Summary
Questo articolo viene descritto un metodo per analizzare il contenuto delle cellule immuni del tessuto adiposo tramite isolamento delle cellule immuni dal tessuto adiposo e l'analisi successiva usando la citometria a flusso.
Abstract
Infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo sottocutaneo e viscerale (a) depositi conduce ad un'infiammazione che contribuiscono allo sviluppo di complicanze associate all'obesità come il diabete di tipo 2. Indagare quantitativamente e qualitativamente i sottoinsiemi delle cellule immuni in umani presso depositi, abbiamo sviluppato un approccio di citometria a flusso. La frazione vascolare stromal (SVF), contenente le cellule immuni, è isolata dal sottocutaneo e viscerale alle biopsie da digestione della collagenosi. Adipociti vengono rimossi dopo la centrifugazione. Le cellule SVF sono macchiato per più marcatori di membrana-limiti selezionati per differenziare tra sottoinsiemi delle cellule immuni e analizzati mediante citometria a flusso. Come risultato di questo approccio, pro - e anti - infiammatorie del macrofago sottoinsiemi, cellule dendritiche (DCs), B-cellule, CD4+ e CD8+ T-cellule, e le cellule NK possono essere rilevate e quantificate. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su cellule immunitarie in AT e la quantità di ogni sottoinsieme specifico. Poiché esistono numerosi anticorpi fluorescenti disponibili, il nostro approccio di citometria a flusso può essere regolato per misurare vari altri marcatori cellulari e intracellulari di interesse.
Introduction
L'obesità è caratterizzata con qualità inferiore AT infiammazione1 e infiltrazione di cellule immuni pro-infiammatorie sia viscerale e sottocutaneo a (IVA, sabato). Accumulazione delle cellule immuni pro-infiammatorie nel tino conduce all'insulino-resistenza, che è un fattore di rischio primario per lo sviluppo di tipo 2 il diabete2. Le cellule immuni del sistema immunitario innato e adattivo si trovano in AT obesi, come macrofagi, mastociti, neutrofili, CD4+ e CD8+ le cellule T e B-cellule3,4,5,6 ,7. Queste cellule immuni, insieme con le cellule endoteliali, cellule stromali, progenitori degli adipociti, fibroblasti e periciti, costituiscono la SVF8 e sono la principale fonte di sostanze pro-infiammatorie nel AT9.
Lo stato infiammatorio di AT è comunemente studiato mediante tecniche di Western blot10, qPCR11e immunohistochemistry11. Tuttavia, quando si utilizzano queste tecniche, l'intero AT, adipociti e SVF, viene utilizzato. Questo rende difficile determinare l'importo e sottoinsiemi di cellule immunitarie presenti nell'AT. Cellule del sistema immunitario hanno vari indicatori delle cellule per definire e categorizzare loro, quali i macrofagi. I macrofagi mostrano eterogeneità significativa sia in funzione e in cella di espressione di superficie dell'indicatore12. Pertanto, essi sono spesso classificati nelle due popolazioni di macrofagi: M1 e M2. I macrofagi m2 sono di solito chiamati macrofagi attivati in alternativa12,13 e risiedono nell'AT di magra, metabolicamente normali esseri umani14. Tuttavia, durante l'obesità, un interruttore fenotipico si verifica dai macrofagi M2 ai macrofagi M1. Questi classicamente attivati M1 macrofagi express CD11C12 e si accumulano nei dintorni di adipociti morti per formare strutture simili a corona13. È stato dimostrato che CD11C+ macrofagi in AT compromettere l'azione dell'insulina e sono associati con insulino-resistenza in esseri umani obesi15. Per identificare i macrofagi M1 e M2 in AT, immunohistochemistry è un'opzione. Questa tecnica dà informazioni sulla posizione dei macrofagi nel tessuto. Tuttavia, essa limiterà il numero di marcatori che possono essere utilizzati in una colorazione. Inoltre, è anche difficile da quantificare. Pertanto, per studiare i sottoinsiemi delle cellule immuni differenti nella IVA e depositi sAT, abbiamo sviluppato un approccio di citometria a flusso. Questo approccio ci dà l'opportunità di utilizzare più marcatori per cella con analisi di citometria a uno flusso per definire sottoinsiemi di cellule e contare i numeri di ogni sottoinsieme presenti nei depositi di AT.
