förutsäga potentiella miRNA bindningsställen samt AU rika destabiliserande element som kan påverka stabiliteten i avskriften.
Introduction
Bildandet av slutet 3' är ett kritiskt steg i mRNA mognad som består av klyvning av pre-mRNA nedströms av en PAS följt av tillägg av ~ 250 untemplated adenines, som gör upp poly(A) svans1,2. Poly(A) bindande proteinet (PABP) binder till poly(A) svansen, och detta skyddar mRNA avskriften från nedbrytning och underlättar översättning1.
Aktuella beräkningar föreslår att 70% av mänskliga gener har flera PASs, och således genomgå alternativa polyadenylation, vilket resulterar i flera 3' slutar3. Det är därför viktigt att identifiera där poly(A) svansen fäster till resten av de 3' UTR, samt identifiera PAS används av någon viss avskrift. Tillkomsten av nästa generations sekvensering har resulterat i samtidig identifiering av de 3' utr och passera av tusentals gener. Denna ökning av sekvensering kapacitet krävs utveckling av bioinformatiska algoritmer att analysera data som rör alternativa polyadenylation av 3' slutet. För de novo detektering eller validering av PAS och därmed kartlägga 3' ände enskilda gener från storskalig sekvensering data, återstår 3' RACE metoden för val4,5. De sekvenser som ingår i cDNA produkter av 3' RACE normalt omfatta endast en del av de 3' UTR som innehåller poly(A) svansen, webbplatsen klyvning, PAS och sekvenserna uppströms av PAS. Till skillnad från PCR, som kräver utformningen och användningen av genen specifika framåt och bakåt grundfärger, kräver 3' RACE endast två gen specifika kapslade framåt primers. PCR kräver därför en mer detaljerad kunskap om av nukleotidsekvensen i en stor region av genen förstärkt4,6. Eftersom 3' RACE använder reverse samma primer att mål poly(A) svans för alla polyadenylated RNA avskrifter, endast framåt primers behöver vara gen specifika, således, som endast kräver kunskap om ett betydligt mindre område av mRNA. Detta gör det möjligt för förstärkning av regioner vars sekvenser inte är fullständigt karakteriserad4,7. Detta har gjort minst 3' RACE att användas inte bara att avgöra 3' ände en gen, men att också fastställa och karakterisera stora regioner uppströms i PAS som utgör en betydande del av de 3' UTR. Genom att kombinera 5' RACE med den modifierade 3' RACE som innehåller större portionr av de 3' UTR och flankera regioner, är det möjligt att helt sekvens eller klona en hela mRNA avskrift från slutet 5' till dess 3' slutet8.
Ett exempel på denna tillämpning av ändrade 3' RACE är senaste identifiering av en roman CCND1-MRCK fusion gen avskrift från mantelcellslymfom cellinjer och cancerpatienter. Den 3' UTR bestod av sekvenser från både CCND1 och MRCK gener och var motsträviga till miRNA förordning9. Två kapslade CCND1 specifika framåt primers kompletterade i regionen omedelbart angränsande och nedströms den CCND1 stop kodon. Även om hela transkriptom sekvensering tillsammans med specifika bioinformatiska verktyg kan användas för att upptäcka genfusioner inom de 3' UTR10, många laboratorier kan saknar ekonomiska resurser eller bioinformatiska expertis för att göra användningen av denna teknik. Därför är 3' RACE ett alternativ för de novo identifiering och validering av nya fusion gener som involverar den 3' UTR. Med tanke på den drastiska ökning av antalet rapporterade fusion gener samt Läs igenom avskrifter, blivit 3' RACE ett kraftfullt verktyg i kännetecknar gen sekvenser11,12. Nya studier har dessutom visat att olika sekvenser inom den 3' UTR samt längden på den 3' UTR kan påverka mRNA avskrift stabilitet, lokalisering, översättbarhet och funktion13. Beror delvis på ett ökat intresse i kartläggning av transkriptom, har det skett en ökning av antalet olika DNA-polymerases utvecklas för användning i labbet. Det är viktigt att bestämma vilka typer av ändringar kan göras till 3na ' RACE protokoll i syfte för att utnyttja den tillgängliga repertoaren av DNA-polymerases.
