Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

Published: February 9, 2018 doi: 10.3791/57324
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,3, 1
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

الدهنية التي تحتوي على سلسلة واحدة أمفيفيليس، لا سيما الأحماض الدهنية، يحمل خصائص متميزة مقارنة بتلك التي تحتوي على دياسيلفوسفوليبيدس بسبب الخصائص الكيميائية الفريدة من أمفيفيليس واحد في سلسلة. هنا يمكننا وصف تقنيات لإعداد وتنقية، واستخدام الدهنية تتألف جزئيا أو كلياً من هذه أمفيفيليس.

Abstract

الدهنية التي تحتوي على سلسلة واحدة أمفيفيليس، لا سيما الأحماض الدهنية، يحمل خصائص متميزة مقارنة بتلك التي تحتوي على دياسيلفوسفوليبيدس بسبب الخواص الكيميائية الفريدة لهذه أمفيفيليس. على وجه الخصوص، تعزيز الدهنية الأحماض الدهنية الطابع الدينامي، نظراً لأن القابلية للذوبان عالية نسبيا من سلسلة واحدة أمفيفيليس. وبالمثل، الدهنية التي تحتوي على الأحماض الدهنية الحرة أكثر حساسية للاتصالات الملح وديفالينت، بسبب التفاعلات القوية بين مجموعات حمض الكربوكسيلية الرأس والايونات المعدنية. نحن هنا لتوضيح تقنيات لتنقية، إعداد واستخدام الدهنية تتألف جزئيا أو كلياً من أمفيفيليس سلسلة واحدة (مثلاً، الأحماض الأولييك).

Introduction

الدهنية، أو حويصلات – المقصورات المحاط بالأغشية بيلايير تتألف من الدهون أمفيفيليك-وجدت الاستخدام في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية كوسائل إيصال للمستحضرات الصيدلية، ونماذج أغشية الخلية، ولتطوير الاصطناعية الخلايا. كما استخدمت نحن وآخرون الدهنية كنماذج لأغشية الخلايا البدائية في وقت مبكر من الحياة. 1 , 2 , 3 , 4 عادة، في مثل هذه الأنظمة، نحن نوظف أمفيفيليس سلسلة واحدة تحتوي على ذيل الهيدروكربونية الدهنية واحد فقط (مثلحمض الأولييك)، هذه الجزيئات أبسط لتوليف دون الاستفادة من البروتين المبرمج الإنزيمات تستخدم الخلايا الحديثة.

الدهنية التي تتكون من الدهون سلسلة واحدة مماثلة لتلك التي تكونت من دياسيلفوسفوليبيدس (مثلاً، 1-بالميتويل-2-أوليويل-sn-جليسيرو-3-phosphocholine، أو بوبك) في ذلك الحدود وتتألف من أغشية بلير. الدهنية التي تكونت من أي فئة من الدهون يمكن الاحتفاظ بحمولة المذاب، ويمكن تقليص حجمها وتنقيته باستخدام تقنيات مختلفة. العديد من الاختلافات الهامة نتيجة للخصائص الكيميائية الفريدة للدهون سلسلة واحدة. الحويصلات التي شكلتها فوسفوليبيدات مستقرة على نطاق واسع درجة حموضة، بينما حويصلات الأحماض الدهنية فقط مستقرة في الأس الهيدروجيني المحايدة إلى الأساسية أقل ما يقال (ca. 7-9)، الأمر الذي يتطلب بعض الحموضة العازلة لإعداد حويصلة. معظم الوقت، وهذا المخزن المؤقت قد تحتوي أيضا على جزيئات قابلة للذوبان محددة لتغليف حويصلة، التي يمكن أن تكون أما المواد الفنية (مثلالحمض النووي الريبي) للتفاعلات الكيميائية الحيوية مجزأة أو صبغات الفلورسنت بسيطة (مثلاً، كالسين ) لوصف حويصلة.