Protocol
Viscerale e sottocutaneo a campioni sono stati prelevati da soggetti arruolati nello studio approvato dal comitato etico medico Jessa Hospital, Hasselt e Università di Hasselt, in Belgio, in conformità con la dichiarazione di Helsinki.
1. preparazione dei reagenti
- Soluzione della collagenosi
- Sciogliere 1 g di collagenasi io in 10 mL di fosfato tampone salino (PBS, senza calcio e magnesio) per rendere una soluzione stock di 100 mg/mL. Aliquote di 200 µ l di preparare e conservare a-20 ° C.
- Sciogliere 1 g di collagenasi XI in 10 mL di PBS per ottenere una soluzione stock di 100 mg/mL. Aliquote di 200 µ l di preparare e conservare a-20 ° C.
- Sciogliere 10 mg di dnasi I in 10 mL di PBS per ottenere una soluzione stock di 10 mg/mL. Aliquote di 180 µ l di preparare e conservare a-20 ° C.
- Aggiungere 100 µ l collagenosi I (100 mg/mL), 100 µ l collagenosi XI (100 mg/mL) e 90 µ l dnasi I (10 mg/mL) a 10 mL di F12 di DMEM prosciutto. Soluzione della collagenosi. rendere fresca per ogni isolamento.
- Buffer di lisi degli eritrociti
- Sciogliere g 0,84 NH4Cl in 100 mL di acqua ultrapura.
- Impostare il pH 7,4 prima dell'uso. Conservare in un fiasco di vetro a 4 ° C.
- Mettere il tampone di lisi degli eritrociti sul ghiaccio prima dell'uso.
- Buffer di FACS
- Sciogliere 0,5 g di sieroalbumina bovina (BSA) in 100 mL di PBS per ottenere 0,5% BSA PBS.
- Sciogliere 65 mg di NaN3 in 100 mL di 0.5% BSA PBS per ottenere 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Conservare la soluzione in un matraccio di vetro a 4 ° C.
- Buffer di FACS posto sul ghiaccio prima dell'uso.
Attenzione: NaN3 è altamente tossico. Lavorare in una cappa aspirante e indossare occhiali protettivi e guanti di protezione durante la manipolazione di NaN3.
- Blocco di IgG umana
- Sciogliere 10 mg di IgG umane in 10 mL di PBS per ottenere 1 mg/mL. Aliquote di 100 µ l di preparare e conservare a-20 ° C.
- Posizionare il blocco di IgG umano sul ghiaccio prima dell'uso.
2. isolamento di SVF da AT
- Tagliare 1 g di alla biopsia in piccoli pezzi (± 2 mm2) con un bisturi e il trasferimento di una provetta da centrifuga da 50 mL (ad es., tubo Falcon). Aggiungere 10 mL di soluzione della collagenosi a ciascun campione.
Nota: Chiudere il coperchio del tubo completamente e ruotare il coperchio di ¼ di giro indietro. - Incubare per 60 min a 37 ° C in un bagno di acqua sotto agitazione delicata (60 cicli/min).
- Filtrare la sospensione risultante con un filtro 200 µM e raccogliere il campione in una provetta da centrifuga da 50 mL nuovo. Aggiungere 7 mL di PBS sulla parte superiore del filtro per sciacquare il filtro e ottenere tutte le celle.
- Centrifugare il campione a 280 x g per 5 min a 4 ° C.
- Rimuovere la frazione del adipocyte galleggiante di pipettaggio. Il pellet cellulare è la SVF.