Detta arbete rapporter anpassning 3' RACE att mappa den hela 3' UTR, PAS, och 3' slutet klyvning platsen av ANKHD1 utskriften med hjälp av kapslade grundfärger i avsnittet ANKHD1 i avskriften och två olika DNA-polymerases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bära en labbrock, handskar och skyddsglasögon vid alla gånger medan du utför alla procedurer i detta protokoll. Se till att behållare/rör som innehåller fenol och guanidin isotiocyanat reagensen bara öppnas i en certifierad huva och kassera fenol avfall i en utsedda behållare. Använda DNAS/RNAse-free sterila tuber, tips och reagenser.
1. cell kultur
- Växa i HeLa cellen fodrar och två suspension mantle cell lymfom cellinjer, Granta-519 och Jeko-1, i DMEM innehållande 10% FBS och 100 U/mL Penicillin/Streptomycin i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C. Späd cellerna 1:10 och räkna med en partikel counter14.
- För RNA-extraktion, tallrik 500 000 celler per brunn i en 6 väl platta (2 mL media per brunn). Efter inkubation i 24 h, samla RNA från cellerna.
2. RNA-extraktion
- Skörda celler
Obs: Med undantag för centrifugeringssteget utför alla börsnoterade steg i vävnadsodling huva att upprätthålla sterilitet.- För suspension celler (Jeko-1 och Granta-519):
- Överföra cellerna (tillsammans med 2 mL av media) till en 15 mL tub, och centrifugera 1,725 x g för 5 min. Aspirera media och lämnar cellpelleten i botten av röret.
- Återsuspendera cellpelleten i 50 µL av 1 x fosfat fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 500 µL monofasiska fenol och guanidin isotiocyanat reagens i varje prov i 1,5 mL mikrocentrifug röret. Blanda väl och låt vid rumstemperatur (RT) för 5 min medan vända den mikrocentrifug rör varje 1 min.
- För vidhäftande celler (HeLa):
- Aspirera cell kultur media från varje brunn. Tillsätt 1 mL PBS till varje brunn för att tvätta bort skräp.
- Ta bort PBS och tillsätt 500 µL monofasiska fenol och guanidin isotiocyanat reagensmedel till varje brunn.
- Inkubera vid RT i 5 min med mild gunga. Överföra till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- För suspension celler (Jeko-1 och Granta-519):
- Cellys
- Frysa fenol och guanidin isotiocyanat cell blandningen vid-20 ° C i 1 h.
Obs: Mixen kan lämnas vid-20 ° C över natten, eller tills den behövs. - Tina fenol och guanidin isotiocyanat cell blandningen på is. Tillsätt 100 µL av kloroform till mikrocentrifug röret i en PCR-huva. Vortex provet för 10-15 s tills blandningen är rosa och ogenomskinlig. Inkubera provet på is (vid 4 ° C) i 15 min.
- Centrifugera provet för 15 min vid 20,800 x g och 4 ° C. Ta försiktigt bort övre färglös vattenfasen (~ 200 µL) och överföring till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Frysa fenol och guanidin isotiocyanat cell blandningen vid-20 ° C i 1 h.
- RNA nederbörd
- Tillsätt en motsvarande volym av isopropanol till varje prov. Tillsätt 1 µL av coprecipitant (se Tabell för material) för varje provtagning för att fungera som en bärare för RNA och hjälp visualisera RNA i efterföljande steg. Inkubera provet vid-80 ° C i minst 4 tim. För bästa resultat, inkubera över natten vid-80 ° C.
- Överför provet till en kyld centrifug. Centrifugera i 35 min på 20,800 x g / 4 ° C; RNA visas som en blå fläck på undersidan av röret. Ta försiktigt bort isopropanol från provet. Tillsätt 500 µL av 80% etanol och återsuspendera pelleten av kort vortexa för 3 s.
- Centrifugera provet vid 20,800 x g på RT i 5 min. ta bort alla etanol från provet. Låt provet lufttorka för ca 10 min. Återsuspendera provet i 35 µL RNAse-gratis vatten. Placera på en värme block (65 ° C) under 5 minuter för att RNA är fullt i lösning och omedelbart placera röret på is.
