Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å analysere immun celleinnholdet av fettvev av isolering av immunceller fra fettvev og påfølgende analyse ved hjelp av flowcytometri.
Abstract
Infiltrasjon av immunceller i fettvev subkutan og visceral (AT) innskudd fører til en lav-grade betennelse bidra til utviklingen av fedme-assosiert komplikasjoner som type 2 diabetes. Kvalitativt og kvantitativt undersøke immun celle undergrupper i menneskelig på innskudd, har vi utviklet en flyt cytometri tilnærming. Den pancreatic (sendinger), som inneholder immunceller, er isolert fra subkutan og visceral på biopsies av collagenase fordøyelse. Adipocytter er fjernet etter sentrifugering. Sendinger cellene er farget for flere membran-bundet markører valgt å skille mellom immun celle undergrupper og analysert ved hjelp av flowcytometri. Som følge av denne pro - og anti - inflammatory macrophage undergrupper, dendrittiske celler (DCer), B-celler, CD4+ og CD8+ T-celler, og NK celler kan oppdages og kvantifisert. Denne metoden gir detaljert informasjon om immunceller i AT og hvor mye hver bestemt delsett. Siden det finnes mange fluorescerende antistoffer, kan vår flyt cytometri tilnærming justeres for å måle ulike andre cellulære og intracellulær markører av interesse.
Introduction
Fedme er preget med lav kvalitet AT betennelse1 og infiltrasjon av pro-inflammatoriske immunceller i både visceral og underhud på (moms, satt). Akkumulering av pro-inflammatoriske immunceller i karet fører til insulinresistens som er en primær risikofaktor for å utvikle type 2 diabetes2. Immunceller i begge medfødte og adaptive immunsystemet finnes i overvektige AT, som makrofager, mastceller, nøytrofile, CD4+ og CD8+ T-celler og B-celler3,4,5,6 ,7. Disse immunceller, sammen med endotelceller, stromal celler, adipocyte progenitors, fibroblaster og pericytes, utgjør den sendinger8 og er den viktigste kilden til pro-inflammatoriske stoffer i på9.
Inflammatorisk status på er vanligvis undersøkt av teknikker som Western blot10, qPCR11og immunohistochemistry11. Men når du bruker disse teknikkene, hele på, adipocytter og sendinger, brukes. Dette gjør det vanskelig å avgjøre beløpet og delsett av immunceller i AT. Immunceller har ulike celle indikatorer som definerer og kategorisere dem som makrofager. Makrofager viser betydelig heterogenitet i både funksjonen og celle overflaten markør uttrykk12. Derfor de er ofte delt inn i to macrophage bestander: M1 og M2. M2 makrofager kalles vanligvis også aktivert makrofager12,13 og bor i AT magre, metabolically normale mennesker14. Men under fedme oppstår en fenotypiske bryter fra M2 makrofager til M1 makrofager. Dette klassisk aktivert M1 makrofager express CD11C12 og samle seg rundt døde adipocytter til crown-lignende strukturer13. Det har vist at CD11C+ makrofager i AT svekke insulin handling og er assosiert med insulinresistens i overvektige mennesker15. Finn M1 og M2 makrofager i AT ved er immunohistochemistry et alternativ. Denne teknikken gir informasjon om plasseringen av makrofagene vev. Det vil imidlertid begrense antall indikatorer som kan brukes i en flekker. Videre er det også vanskelig å kvantifisere. Derfor, for å undersøke ulike immun celle delsett i mva- og lør innskudd, har vi utviklet en flyt cytometri tilnærming. Denne tilnærmingen gir oss mulighet til å bruke flere markører per celle med en flyt cytometri analyse å definere celle undergrupper og telle antall hver delsett i på innskudd.
Protocol
Visceral og underhud på prøver ble tatt fra fag i studiet godkjent medisinsk etiske komiteen Jessa sykehus, Hasselt og Hasselt universitetet, Belgia, i henhold til erklæringen i Helsinki.