Nota: Rimuovere la frazione degli adipociti per ottenere SVF. Evitate di immergere la punta intera nel campione perché questo rimuoverà solo il PBS e non gli adipociti galleggianti. - Risospendere il SVF in 5 mL di PBS per rimuovere collagenosi, filtrare la sospensione con un filtro di 70 µM, risciacquare il filtro con 5 mL di PBS e centrifugare il campione a 280 x g per 5 min a 4 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 3 mL di tampone di lisi degli eritrociti.
- Incubare per 5 minuti sul ghiaccio. Aggiungere 7 mL di PBS dopo incubazione.
- Centrifugare il campione a 280 x g per 5 min a 4 ° C.
3. colorazione di SVF per analisi di citometria a flusso
- Sciogliere il pellet cellulare in 90 µ l tampone di FACS 4 ° C e aggiungere 10 µ l di blocco di IgG umana 1 mg/mL. Dividere la sospensione cellulare in 2 pozzetti di una piastra di ben 96 v-forma. Collocare la piastra sul ghiaccio e lasciare che il blocco di IgG umano Incubare per 15 min.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di FACS per ciascun campione per lavare e centrifugare la piastra per 5 min con 280 x g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante inclinando la piastra capovolta con un movimento rapido senza toccare la piastra.
Nota: Assicurarsi di rimuovere qualsiasi residuo liquido dalla parte superiore della piastra con un fazzoletto mentre tenendo la piastra capovolta. - Preparare cocktail di anticorpi per sottoinsiemi di DC (pannello di FACS 1) e del macrofago e per sottoinsiemi di cellule T e B (pannello di FACS 2) come descritto nella tabella 1 e tabella 2. I volumi descritti nella tabella 1 e tabella 2 sono selezionati dopo l'ottimizzazione le concentrazioni di anticorpi e sono sufficienti per una IVA o sAT campione.
Nota: Nel pannello di FACS 1, utilizzare i marcatori CD303 e CD141 per confermare quella CD11C+ CD11Bbasso cellule sono controller di dominio. Tuttavia, si consiglia di escludere questi indicatori da pannello per includere una colorazione live/dead. Entrambi pannello di FACS 1 e 2 può essere abbinato l'attuabilità LIVE/DEAD risolvibile Red Dead Cell Stain Kit colorazione quando escluse CD303 nel pannello 1 come il canale PE sarà inutilizzata. Eseguire vitalità colorazione secondo le istruzioni del produttore. - Risospendere il pellet in 29,5 anticorpo µ l cocktail per pannello di FACS 1 e 23 µ l anticorpo cocktail per pannello di FACS 2. Incubare per 30 min al buio sul ghiaccio.
- Aggiungere 150 µ l di tampone di FACS in ciascun pozzetto e risospendere il pellet cellulare per eseguire una seconda fase di lavaggio. Centrifugare la piastra per 5 min a 280 x g e a 4 ° C. Rimuovere il surnatante inclinando la piastra capovolta.
- Aggiungere 150 µ l 1% formaldeide soluzione in ogni pozzetto per fissare le cellule. Trasferire la sospensione cellulare da ogni pozzetto nella provetta di FACS corrispondente di pipettaggio con una pipetta P200. Conservare FACS tubi a 4 ° C in scuro fino a 7 giorni.
Nota: Misurazione diretta è anche possibile. Aggiungere 150 µ l di tampone di FACS in ciascun pozzetto invece di 1% di formaldeide, trasferire le cellule pipettando con una pipetta P200 per provette corrispondenti FACS e analizzare le cellule.
Attenzione: La formaldeide è molto tossica. Preparare soluzioni di formaldeide mentre si lavora in una cappa aspirante per evitare l'inalazione e indossare guanti e occhiali di sicurezza per la protezione.
4. analisi di citometria a flusso di
- Prima della prima misurazione, è necessario utilizzare un controllo negativo non macchia per impostare il forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). Regolare le tensioni del citofluorimetro secondo le istruzioni del produttore in modo che tutte le popolazioni di interesse sono visibili nel grafico FSC e SSC e può essere fatta una distinzione tra detriti e cellule vive.