- Bestämma koncentrationen av total-RNA med en spektrofotometer som tidigare beskrivits, utom använda 1,5 µL av det RNA-provet i stället för 1 µL15. Alternativt kör 1 µg totalt RNA på en 1% agarosgel att bestämma RNA integritet.
3. DNAS behandling
- Efter kvantifiering av RNA, utföra DNAS behandling på den total-RNA att förnedra någon genomiskt DNA. För varje prov, lägger du till följande reagenser från RNAse-fri DNAS kit att göra en 20 µL totala reaktion blanda i ett separat mikrocentrifug rör:
- Blanda 2 µL av DNAS 10 X reaktion buffert med 4,4 µg av total-RNA. Ta till sammanlagt 14 µL med vatten.
- Tillsätt 2 µL av RNase-fri DNAS. Inkubera vid 37 ° C i 30 min i närvaro av 2 µL av RNase inhibitor (från omvänd Transkription Kit).
- Tillsätt 2 µL stopplösning och värme på en värme block för 10 min vid 70 ° C att inaktivera enzymet DNAS.
Obs: DNAS behandling är valfritt.
4. cDNA syntes
För en slutlig reaktionsvolym 50 µL:
- För en slutlig reaktionsvolym 50 µL: överföring 22 µL av DNAS behandlade RNA till en ny tub eller överföring 4 µg totalt RNA med tillsats av vatten till en total volym på 22 µL till en ny tub. Tillsätt 2 µL av T7 oligo dT25 primer från 10 µM primer lösning. Sekvensen för T7 oligo dT25 primern är 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
- Lägg till 2 µL av den RNase inhibitor (20 U/µL), 8 µL av 5 x reaktion bufferten, 4 µL 10 mM dNTP och 2 µL av den omvänt transkriptas (200 U/µL) från omvänd Transkription kit.
Obs: Ställ in en reaktion utan omvänt transkriptas att agera som en negativ kontroll. - Inkubera vid 42 ° C under 1 h. överföring direkt till is. Värm röret vid 75 ° C i 5 min och placera röret på is.
5. primer Sök efter Fusion gen avskrift
-
Primer design
- Hämta cDNA sekvensen från Ensemble genomet webbläsaren (ENST00000360839.6/NM_017747), och identifiera en region inom ORF av målet utskriften (ANKHD1) uppströms av den stop kodon. Kopiera och klistra in hela regionen (upp till 700 nukleotider) som innehåller sekvenser uppströms av den stop kodon i regionen sekvens inträde av programvaran primer design (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
- Välj alternativet Visa anpassad design och 10 för antalet grundfärger att systemet ska generera (resultat att återvända) och lämna alla övriga parametrar angetts som standard.
- Välja fem framåt primers och två omvända primers som inte överlappar varandra. Beställ primers och Beredes med RNAse/DNAS-fritt vatten till en slutlig koncentration av 10 µM. Mer information om allmänna primer design för PCR täcks någon annanstans16.
-
PCR att identifiera potentiella primers för användning i efterföljande 3' RACE
Obs: För att avgöra de slutliga framåt grundfärger att använda i reaktionen, testa designade primers genom att ställa in olika kombinationer av framåt och bakåt primers för vanlig PCR i en PCR-huva.- Överföra cDNA (2 µL) till en fräsch 0,5 mL PCR-rör. Lägga till 1 µL framåt primer och 1 µL reverse primer (från en 10 mM primer lösning). Gör upp till 12,5 µL genom att lägga till 8,5 µL nuclease-gratis vatten. Tillsätt 12,5 µL av 2 x PCR-till-Gel Master Mix.
- Använd följande PCR termisk cykling villkor: 95 ° C under 2 minuter följt av 29 cykler av 95 ° C under 30 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C under 1 min. Ange den sista cykeln vid 68 ° C i 7 min.
- Efter PCR, kör produkterna på en 1% agarosgel färgas med etidiumbromid. Detaljer för elektrofores som tidigare beskrivs med några ändringar17.
- Lös upp 1 g av agaros i 100 mL Tris-acetat (TAE) buffert i en 250 mL mätkolv. Koka i mikrovågsugn.