1. forberedelse av reagenser
- Collagenase løsning
- Oppløse 1 g av Collagenase bufret I 10 mL av fosfat saltvann (PBS, uten kalsium og magnesium) for å gjøre en 100 mg/mL lagerløsning. Forberede 200 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Oppløse 1 g Collagenase XI i 10 mL PBS å gjøre en 100 mg/mL lagerløsning. Forberede 200 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Oppløse 10 mg av DNase I 10 mL PBS å gjøre en 10 mg/mL lagerløsning. Forberede 180 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Legge til 100 µL Collagenase jeg (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) og 90 µL DNase I (10 mg/mL) til 10 mL av DMEM Ham F12. Gjør collagenase løsning frisk for hver isolasjon.
- Røde blodlegemer lyseringsbuffer
- Oppløse 0.84 g NH4Cl i 100 mL ultrapure vann.
- Angi pH på 7,4 før bruk. Lagre i en glass bolle på 4 ° C.
- Plass lyseringsbuffer røde blodlegemer på is før bruk.
- FACS buffer
- Løses 0,5 g bovin serum albumin (BSA) i 100 mL PBS hente 0,5% BSA PBS.
- Oppløse 65 mg av NaN3 i 100 mL 0,5% BSA PBS å få 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Lagre løsning i en glass bolle på 4 ° C.
- Sted FACS buffer på is før bruk.
FORSIKTIG: NaN3 er svært giftig. Arbeide i avtrekksvifte og vernebriller og hansker for beskyttelse under behandling NaN3.
- Menneskelige IgG blokk
- Oppløse 10 mg av menneskelig IgG i 10 mL PBS å få 1 mg/mL. Forberede 100 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Plass menneskelige IgG blokken på is før bruk.
2. isolering sendinger fra AT
- Klipp 1 g på biopsi i små biter (± 2 mm2) med en skalpell og overføre til en 50-mL sentrifuge tube (f.eks, Falcon rør). Legge til 10 mL collagenase løsning til hver på prøven.
Merk: Lukk lokket på røret helt og dreie lokket ¼ vende tilbake. - Inkuber for 60 min på 37 ° C i et vannbad under mild risting (60 sykluser/min).
- Filtrere resulterende suspensjon med filtere 200 µM og samle prøven i en ny 50 mL sentrifuge tube. Legge til 7 mL PBS på filteret å rense filteret og få alle cellene.
- Sentrifuge prøven 280 x g i 5 min på 4 ° C.
- Fjerne flytende adipocyte brøkdel av pipettering. Cellen pellets er sendinger.
Merk: Fjern adipocyte brøken for å få sendinger. Unngå submerging hele tipset i prøven fordi fjernes bare PBS og ikke de flytende adipocytter. - Resuspend sendinger i 5 mL av PBS fjerne collagenase, filtrere suspensjon med en 70 µM filter, skyll filteret med 5 mL PBS og sentrifuge prøven 280 x g i 5 min på 4 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend pellet i 3 mL av røde blodlegemer lyseringsbuffer.
- Inkuber i 5 min på is. Legge til 7 mL av PBS etter inkubasjon.
- Sentrifuge prøven 280 x g i 5 min på 4 ° C.
3. farging sendinger for flyt cytometri analyse
- Oppløse celle pellet i 90 µL 4 ° C FACS bufferen og legge 10 µL av 1 mg/mL menneskelige IgG blokk. Del cellen suspensjon i 2 wells av en 96 v-form godt plate. Plasser platen på is og la menneskelige IgG blokken ruge i 15 min.
- Legg 100 µL FACS buffer til hver prøve å vaske og sentrifuge platen i 5 min med 280 x g på 4 ° C. Fjerne nedbryting av tipping platen opp ned i en jevn bevegelse uten å trykke på platen.
Merk: Sørg for å fjerne gjenværende væske fra toppen av platen med en vev mens holde platen opp ned. - Forberede antistoff cocktailer for macrophage og DC delsett (FACS panel 1) og T - og B-celle undergrupper (FACS panel 2) som beskrevet i tabell 1 og tabell 2. Volumene beskrevet i tabell 1 og tabell 2 velges etter optimalisere antistoff konsentrasjonen og er nok for en mva eller sAT eksempler.