- Esegue analisi di compensazione multi-colore con perline di cattura dell'anticorpo seguendo il protocollo del produttore.
- Preparare la fluorescenza meno uno controlli (FMO) facendo il mix di anticorpo ma escludere un anticorpo dal mix. Eseguire questa operazione per ogni anticorpo, creazione di 8 anticorpo miscele per pannello di FACS 1 e 6 anticorpo miscele per pannello di FACS 2. Queste miscele di anticorpo FMO vengono utilizzate per macchiare SVF come descritto in precedenza in questo protocollo.
- Misurare tutti i controlli di FMO e impostare la strategia di gating basata su controlli FMO. Utilizzare i controlli FMO per rilevare possibile auto-fluorescenza delle cellule.
Nota: Rimuovendo un anticorpo dal mix, qualsiasi livello di fluorescenza rilevata in questo canale è un segnale di sfondo/autofluorescent. Quindi, confrontando le diversa FMO FACS risultati di controllo, gates può essere disegnato su specifiche popolazioni assicurando che il gatings sono basati su cellule positive e non si basa sull'auto-fluorescenza. - Tubi di vortice delle CPE a 800 rpm prima di metterli nel citometro a flusso e avviare la misurazione.
Nota: Un minimo di 50.000 eventi nel cancello dal vivo è consigliabile per garantire che abbastanza cellule sono misurati da ciascuna sottopopolazione.
Representative Results
La SVF isolata dall'IVA e Sab è stata misurata mediante citometria a flusso. Misure di flusso cytometry generano trame mostrando diverse popolazioni cellulari basate su indicatori cellulari (Figura 1A e 1B). In primo luogo, tracciando il forward scatter larghezza (FSC-W) e inoltrare delle cellule (FSC-A), zona di dispersione aggregati possono essere eliminati da un'ulteriore analisi con gating le singole celle come basso FSC-W. Prossime, vivere delle celle selezionate, e detriti cellulari sono escluso di gating le cellule della corretta dimensione e complessità utilizzando FSC-lato A e il dispersione di zona (SSC-A), rispettivamente. Le cellule morte sono piccole e pertanto visibile come una popolazione distinta con un piccolo FSC-A. Successivo le cellule immuni sono state selezionate da uso del marcatore pan-leucocita CD45 (pannello 1 e 2, Figura 1A). Per analizzare i macrofagi, cellule di altri immuni quali T-linfociti (CD3), B (CD19), neutrofili (CD66b+ CD11b+), e cellule NK (CD56) sono stati esclusi da ulteriori analisi utilizzando anticorpi distinti queste cellule di targeting, ma con lo stesso fluorocromo. Ulteriore suddivisione delle cellule restanti era basata sull'espressione di CD11b e CD11c. Ciò ha provocato le seguenti popolazioni: CD11b+ CD11c+ macrofagi, CD11b+ CD11c– macrofagi e CD11bbasso /- CD11c+ DCs (FACS pannello 1, Figura 1B). Permettere la misura dell'intensità media di fluorescenza (MFI) la quantificazione dell'espressione di CD303 (indicatore del plasmacytoid DC) e CD141 (marcatore DC), il CD11b+ CD11c+ macrofagi e CD11bbasso /- CD11c+ DCs. Espressione di entrambi questi indicatori erano più alti in CD11bbasso /- CD11c+ cellule confermando che CD11bbasso /- CD11c+ cellule erano DCs (Figura 1).
Il CD45+ cellule (Figura 1A) sono stati divisi in linfociti T e B-cellule utilizzando CD3 e CD19, rispettivamente. Le cellule T sono stati suddivisi in linfociti T helper (CD4+) e linfociti T citotossici (CD8+). Infine, CD3–CD19–le celle sono state tracciate per quantificare le cellule NK, utilizzando l'indicatore CD56 (FACS pannello 2, Figura 1). Il numero di celle in ogni cancello viene quantificato e può essere utilizzato per calcolare la percentuale di questo tipo di cella di tutte le cellule viventi (tabella 3).