- Låt svalna i 1 min och tillsätt 7,5 µL av etidiumbromid bromid lösning (10 mg/mL lager) i dragskåp. Blanda väl genom virvlande kolven och häll i en horisontell gel apparatur. Lämna på RT i dragskåp för minst 30 min så att gelen stelna.
- Täck gelen med 1 x TAE buffert och ladda 10 µL av PCR-produkten på agarosgel tillsammans med 3-5 µL av DNA molekylvikt stege. Kör på 175 V för 10 min. visualisera produkterna använder en imager och om det krävs ytterligare separation av produkter, Kör gelen för en ytterligare 5-10 min.
-
Urval av kapslade primers för 3' RACE
- Analysera resultaten av PCR agarosgel att välja primers som har en tydlig, stark, enkel PCR-band. Använd 5'-mest primer (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') tillsammans med T7 oligodT25 primern i första PCR kör.
- Välj den kapslade primer som ligger nedströms om första primern (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), och använda den med T7 primern (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') i den andra uppsättningen av PCR-reaktioner.
6. optimera 3' RACE att mappa den 3' UTR med två olika enzymer
Obs: Det har skett en ökning i mångfalden av DNA-polymerases som används för PCR. Därför ville vi fastställa standardvillkor som kan tillämpas även när du använder olika enzymer för 3' RACE PCR-reaktioner. Omvänd primers för varje avskrift hålls konstant. den enda förändringen är kapslade framåt primers som är specifika för målet avskriften.
-
Protokoll 1:3 ' RACE med en modifierad DNA-polymeras från Pyrococcus furiosus (Pfu)
- Första PCR
- Överför 1 µL av cDNA till en PCR-röret och tillsätt 5 µL 10 x Pfu reaktion buffert. Lägg till 1 µL av den första kapslade framtida primern, 1 µL T7 oligodT25 primer och 1 µL dNTP (från en 10 mM lösning).
- Gör upp till 49 µL totala volymen genom att lägga till 40 µL av vatten. Tillsätt 1 µL av Pfu DNA-polymeras och blanda väl. Köra PCR med PCR-profil i tabell 1.
- Andra PCR
- Överför 2 µL av produkter från den första PCR till en ny PCR-röret och blanda med 5 µL 10 x PfuUltra II reaktion buffert. Tillsätt 1 µL andra nästlade PCR primer, 1 µL T7 primer och 1 µL dNTP (10 mM lösning).
- Gör upp till 49 µL totala reaktionsvolym genom att lägga till 39 µL av vatten. Tillsätt 1 µL av Pfu DNA-polymeras. Köra PCR med samma PCR-profil som första PCR-inställning (tabell 1).
- Första PCR
-
Protokoll 2:3 ' RACE med en chimär DNA-polymeras som består av en DNA bindande domän smält till en Pyrococcus-som korrekturläsning polymeras PCR master mix
- Första PCR
- Över 1 µL av cDNA till en PCR-röret. Lägga till 1 µL av den första kapslade framtida primern och 1 µL T7 oligodT25 primer. Gör upp till 25 µL genom att lägga till 22 µL av vatten.
- Tillsätt 25 µL av 2 x PCR Master Mix och blanda väl. Använd PCR cykling villkoren i tabell 2.
- Andra PCR
- Över 2 µL av produkter från den första PCR till en ny PCR-röret. Tillsätt 1 µL av andra nästlade PCR primern tillsammans med 1 µL T7 reverse primer.
- Gör upp till 25 µL genom att lägga till 22 µL av vatten. Tillsätt 25 µL av 2 X PCR Master Mix. Köra PCR med samma PCR-profil som första PCR-inställning (tabell 2).
- Första PCR
7. Kontrollera andra PCR-produkten av 3' RACE.
- Ta 5-10 µL av den andra PCR-produkten (liksom produkt från den första omgången av primärvården om avskriften uttrycks rikligt) och kör på en agarosgel. Ställa in gelen och köra den elektrofores som tidigare beskrivits (steg 5.2.3.1 att 5.2.3.3). Visualisera resultaten på en imager.