Merk: I FACS panelet 1 bruke markørene CD303 og CD141 for å bekrefte at CD11C+ CD11Blav celler er DCs. Det anbefales imidlertid å utelukke disse markørene fra panelet for å inkludere en live/døde flekker. Begge FACS panelet 1 og 2 kan kombineres med LIVE/DEAD Fixable Red Dead celle flekken Kit levedyktigheten flekker når unntatt CD303 i panelet 1 som PE kanalen vil være ubrukt. Utføre levedyktighet flekker i henhold til produsentens instruksjoner. - Resuspend pellets i 29,5 µL antistoff cocktail FACS panel 1 og 23 µL antistoff cocktail FACS panel 2. Inkuber i 30 min i mørket på is.
- Tilsett 150 µL FACS buffer hver brønn og resuspend celle pellet å utføre andre vask trinnet. Sentrifuge platen i 5 min på 280 x g og 4 ° C. Fjerne nedbryting av tipping platen opp ned.
- Tilsett 150 µL 1% formaldehyd løsning hver brønn å fikse cellene. Overføre celle suspensjon fra hver brønn til tilsvarende FACS røret ved pipettering med en P200 pipette. Lagre FACS rør på 4 ° C i mørke opp til 7 dager.
Merk: Direkte måling er også mulig. Tilsett 150 µL FACS buffer hver brønn i stedet for 1% formaldehyd, overføre cellene ved pipettering med en P200 pipette til tilsvarende FACS rør og analysere cellene.
FORSIKTIG: Formaldehyd er svært giftig. Forberede formaldehyd løsninger mens du arbeider i avtrekksvifte å unngå innånding og bruke hansker og vernebriller for beskyttelse.
4. flyt cytometri analyse
- Før første målingen, bruk en unstained kvinne negativ kontroll angi frem xy (FSC) og siden xy (SSC). Justere spenninger til flyt cytometer i henhold til instruksjonene fra produsenten slik at alle bestander av interesse vises i grafen FSC og SSC og et skille mellom rusk og levende celler kan gjøres.
- Utføre multi-farge kompensasjon analyse med antistoff fange perler etter produsentens protokoll.
- Forberede fluorescens minus én (FMO) kontroller ved å gjøre antistoff mix men en antistoffer hindre mix. Gjør dette for hver antistoff, opprette 8 antistoff mikser FACS panel 1 og 6 antistoff mikser FACS panel 2. Disse FMO antistoff blander brukes stain sendinger som beskrevet tidligere i denne protokollen.
- Måle alle FMO kontroller og angi gating strategien ifra FMO kontroller. Bruk kontrollene for FMO for å oppdage mulig auto-fluorescens cellene.
Merk: Ved å fjerne én antistoff fra mix, alle fluorescens nivå i denne kanalen er et bakgrunn/autofluorescent signal. Derfor, ved å sammenligne de forskjellige FMO kontrollere FACS resultater, gates kan trekkes på bestemte populasjoner sikrer at gatings er basert på positive celler og ikke basert på auto-fluorescens. - Virvelen av FACS rør på 800 rpm før du plasserer dem i flyt-cytometer og starter målingen.
Merk: Minst 50.000 hendelser i live porten anbefales å sikre nok celler måles fra hver subpopulation.