La percentuale di cellule viventi può essere calcolata per ogni soggetto che consente il calcolo di una media di tutti i soggetti in un gruppo di ad esempio uomini magri o obesi visualizzati l'abbondanza di una specifico delle cellule immuni, vale a dire, il pro-infiammatorie CD11b+ CD11c+ macrofago in AT viscerale (Figura 2).
Figura 1. FACS gating strategia del tessuto adiposo viscerale. (A), FACS trama di tutti gli eventi (nero) con forward scatter larghezza intensità (FSC-W) e l'intensità di zona di forward scatter (FSC-A) contenente un cancello per selezionare solo singole celle (rosso) seguite da una trama di FACS basato sull'intensità di dispersione laterale e FSC-A zona (SSC-A) contenente un cancello selezionando cellule vive (verde chiaro). Successiva stampa con SSC-A e l'intensità di fluorescenza CD45 contiene un cancello selezionando tutti CD45+ (immunitario) cellule (blu). (B), FACS trama di CD19, CD3, CD66b e CD56 intensità di fluorescenza contro l'intensità di fluorescenza CD11b e un cancello di selezionare tutte le celle che sono CD19, CD3, CD66b e CD56 negativo (marrone) per ulteriore divisione in popolazioni. Ulteriore suddivisione nella prossima trama basata su CD11b e CD11c intensità di fluorescenza. Porte sono visualizzate contenente CD11b+ CD11c+ macrofagi (verde scuro), CD11b+ CD11c macrofagi– (viola) e CD11bbasso /- CD11c+ le cellule dendritiche (blu). (C) quantità di CD11b+, CD11c+, o CD11bbasso /- CD11c+ cellule (asse y) visualizzati i loro livelli di intensità di fluorescenza (asse x) per CD303 e CD141 e la corrispondente quantificazione della media intensità di fluorescenza (MFI). (D), FACS trama visualizzati il CD45 precedente+ popolazione (blu) basato sull'intensità di fluorescenza CD3 e CD19 contenente cancelli selezione T-cellule (magenta), B-cellule (verde scuro) e le cellule non-autofluorescent (verde) negative per entrambi CD3 e CD19. La seguente trama è basata sulla fluorescenza CD4 e CD8 con cancelli selezionando CD4+ (verde chiaro) e CD8+ (magenta) T-cellule. Una strategia di gating identica è usata per il tessuto adiposo sottocutaneo. Una strategia di gating identica è usata per il tessuto adiposo sottocutaneo. Questa figura è stata modificata da Wouters et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Obeso IVA contiene più macrofagi pro-infiammatorie. La quantità di CD11b+ CD11c+ macrofagi presentati come percentuale di tutte le cellule viventi in IVA degli uomini magri ed obesi. Tutti i dati sono mezzi ± SEM; n = 20 per lean e n = 31 per obesi. p ≤ 0,01 vs lean. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Destinazione | Destinazione di definizione | Presenti sul | Fluorocromo | Quantità | Clone |
| CD11B | marcatore di integrina mieloide | granulociti, monociti/macrofagi, cellule dendritichebasso e cellule natural killer | BV421 | 2,5 Μ l | ICRF44 |
| CD19 | comuni dell'antigene delle cellule di B | Sviluppo delle cellule b da cellula pro-B delle cellule di B del blastoid e delle cellule di B del plasma | FITC | 3 Μ l | HIB19 |
| CD3 | comuni dell'antigene delle cellule T | I linfociti T, cellule T naturali dell'assassino e timociti | FITC | 3 Μ l | UCHT1 |
| CD66B | membro dell'antigene carcinoembryonic (CEA)-come glicoproteina famiglia | granulociti | FITC | 5 Μ l | G10F5 |
| CD56 | proteina di adesione pesantemente glicosilata | le cellule natural killer e cellule T naturali dell'assassino | FITC | 5 Μ l | B159 |
| CD303 | tipo di glicoproteina transmembrana II | cellule dendritiche plasmacitoidi | PE | 1 Μ l | 201A |
| CD141 | trombomodulina | monociti/macrofagibasso, sottopopolazione di cellule dendritiche | APC | 1 Μ l | M80 |
| CD11C | tipo I glicoproteina transmembrana; integrina αx | monociti/macrofagi, cellule dendritiche, granulociti, cellule natural killer, subset di cellule T e B | APC-Cy7 | 0,5 Μ l | Bu15 |
| CD45 | antigene comune del leucocita | tutti i leucociti umani tra cui linfociti, monociti, granulociti, eosinofili e timociti | PE-Cy7 | 1 Μ l | HI30 |
| Buffer di FACS | - | - | - | 7.5 µ l | - |
Tabella 1. Cocktail per l'anticorpo FACS panel 1 per identificare sottogruppi di macrofago e popolazioni di cellule dendritiche. Quantità di anticorpo descritto è per l'analisi di un campione.