8. produkt rening och sekvensering
- Rena gel PCR produkter från andra PCR med hjälp av Gel och PCR Fragment DNA Clean-Up System enligt tillverkarens protokoll.
- Utföra Sanger sekvensering (alternativt skicka gelen renat PCR-produktprover och lämpliga sekvensering grundfärger till en sekvensering lab). Analysera sekvensering data efter Sanger sekvensering.
- Ladda ner sekvens-analys programvara (se Tabell av material) och importera spårningsfilerna till programvaran. Använd den enskilda ren bas QVs (kvalitet värden) för att få basen ring information18. Hämta kromatogrammet med högkvalitativa spår för visning.
Tillval: Gel renade produkten kan klonas med hjälp av en lämplig kloning kit och isolerade klonerna skickas för Sanger sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kapslade framåt Primer Sök:
Agarosgel från Figur 1 visar två distinkta PCR gel produkter (körfält 1 och 2) som använder samma vidarebefordra primer men olika omvänd grundfärger. Lane 3 har en distinkt PCR-produkt och har en distinkt framåt och bakåt primer. Perfekt primers för PCR-baserade reaktionen är de som ger en distinkt PCR-produkt (Lane 3). Forward primer används i körfält 1 och 2 ger det starkaste bandet ger största PCR-produkterna (förväntad) och används som första framåt primer. Den andra kapslade primern för den andra uppsättningen av PCR-reaktioner i 3' RACE är den framåt primern från Lane 3.
Olika DNA-Polymerases används i 3' RACE producera liknande resultat:
Två olika DNA-polymerases produceras samma storlek PCR produkter trots olika PCR cykling villkor för den 3' RACE (figur 2). Det finns bara ett distinkt band för beräknade PCR produkten. Alla minus omvänt transkriptas negativa kontroller (-) inte har ett band, visar ingen genomisk kontaminering av RNA används i cDNA syntes så väl som i efterföljande nedströms reaktioner.
Sanger sekvensering resultat:
PCR-produkterna var gel renas och skickas för Sanger sekvensering. Resultaten visas i figur 3A visar en del av en sekvens kolonnen från Sanger sekvensering. En representativ sekvens identifierar platsen för den stop kodon, förmodad polyadenylation signal, och webbplatsen klyvning, samt poly (A) svans i 3' RACE produkten (figur 3B).
Figur 1: identifiering av två kapslade gen specifika framåt grundfärger att använda i 3' RACE. Visas är ett exempel av PCR produkter från olika kombinationer av genen specifika framåt och omvänd primers hjälp HeLa cDNA kör på en etidiumbromid som målat agarosgel med molekylvikt (mw) stege. Lanes 1 och 2 är PCR produkter från samma gen specifika framåt primer men olika omvänd grundfärger. Pilarna pekar på den beräknade PCR produkten för varje lane. Förutom bandet för beräknade PCR produkten finns det ett extra band. Enda PCR-produkten i Lane 3 är från en annan gen specifika kapslade framåt och bakåt primer och visar det enda förväntade bandet.
Figur 2: kontroll av 3' RACE produkter från den andra uppsättningen av PCR reaktioner. Produkter från andra PCR-reaktionen med (A) Pfu DNA-polymeras och (B) chimära DNA-polymeras kördes på en agarosgel med etidiumbromid. Lanes avbildad av (-) är från det negativa kontrollprovet för varje cellinje när cDNA syntes från RNA genomfördes i avsaknad av enzymet omvänt transkriptas. Lanes 1 och 2 är PCR produkter från biologiska replikat för varje cellinje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mappning av PCR produkter från 3' RACE. (A) A del av en sekvens kromatogram av en gel som renat 3' RACE produkt visar den förutspådda polyadenylation signalen och placeringen av poly(A) svansen. (B) representant sekvenser från Sanger sekvensering data visar den stop kodon, polyadenylation signalen (PAS), webbplatsen klyvning och fastsättning av poly(A) svansen samt ett avsnitt av poly (A) svans sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cykel steg | Temperatur och varaktighet | Antal cykler |
| Inledande denaturering | 95 ° C under 3 min | 1 |
| Inledande glödgning och förlängning | 50 ° C i 5 min och 72 ° C under 10 min | 1 |
| Subcyles (denaturering, glödgning och förlängning) | 95 ° C i 40 s, 50 ° C i 1 min, och 72 ° C under 3 min | 20 |
| Sista cykeln (denaturering, glödgning och förlängning) | 95 ° C i 40 s, 50 ° C i 1 min, och 72 ° C under 15 minuter | 1 |
| Håll | 4 ° C, ∞ |
Tabell 1: Pfu DNA-polymeras PCR cykling villkor för 3' RACE.