Representative Results
Sendinger isolert fra mva og satt ble målt ved hjelp av flowcytometri. Flow cytometri målinger generere tomter viser ulike celle populasjoner basert på cellular markører (figur 1A og 1B). Først ved å plotte Videresend scatter bredde (FSC-W) og videresende xy (FSC-A), celleområder aggregater kan elimineres fra videre analyse av gating enkelt cellene som lav FSC-W. Neste, levende celler er merket og mobilnettet rusk er utelukket av gating cellene i riktig størrelsen og kompleksiteten ved hjelp av FSC-A og siden scatter området (SSC-A), henholdsvis. Døde celler er små og derfor synlig som en distinkt befolkningen med en liten FSC-A. Neste, immunsystemet cellene ble valgt ved bruk av pan-leukocytter markøren CD45 (Panel 1 og 2, figur 1A). Analysere makrofager, andre immunceller som T-celler (CD3), B-celler (CD19), nøytrofile (CD66b+ CD11b+), og NK-cellene (CD56) ble ekskludert fra videre analyse ved hjelp av forskjellige antistoffer rettet mot disse cellene, men med samme fluorochrome. Enda en inndeling av gjenværende cellene var basert på CD11b og CD11c. Dette resulterte i blir følgende befolkningsgrupper: CD11b+ CD11c+ makrofager, CD11b+ CD11c- makrofager og CD11blav /- CD11c+ DCs (FACS panel 1, figur 1B). Måling av mener fluorescens intensitet (MFI) tillatt kvantifisering av uttrykk for CD303 (presenterer antigener DC markør) og CD141 (DC markør), på CD11b+ CD11c+ makrofager og CD11blav /- CD11c+ DCs. Uttrykk for begge disse markørene var høyere i CD11blav /- CD11c+ celler bekrefter at CD11blav /- CD11c+ celler var DCs (figur 1 c).
CD45+ celler (figur 1A) ble delt inn i T-celler og B-celler med CD3 og CD19, henholdsvis. T-cellene var delt inn i T-hjelper celler (CD4+) og cytotoksiske T-celler (CD8+). Til slutt, CD3-CD19-celler var plottet å kvantifisere NK-cellene ved å bruke markøren CD56 (FACS panel 2, figur 1 d). Antall celler i hver gate er kvantifisert og kan brukes til å beregne prosentdelen av denne cellen alle levende celler (tabell 3).
Prosentandelen av levende celler kan beregnes for hvert emne slik at beregningen av gjennomsnittet av alle fag i en gruppe for eksempel mager eller fete menn vise overflod av en bestemt immun celle, dvsden pro-inflammatoriske CD11b+ CD11c+ macrophage i visceral AT (figur 2).
Figur 1. FACS gating strategi visceral fettvev. (A) FACS handlingen i alle hendelser (svart) med fremover scatter bredde intensitet (FSC-W) og videresende scatter området intensitet (FSC-A) som inneholder en gate for å velge bare én celler (rød) etterfulgt av FACS basert på FSC-A og side scatter området intensitet (SSC-A) inneholder en gate velge lever celler (lys grønn). Neste tegn med SSC-A og CD45 fluorescens intensitet inneholder en gate velge alle CD45+ (immun) celler (blå). (B) FACS plott CD19, CD3, CD66b og CD56 fluorescens intensitetsnivåer versus CD11b fluorescens intensitet, og en gate å merke alle cellene som er CD19, CD3, CD66b og CD56 negative (brun) for ytterligere inndeling i populasjoner. Enda en inndeling i neste plottet basert på CD11b og CD11c fluorescens intensitet. Gates vises som inneholder CD11b+ CD11c+ makrofager (mørk grønn), CD11b+ CD11c- makrofager (lilla) og CD11blav /- CD11c+ dendrittiske celler (blå). (C) beløpet av CD11b+, CD11c+, eller CD11blav /- CD11c+ celler (y-aksen) viser tilgangsnivåene fluorescens intensitet (x-aksen) for CD303 og CD141, og den tilsvarende kvantifiseringen av gjennomsnittet fluorescens intensitet (MFI). (D) FACS handlingen viser den forrige CD45+ befolkningen (blå) basert på CD3 og CD19 fluorescens intensitet