| Destinazione | Destinazione di definizione | Presenti sul | Fluorocromo | Quantità | Clone |
| CD19 | comuni dell'antigene delle cellule di B | Sviluppo delle cellule b da cellula pro-B delle cellule di B del blastoid e delle cellule di B del plasma | BV421 | 1 Μ l | HIB19 |
| CD3 | comuni dell'antigene delle cellule T | I linfociti T, cellule T naturali dell'assassino e timociti | V500 | 3 Μ l | UCHT1 |
| CD56 | proteina di adesione pesantemente glicosilata | le cellule natural killer e cellule T naturali dell'assassino | APC | 5 Μ l | HCD56 |
| CD4 | Superfamiglia Ig, glicoproteina transmembrana di tipo I | Cellule T helper, timociti, monociti/macrofagi, tipo cellule di II naturale killer T | PerCP-Cy 5.5 | 1 Μ l | RPA-T4 |
| CD8 | Α-unità secondaria di un complesso bimolecolare bisolfuro-collegati | cellule di T citotossiche, timociti, sottoinsieme delle cellule natural killer | APC-H7 | 2 Μ l | SK1 |
| CD45 | antigene comune del leucocita | tutti i leucociti umani tra cui linfociti, monociti, granulociti, eosinofili e timociti | PE-Cy7 | 1 Μ l | HI30 |
| Buffer di FACS | - | - | - | 10 µ l | - |
Tabella 2. Cocktail per l'anticorpo FACS Pannello 2per identificare popolazioni di cellule T e B. Quantità di anticorpo descritto è per l'analisi di un campione.
| Pannello di macrofago | ||
| Nome del cancello | # Le cellule | % di live |
| Cellule singole | 183054 | |
| Live | 10477 | 100 |
| CD45 | 4100 | 39,13 |
| discarica– | 771 | 7,36 |
| CD11C CD11B– + | 430 | 4.1 |
| CD11C+ CD11B+ | 104 | 0.99 |
| CD11C+ CD11Bbasso /- | 15 | 0,14 |
| Pannello di cellule T, cellule B, cellule NK | ||
| Nome del cancello | #Cells | % di live |
| Cellule singole | 34616 | |
| Live | 3728 | 100 |
| CD45+ | 1589 | 42.62 |
| Cellule NK | 29 | 0.78 |
| CD3+ | 953 | 25,56 |
| CD4+ | 601 | 16.12 |
| CD8+ | 328 | 8.8 |
| CD19+ | 20 | 0.54 |
Tabella 3. Abbondanza delle cellule immuni di tipi differenti delle cellule in IVA. Numero di celle in ogni gate e la percentuale dei tipi differenti delle cellule basato sull'importo totale delle cellule viventi.
Discussion
Questi metodi descrivono come isolare la SVF dall'IVA e seduti e quantificare la quantità relativa di cellule immuni all'interno di questi tessuti. Inoltre, i metodi di stato come determinare l'espressione di marcatori su tipi cellulari specifici.