وجود سلسلة الهيدروكربون واحدة فقط تنتج من غشاء الذي على حد سواء أكثر نفاذية الذوائب، فضلا عن أكثر دينامية. بالإضافة إلى ذلك، حمض الكربوكسيلية رئيس الفريق في نتائج الأحماض الدهنية في الحويصلات التي أكثر حساسية لوجود الملح و divalent الكاتيونات (مثلاً، Mg2 +). المغنيسيوم أحد الكاتيونات divalent الأكثر أهمية لتحفيز التفاعلات الكيميائية الحيوية في بروتوسيلس للدراسات أصل الحياة. في الحياة المبكرة، قبل تطور إنزيمات البروتين متطورة، قد رنا البوليمر المهيمنة، نظراً لقدرتها المزدوجة لتكرار الذاتي والقيام بالحفز. مثال واحد من الحمض النووي الريبي التي تتطلب المغنسيوم المتعلقة برد الفعل هو الحمض النووي الريبي غير الانزيمية النسخ، أثبتت أولاً في الستينات. 5 عند تنشيط كيميائيا النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي (أي 2-ميثيليميدازوليدي النيوكليوتيدات) ربط مجمع التمهيدي-قالب موجود مسبقاً، 3 '-هيدروكسيل مجموعة من التمهيدي الهجمات 5'-الفوسفات من مونومر المنشط المتاخمة لتحل محل ترك المجموعة (أي 2-ميثيليميدازولي)، وأشكال السندات فوسفوديستير جديدة. ويتطلب هذا الكيمياء نسخ الحمض النووي الريبي تركيزات عالية من Mg2 +، الذي يحتاج إلى أن يكون له علاقة بالكلاب ولكي تكون متوافقة مع بروتوسيلس الأحماض الدهنية. 6 "مغ آخر"2 +-يتوقف رد الفعل أن تحفزها رايبوزيم المطرقة، وهو ربما تتسم أفضل حافز الجيش الملكي النيبالي. هذا رايبوزيم، التي يمكن أن يعاد تشكيلها من النوكليوتيد قصيرة اثنين، يقوم برد فعل ملائم لرصد تحول جل الانقسام الذاتي. على هذا النحو، وكثيراً ما يستخدم رايبوزيم نموذج في دراسات أصل الحياة. 7 بسبب شرط بهذا رايبوزيم المغنسيوم أونليجانديد، الدهنية عادة تصنع من خليط من الأحماض الدهنية والأحماض الدهنية استرات والغليسيرول، التي أكثر استقرارا المغنيسيوم. 8 , 9 في هذا البروتوكول، نقدم التقنيات ونحن قد وضعت لإعداد، والتلاعب، وتوصيف هذه الحويصلات وتثبت تطبيق هذه الحويصلات بروتوسيلس لنسخ والمطرقة رايبوزيم الجيش الملكي النيبالي المضيف غير الانزيمية الحفز.