som inneholder porter velger T-celler (rosa), B-celler (mørk grønn) og ikke-autofluorescent celler (grønn) negativ for begge CD3 og CD19. Følgende tomten er basert på CD4 og CD8 fluorescens med gates velge CD4+ (lys grønn) og CD8+ (rosa) T-celler. En identisk gating strategi brukes for subcutaneous fettvev. En identisk gating strategi brukes for subcutaneous fettvev. Dette tallet har blitt endret fra historie forteller... et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Overvektige mva inneholder mer pro-inflammatoriske makrofager. Hvor mye CD11b+ CD11c+ makrofager som prosent av alle levende celler i tønne med mager og overvektige mennesker. Alle data er betyr ± SEM; n = 20 for mager og n = 31 for overvektige. p ≤ 0,01 vs lene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mål | Definisjon mål | Presentere på | Fluorochrome | Antall | Klone |
| CD11B | myeloid integrin markør | granulocytter, monocytter/makrofager, dendrittiske cellerlav og naturlige drepe celler | BV421 | 2,5 ΜL | ICRF44 |
| CD19 | vanlige B celle antigen | B celle utvikling fra pro-B celle blastoid B-cellen og B plasmacelle | Fitc | 3 ΜL | HIB19 |
| CD3 | vanlige T celle antigen | T-lymfocytter, naturlig killer T celler og thymocytes | Fitc | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD66B | medlem av carcinoembryonic antigen (CEA)-som glykoprotein familie | granulocytter | Fitc | 5 ΜL | G10F5 |
| CD56 | tungt glycosylated vedheft protein | naturlige drepe celler og naturlig killer T celler | Fitc | 5 ΜL | B159 |
| CD303 | type II transmembrane glykoprotein | presenterer antigener dendrittiske celler | PE | 1 ΜL | 201A |
| CD141 | thrombomodulin | monocytter/makrofagerlav, subpopulasjon av dendrittiske celler | APC | 1 ΜL | M80 |
| CD11C | type I-transmembrane glykoprotein; integrin αx | monocytter/makrofager, dendrittiske celler, granulocytter, naturlige drepe celler, gruppe B og T celler | APC-Cy7 | 0,5 ΜL | Bu15 |
| CD45 | vanlige leukocytter antigen | alle menneskelige leukocytter inkludert lymfocytter, monocytter, granulocytter, eosinofile og thymocytes | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| FACS buffer | - | - | - | 7.5 µl | - |
Tabell 1. Antistoff cocktailparty for FACS panel 1 å identifisere macrophage delsett og dendrittiske celler populasjoner. Antistoff beskrevet er for analyse av ett utvalg.
| Mål | Definisjon mål | Presentere på | Fluorochrome | Antall | Klone |
| CD19 | vanlige B celle antigen | B celle utvikling fra pro-B celle blastoid B-cellen og B plasmacelle | BV421 | 1 ΜL | HIB19 |
| CD3 | vanlige T celle antigen | T-lymfocytter, naturlig killer T celler og thymocytes | V500 | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD56 | tungt glycosylated vedheft protein | naturlige drepe celler og naturlig killer T celler | APC | 5 ΜL | HCD56 |
| CD4 | IG superfamily, skriver jeg transmembrane glykoprotein | T hjelper celle, thymocytes, monocytter/makrofager, type II naturlig killer T celler | PerCP-Cy5.5 | 1 ΜL | RPA-T4 |
| CD8 | Α-delenhet i en disulfide knyttet resultatet av dette komplekset | cytotoxic T-celler, thymocytes, delsett av naturlige drepe celler | APC-H7 | 2 ΜL | SK1 |
| CD45 | vanlige leukocytter antigen | alle menneskelige leukocytter inkludert lymfocytter, monocytter, granulocytter, eosinofile og thymocytes | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| FACS buffer | - | - | - | 10 µl | - |
Tabell 2. Antistoff cocktailparty for FACS panelet 2til å identifisere T - og B-celle populasjoner. Antistoff beskrevet er for analyse av ett utvalg.