Citometria a flusso delle cellule immuni del tessuto è una tecnica potente per fenotipo lo stato immunologico dei tessuti. La quantificazione delle cellule immuni del tessuto può avere molte applicazioni. Come descritto nei risultati, è possibile confrontare la presenza di cellule immuni specifiche tra gruppi di pazienti (ad es., magra vs obesi). Inoltre, eseguendo anche citometria a flusso su sangue degli stessi pazienti, associazioni tra linfociti circolanti e le cellule del tessuto possono essere studiate. Con questa applicazione, siamo stati in grado di determinare che uno specifico sottoinsieme di monociti circolanti è associato con pro-infiammatorie CD11C+ tessuto adiposo macrofagi16.
Adattamenti del protocollo descritto si espanderanno le sue applicazioni come numerosi anticorpi fluorescenti disponibili rendono molto versatile la citometria a flusso. Con anticorpi differenti si possono distinguere quasi tutti i tipi di cellule e l'espressione di molti marcatori possa essere rilevato. Inoltre, è possibile a macchiare marcatori intracellulare di permeabilizing la membrana cellulare per consentire l'associazione intracellulare degli anticorpi fluorescenti. Queste caratteristiche permettono una distinzione tra le popolazioni molto diverse del macrofago oltre i sottotipi di macrofago eccessivamente semplificati M1 e M2. Oltre alla misurazione dell'espressione di superficie dell'indicatore, proteine (cioè, citochine) possono essere macchiate intracellulare che fornisce informazioni sulla funzionalità del macrofago. Inoltre, gli indicatori di proliferazione come Ki67 vengono utilizzati per quantificare i tassi di proliferazione. Come descritto, distinzione tra macrofagi e DCs era basato su livelli MFI di marcatori di DC. Un indicatore del macrofago generali, come ad esempio CD68 può essere incorporato nel pannello del macrofago (FACS pannello 1). Tuttavia, CD68 deve essere macchiato intracellulare che richiede permeabilizzazione della membrana cellulare che non è preferibile e si estenderebbe il protocollo. Altri marcatori del macrofago sono indicatori di sottoinsieme quali CD163 e CD206 o CD11c, quest'ultimo integrato nel pannello del macrofago presentato qui.
Nei nostri pannelli FACS, un marcatore di distinguere cellule vivi e morte non è stato incluso, che sarebbe preferibile perché permette una più accurata esclusione di cellule morte che l'uso di FSC e SSC. Frequentemente utilizzati è il DNA macchiatura attuabilità coloranti propidio ioduro (PI) o 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) così come ammina libera reagendo coloranti come il LIVE/DEAD risolvibile Dead Cell Stain Kit, che è disponibile in colori diversi della tintura. Tuttavia, PI e DAPI non può essere utilizzato quando le cellule di fissaggio. Come descritto nel protocollo, la colorazione di attuabilità LIVE/DEAD risolvibile Red Dead Cell può essere integrata in entrambi i pannelli senza intaccare il FACS complessiva strategia di gating.
Inoltre, i dati sono espressi come percentuale di cellule vive, che significa che tutti i dati sono relativi. Solo inserendo un esatto, noto il numero di celle nel citometro a flusso, sarebbe possibile determinare i numeri esatti di ogni tipo di cellula. Un numero approssimativo delle cellule potrebbe essere calcolato dopo contando le cellule nella frazione SVF utilizzando una camera di conteggio. Tuttavia, questo numero deve essere regolata per la quantità di tessuto di biopsia utilizzato per isolare la SVF, ma questo ha limitazioni quando si confrontano le magra per obesi a. Una massa simile di obesi AT è costituito da meno adipociti come essi sono pieni di lipidi e hanno ampliato notevolmente. Questo potrebbe portare ad una sottovalutazione del numero delle cellule immuni se presentato come numero di cellule immuni per grammo di a o per adipociti.