| Cykel steg | Temperatur och varaktighet | Antal cykler |
| Inledande denaturering | 98 ° C för 3 min | 1 |
| Inledande glödgning och förlängning | 50 ° C i 5 min och 72 ° C under 10 min | 1 |
| Subcyles (denaturering, glödgning och förlängning) | 98 ° C i 30 s, 50 ° C i 1 min, och 72 ° C under 4 minuter | 20 |
| Sista cykeln (denaturering, glödgning och förlängning) | 98 ° C i 30 s, 50 ° C i 1 min, och 72 ° C under 15 minuter | 1 |
| Håll | 4 ° C, ∞ |
Tabell 2: Chimära DNA polymeras PCR cykling villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots tillkomsten av massiva parallella sekvensering teknik, på grundval av gen-av-Gen 3' RACE är fortfarande den enklaste och mest ekonomiska metoden att identifiera PAS och nukleotider intill poly(A) svansen. Anpassning beskrivs här expanderar med 3' RACE att både förstärka och karta sekvenser som inkluderar en del av ORFEN, den stop kodon och den hela 3' UTR av ANKHD1 mRNA utskriften. En stor fördel med 3' RACE är att produkter från 3' RACE med några smärre anpassningar, kan klonas till andra vektorer att underlätta efterföljande förhör av 3' UTR funktion inklusive miRNA inriktning, stabilitet analyser samt andra mekanistiska analyser. Detta kan göras genom att inkludera restriktionsenzym platser inom de kapslade primer sekvenser9,10. Justeringar kan göras för att inkludera endast de 3' UTR utan några sekvenser från ORF för kloning för 3' UTR funktionella analyser5.
Avgörande betydelse för framgången av 3' RACE är utvecklingen av kapslade primers som riktar gen av intresse. CDNA sekvenser från häckning genomet webbläsaren rekommenderas att bäst identifiera regioner utan polymorfismer för att utveckla optimala primers. Helst vidarebefordra flera kapslade grundfärger samt minst två omvända primers inom genen av intresse kan säkerhetskontrolleras med standard PCR för att identifiera bästa två kapslade gen specifika primers att använda. I denna studie gav den första specifika framåt gen-primer som är valt för 3' RACE initialt två band med standard PCR används rutinmässigt i labbet. Tyvärr, primer design begränsades av det stora antalet SNP i utskriften av intresse. SNP i målet avskriften leda till obalans mellan primers och målet, vilket kan leda till ineffektiva glödgning och förstärkning, och bör reduceras till en minimum19. Förekomst av minst fyra SNPs i en primer eller förekomsten av en kombination av fem missmatchningar (tre i en primer och två i den andra) kan resultera i fullständig hämning av PCR-reaktionen, och därmed det enda alternativet är att utforma mer primers20. Istället för att utforma mer grundfärger att få ett enda band för den standard som PCR används för primer sökningen i experiment som redovisas här, har PCR cykling villkoren och de DNA-polymerases som senare används i 3' RACE ändrats för att optimera sannolikheten för att få ett specifikt band. Denaturering temperaturen höjdes till 98 ° C för en av de DNA-polymerases (en ökning från 95 ° C används i primer Sök). För båda DNA-polymerases som används i den 3' RACE PCR, den inledande denaturering var förlängas till 3 min istället för de rekommendera 30 s till 2 min för att fullständigt denaturera cDNA mallen. Potentiellt bilda svaga sekundära strukturer, vilket kan minska tillgängligheten av primers21spås T7 oligo dT25 primern till exempel. Öka den inledande denaturering längd och temperatur bryter några sekundära konstruktioner och hjälper ge det enda specifika bandet efter den sista cykeln i 3' RACE. Dessutom, var icke-specifik bandet lättare än de förväntade band, vilket tyder på att det verkade vid högre PCR-cykler (upp till 35 cykler); begränsa de PCR-cyklerna till endast 20 minskar förstärkning av icke-specifika bandet.