| Macrophage panelet | ||
| Gate navn | # Celler | % av live |
| Enkeltceller | 183054 | |
| Live | 10477 | 100 |
| CD45 | 4100 | 39.13 |
| dump- | 771 | 7,36 |
| CD11C- CD11B+ | 430 | 4.1 |
| CD11C+ CD11B+ | 104 | 0.99 |
| CD11C+ CD11Blav /- | 15 | 0.14 |
| T-celle, B-celle, NK-celle panel | ||
| Gate navn | #Cells | % av live |
| Enkeltceller | 34616 | |
| Live | 3728 | 100 |
| CD45+ | 1589 | 42.62 |
| NK-cellene | 29 | 0.78 |
| CD3+ | 953 | 25.56 |
| CD4+ | 601 | 16.12 |
| CD8+ | 328 | 8.8 |
| CD19+ | 20 | 0.54 |
Tabell 3. Immun celle overflod av ulike celletyper i mva. Antall celler i hver gate og andelen av de forskjellige celletyper basert på den totale mengden levende celler.
Discussion
Disse metodene beskriver hvordan å isolere sendinger fra mva og satt og kvantifisere de relative mengdene av immunceller i disse vev. Videre staten metodene fastslå uttrykk for markører på spesifikke celletyper.
Flowcytometri av vev immunceller er en kraftfull teknikk fenotypen tissues immunologiske staten. Kvantifisering av vev immunceller kan ha mange programmer. Som beskrevet i resultatene, er det mulig å sammenligne tilstedeværelse av bestemte immunceller mellom grupper av pasienter (f.eksmager vs overvektige). I tillegg av også utfører flowcytometri på blod av samme pasienter, kan tilknytninger mellom sirkulerende celler og vev celler undersøkes. Med dette programmet kunne vi fastslå at et bestemt delsett av sirkulerende monocytter er forbundet med pro-inflammatoriske CD11C+ fettvev makrofager16.
Justeringer av beskrevet protokollen vil utvide sine programmer som mange tilgjengelige fluorescerende antistoffer gjør flowcytometri meget allsidig. Nesten alle celletyper kan skilles med forskjellige antistoffer og uttrykk for mange indikatorer kan oppdages. Det er mulig å flekken markører intracellulært av permeabilizing cellemembranen å tillate intracellulær binding av fluorescerende antistoffer. Disse egenskapene kan skille mellom de svært mangfoldig macrophage utover altfor forenklet M1 og M2 macrophage subtyper. Foruten måling av overflaten markør uttrykk, kan proteiner (dvs., cytokiner) være farget intracellulært gir informasjon om macrophage funksjonalitet. I tillegg er spredning markører som Ki67 brukt om å kvantifisere spredning priser. Som beskrevet, var skille mellom makrofager og DCs basert på MFI nivåer av DC markører. En generell macrophage markør, som CD68 kan bli innlemmet i macrophage panelet (FACS panel 1). Men trenger CD68 å bli farget intracellulært krever permeabilization i cellemembranen som er ikke å foretrekke, og ville utvide protokollen. Andre macrophage markører er delsett markører som CD163 og CD206 eller CD11c, det sistnevnte blir integrert i macrophage-panelet som presenteres her.
Våre FACS paneler, merketråd å skille mellom levende og døde celler var ikke inkludert, som ville være å foretrekke fordi det gir en mer nøyaktig utelukkelse av døde celler enn bruk av FSC og SSC. Brukte er DNA flekker levedyktighet fargestoffer propidium iodide (PI) eller 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) samt gratis Amin reagerer fargestoffer som LIVE/DEAD Fixable døde celle flekken Kit, som er tilgjengelig i forskjellig farge farger. Imidlertid PI og DAPI kan ikke brukes når bestemmer cellene. Som beskrevet i protokollen, kan den LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell levedyktighet flekker integreres i både panelene uten å påvirke den generelle FACS gating strategi.