Negli studi umani, l'inclusione dei pazienti è fatto solitamente per un periodo più lungo di tempo rendendo la standardizzazione delle procedure sperimentali di grande importanza. Per il confronto dei dati di cytometry di flusso tra pazienti, ci sono diverse opzioni. Come descritto in questo protocollo, le cellule possono essere fissate prima misurazione consentendo analisi di parecchi campioni nello stesso giorno. Ciò può anche essere ottenuto congelando il SVF prima che li macchia, che consente la procedura di colorazione essere uguale tra tutti i campioni, ma la vitalità delle cellule potrebbe essere influenzata. Infine, anche impiegato in questo studio, sono perline fluorescenti per installare i livelli retributivi e citometro rilevamento delle sfere sono stati utilizzati bi-settimanale per standardizzare le misurazioni giornaliere del citometro. Quest'ultima opzione è la più efficiente quando si misura campioni da uno studio che attraversa un lungo periodo di tempo.
Un fattore limitante per citometria a flusso è in generale l'uso della fluorescenza. Il numero di etichette fluorescenti che possono essere rilevati contemporaneamente è limitato a causa della sovrapposizione negli spettri di emissione. Tuttavia, con sviluppo di pannello smart FACS e l'uso di diversi cocktail di anticorpi per IVA o campione sAT, questo problema può essere superato, come descritto in questo protocollo. Un aspetto importante dello sviluppo del pannello di FACS è FMO controlli. Utilizzando tutti gli anticorpi del pannello ad eccezione di uno, potenziali livelli di autofluorescence possono essere apprezzati quando si confrontano il FMO con pannello completo. In questo modo accurato gating delle popolazioni e queste procedure devono essere eseguite quando si configura un nuovo pannello di FACS. Nuove generazioni di dispositivi FACS è inoltre in grado di rilevare fino a 50 parametri che permettono la rilevazione simultanea di molte caratteristiche per cella. Un altro problema correlato all'aspetto di fluorescenza è l'autofluorescenza delle cellule, in particolare i macrofagi. Dopo l'eccitazione delle cellule con il laser di FACS (principalmente con 488 nm lunghezza d'onda di eccitazione), queste cellule emettono un segnale fluorescente (principalmente < 640 nm) che può sovrapposizione con lo spettro di emissione dell'anticorpo etichette17,18. Per tenere conto di questo, non macchiate le cellule dovrebbero essere misurate per determinare l'autofluorescenza in ciascun canale. Con questa conoscenza, dovrebbero essere selezionati fluorocromi che visualizzano un segnale che supera il segnale di autofluorescent. Questo segnale di fondo di autofluorescent dovrebbe tener conto quando si determina la strategia di gating delle popolazioni. Di conseguenza, dall'applicazione del presente protocollo e intelligente design del pannello di FACS è possibile nei sottotipi di profondità fenotipo del macrofago. Nuova AT distinti macrofagi e la loro funzione può essere caratterizzati.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare J. van de Gaar e M. Vroomen (Università di Maastricht, Paesi Bassi) per il loro supporto tecnico. Inoltre, vorremmo ringraziare K. Verboven, D. Hansen, J. Antonio, e Blaak E. per la fornitura di biopsie del tessuto e del sangue utilizzati per l'impostazione di questo protocollo e gli esperimenti successivi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
| Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
| Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
| NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
| 200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
| 70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
| Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
| Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
| CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
| CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
| CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
| CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
| CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
| CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
| CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
| CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
| CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
| CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
| CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
| FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
| 96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
| PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
| FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
| Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
| LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
| IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |
References
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines. ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).
- Han, J. M., Levings, M. K. Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation. J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).
- Koh, Y. J., et al. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).
- Peinado, J. R., et al. The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).
- Leggate, M., et al. Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males. Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).
- Divoux, A., et al. Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).
- Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue. Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).
- Wentworth, J. M., et al. Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity. Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).
- Wouters, K., et al. Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue. Sci Rep. 7, 42665 (2017).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).
- Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