En annan potential 3' RACE, som andra PCR-baserade reaktioner, är ofullständig förstärkning av mål regionen22. Därför den ursprungliga glödgning temperaturen var fastställd vid 50 ° C för 5 min att optimera påkoppling av primers till målet för båda termofila enzymer och detta följdes av en första förlängning temperatur vid 72 ° C i 10 min. Den slutliga PCR-cykeln för varje enzym hade en sista förlängning tid 15 min vid 72 ° C. Här förlängning var längre än de som rekommenderas av tillverkarna av de DNA-polymerases. Steget lång förlängning (töjning) tillåter fullständig syntes av ofullständig amplikoner, aktivera full utbyggnad av de ursprungliga och slutliga förstärkning produkter16.
PCR-steg som förekommer i 3' RACE är mycket känsliga, så de kan upptäcka genomiskt DNA (eller andra DNA-kontaminering) i stället för målet mRNA avskriften, vilket resulterar i flera oväntade band på gel22. Ett sätt att förhindra kontaminering är utför PCR-arbetet i en dedikerad PCR-huva, bära handskar, och använda rena reagenser och autoklaveras sterila tuber och Pipettera tips. I vanlig PCR, kan framåt och bakåt primers utformas så att de ligger på olika exonerna (över intron primers); på detta sätt skulle en onormalt stor PCR-produkt innebära att en region som innehåller en intron har förstärkts. Men kan det inte alltid är genomförbara i händelse av att endast den 3' UTR sekvens, ligger inom den samma terminal exon, är målet för 3' RACE förstärkning. Alternativt kan RNA förbehandlas med DNAS enzym innan cDNA syntes. Användning av T7 oligo dT25 primern till prime omvänt transkriptas reaktionen istället för en slumpmässig hexanucleotide för första strand cDNA syntes från RNA minskar också förstärkning av genomisk produkter. Sist men inte minst, att inrätta en negativ kontroll (den ”–” körfält i figur 2), där cDNA syntes är inställd i avsaknad av omvänt transkriptas rekommenderas starkt. Kontroll genomgår identiska steg till de andra proverna i de efterföljande 3' RACE förfaranden. Förekomsten av ett band i denna kontroll innebär potentiella genomisk DNA-kontaminering.
Trots de ovannämnda utmaningarna är 3' RACE ett kraftfullt verktyg i kartläggning 3' ändarna på grundval av enskilda genen. Tillkomsten av nästa generations teknik har lett till en ökning av repertoaren av avskrifter som har alternativa 3' slutar som följd av alternativa polyadenylation, som får eller inte får innebära alternativ splitsning. Att lägga till komplexiteten, i cancerceller, kromosomala rearrangements är vanliga och kan resultera i onkogena gen fusion produkter23. Fusion mellan de två generna kan involvera ORF eller, i vissa fall omfatta endast sekvenser inom den 3' UTR9,10. Dessutom finns det också conjoined/co-transcribed gener, som transkriberas samtidigt men kan översättas till olika proteiner11. 3' RACE kan skräddarsys för att kartlägga alla dessa unika, onormal avskrifter samt normala utskrifter. Detta är viktigt eftersom dessa onormala avskrifter kan hamna som sjukdomen specifika biomarkörer eller specifika målmolekyler, t.ex., läkemedlet Imatinib mål genen BCR-ABL1 -fusion i cancer.
Därför är 3' RACE en mycket mångsidig teknik som kan användas för att förstärka normala avskrifter, identifiera roman 3' utr, och romanen genfusioner inom 3' UTR5,9. I denna rapport, 3' RACE användes för att förstärka och karta den stop kodon, PAS och den hela 3' UTR av ANKHD1 utskriften med hjälp av olika DNA-polymerases. Den beskrivna metoden kan användas för att mappa 3' ände något polyadenylated avskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna Bettine Gibbs för hennes teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L.
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
- Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