I tillegg er dataene uttrykt i prosent av levende celler betyr at alle data er relativ. Bare ved å angi en nøyaktig, ville kjent antall celler i flyt cytometer, det være mulig å fastslå den nøyaktige tall av hver celle. En omtrentlig antall celler kan beregnes etter teller cellene i sendinger fraksjonen ved å bruke en telling kammer. Dette nummeret må justeres for biopsi vev brukes til å isolere sendinger, men dette har begrensninger når man sammenligner magert å overvektige på. En lignende masse overvektige på består av mindre adipocytter som de er fylt med lipider og har utvidet betydelig. Dette kan føre til en undervurdering av immun celle nummer hvis presentert som antall immunceller per gram på eller per adipocyte.
I menneskelige studier gjøres inkludering av pasienter vanligvis over lengre tid på å lage standardisering av eksperimentelle prosedyrer av stor betydning. For sammenligning med flow cytometri data mellom pasienter finnes det flere alternativer. Som beskrevet i denne protokollen, kan cellene løses før måling slik at analyse av flere prøver på samme dag. Dette kan også oppnås ved å fryse sendinger før flekker dem, som tillater flekker prosedyren for å være likt mellom alle prøver, men levedyktigheten til cellene kan bli påvirket. Til slutt, også ansatt i denne studien, er fluorescerende perler å installere kompensasjonsnivåer og cytometer sporing perler ble brukt behandlinger for å standardisere daglige målinger av cytometer. Dette siste alternativet er det mest effektivt når måle prøver fra en studie som spenner over en lang periode.
En begrensende faktor for flowcytometri er generelt bruk av fluorescens. Antall fluorescerende etiketter som kan oppdages samtidig er begrenset på grunn av overlapping i utslipp spectra. Men med smart FACS panelet utvikling og bruk av flere antistoff cocktailer per mva eller satt eksempel, kan problemet overvinnes som beskrevet i denne protokollen. En viktig del av FACS panelet utvikling er FMO kontrollene. Ved alle antistoffer i panelet med unntak av en kan potensiell autofluorescence nivåer være verdsatt sammenlignet FMO med full panel. Dette gjør nøyaktig gating befolkninger, og disse prosedyrene skal utføres når du definerer en ny FACS panel. I tillegg kan nye generasjoner av FACS enheter gjenkjenne opptil 50 parametere tillater samtidig deteksjon av mange egenskaper per celle. Et annet problem relatert til fluorescens aspektet er autofluorescence av celler, spesielt makrofager. Etter magnetisering av cellene med FACS laser (hovedsakelig med 488 nm wavelength eksitasjon), disse cellene avgir et fluorescerende signal (hovedsakelig < 640 nm) at kan overlapping med utslipp spektra av antistoffer etiketter17,18. Kontoen for dette, bør unstained kvinne celler bli målt for å fastsette autofluorescence i hver enkelt kanal. Med denne kunnskapen, skal fluorochromes være merket som viser en signalstyrke som overstiger autofluorescent signalet. Autofluorescent bakgrunn signalet bør tas hensyn til ved fastsettelse gating strategi befolkningen. Derfor ved denne protokollen og intelligent FACS panel design er det mulig å i dybden fenotypen macrophage undertyper. Nye tydelig AT makrofager og deres funksjon kan være preget.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke J. van de Gaar og M. Vroomen (Universitetet i Maastricht, Nederland) for deres teknisk støtte. Dessuten, vi ønsker å takke K. Verboven, D. Hansen J. Jocken, og E. Blaak for å gi blod og vev biopsier brukes for denne protokollen og påfølgende eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
| Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
| Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
| NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
| 200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
| 70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
| Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
| Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
| CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
| CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
| CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
| CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
| CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
| CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
| CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
| CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
| CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
| CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
| CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
| FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
| 96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
| PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
| FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
| Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
| LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
| IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |
References
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines. ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).
- Han, J. M., Levings, M. K. Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation. J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).
- Koh, Y. J., et al. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).
- Peinado, J. R., et al. The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).
- Leggate, M., et al. Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males. Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).
- Divoux, A., et al. Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).
- Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue. Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).
- Wentworth, J. M., et al. Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity. Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).
- Wouters, K., et al. Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue. Sci Rep. 7, 42665 (2017).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).
- Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