Protocol

1-إعداد حويصلة

  1. إعداد أفلام رقيقة
    1. استخدام المحاقن ضيق الغاز لنقل كمية معينة من الدهون كما هو موضح في الجدول 1-1 لكلوروفورم في قنينة زجاج.
    2. تتبخر الحل الناتجة ضمن تيار من النيتروجين أو الأرجون في غطاء الدخان.
    3. الموضوع رقيقة الناتجة إلى فراغ البيت على الأقل 2 ح لإزالة أي بقايا كلوروفورم. الدهن يمكن أن تترك تحت الفراغ بين عشية وضحاها في هذه المرحلة.
  2. الإماهة حويصلات
    1. إعداد 10 مل من 5 مم كالسين مم 250 تريس-HCl pH 8.0 ترطيب المخزن المؤقت بحل 31 ملغ مسحوق كالسين في 2.5 مل من 1 M HCl تريس pH 8.0 المخزن المؤقت وإضافة آخر مل 7.5 من المياه (دي).
    2. "الماصة؛" 250 ميليلتر من فوق الماء المخزن المؤقت إلى أنبوب فارغ وإضافة 1.875 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 10 لنهائي 75 مم قاعدة (ما يعادل ½ من مجموع الأحماض الدهنية). نقل الحل إلى رقيقة من الدهن الجاف بشكل حويصلات بتركيز دهن الكلي من 0.15 متر.
    3. استخدام عالي السرعة (> 3000 لفة في الدقيقة) فورتيكسير إلى دوامة المخلوط الناتج عن s 4-5.
    4. ترك الخليط الدهن المخزن على شاكر الدورية سرعة منخفضة (ca. 30 لفة في الدقيقة) ترطيب، على الأقل بين عشية وضحاها.
  3. تحجيم حويصلات (اختياري)
    1. استخدام الملقط، تطبيق دعم مرشح واحد لكل السطح الداخلي من موانئ حقنه الطارد.
    2. ويت كل الدعم عامل التصفية مع تريس 250 ملم-HCl، درجة الحموضة 8.
    3. استخدام الملقط، تطبيق واحد محفوراً المسار 100 نانومتر البولي غشاء على واحد من الطارد سين بين عصابات وتصفية يدعم. مع الحرص على عدم المسيل للدموع أو ثقب الغشاء، دفع برفق الغشاء إلى الدائري للاتصال الجيد بين السطوح اثنين.
    4. تجميع الطارد، مع الحرص على عدم إزاحة الغشاء ويعتمد عامل التصفية.
    5. ملء حقنه الطارد مع ca. 0.5 مل تريس 250 ملم-HCl، درجة الحموضة 8. إدراج هذه المحاقن في أحد جانبي الطارد.
    6. إدراج حقنه فارغة في الجانب الآخر من الطارد.
    7. من جهة، دفع المكبس لحقنه تحتوي على المخزن المؤقت ببطء (≤ 50 ميليلتر/s)، والتحقق من أن المقاومة هو شعر، يدل على الغشاء محفوراً في المسار الصحيح في المكان وسليمة. أنها مفيدة لممارسة هذه الخطوة دون غشاء في المكان من أجل قياس المستوى المتوقع للمقاومة.
    8. إزالة ثم قم بإفراغ المحاقن اثنين. فإنه ليس من الضروري لتنظيف المحاقن اثنين في هذه المرحلة نظراً لأنها تحتوي على المخزن المؤقت لنفس التكوين في إعداد الحويصلية.
    9. تحميل إعداد الحويصلية في واحدة من المحاقن اثنين.
    10. إعادة تجميع في الطارد بحقنه تحتوي على عينة حويصلة على الجانب الأيسر والمحاقن الفارغة على الجانب الأيمن.
    11. من جهة، دفع المكبس للمحاقن التي تحتوي على نموذج حويصلة ببطء شديد (10-25 ميليلتر/s).
    12. مراقبة بعناية المحاقن في الجانب الأيمن من الطارد؛ واضح ستدخل المخزن المؤقت في البداية إلى الجانب الأيمن من الطارد (ca. 50 ميليلتر، يرجع إلى حجم القتلى الداخلية الطارد)، متبوعاً بعمود صغير من مقذوف الدهنية. التوقف فورا عن دفع في هذه المرحلة وإزالة المحاقن في الجانب الأيمن من الطارد تجاهل هذا الحل.
    13. استبدال المحاقن في الجانب الأيمن من الطارد وقذف حتى المحاقن الأيسر فارغ.
    14. عكس اتجاه الطارد وكرر الخطوة 13. مواصلة للعدد المطلوب من دورات (عادة 7 أو 9 أو 11)؛ عدد فردي يستخدم دائماً لضمان الدهنية مقذوف الأمم المتحدة لم تجمع من المحاقن في البداية يحتوي على إعداد الحويصلية تقليص السابقة.
    15. بلطف الاستغناء عن محتويات المحاقن الحق في أنبوب ايبندورف ووضع الأنبوب على شاكر الدورية لحوالي 0.5 ح سرعة منخفضة (ca. 30 لفة في الدقيقة).
    16. المضي قدما في تنقية حويصلة، كما هو موضح في المقطع 2. ينبغي أن تستخدم داخل ح 24 حويصلات مقذوف أو إعادة مقذوف قبل استخدام الوقت القادم.

2-حويصلة تنقية

  1. إعداد حويصلة تنقية المرحلة المتنقلة
    1. إعداد 5 مل من 250 ملم تريس-HCl درجة الحموضة 8 ترطيب المخزن المؤقت عن طريق إضافة 1.25 مل م 1 تريس-HCl pH 8 المخزن المؤقت، 3.75 مل مياه دي أن 15 مل من أنبوب فالكون. قم بإضافة ميليلتر 37.5 من 10 M هيدروكسيد الصوديوم (ما يعادل ½ القاعدة مقارنة بالأحماض الدهنية أونيستيريفيد) إلى المخزن المؤقت ترطيب. "الماصة؛" ميليلتر 235 من حمض الأولييك النقي مباشرة في أنبوب الصقر مما حل حويصلة مع الدهون الإجمالية 0.15 متر.
    2. استخدام عالي السرعة (> 3000 لفة في الدقيقة) فورتيكسير إلى دوامة الخليط ل s 4-5، ثم تعثر على سرعة منخفضة شاكر على الأقل 2 ح بالتناوب. إعداد المحتوى الدهني يمكن أن تترك بين عشية وضحاها على شاكر الدورية عند هذه النقطة. تصفية المرحلة المتنقلة عن طريق حقنه ميكرومترات 0.22 تصفية وحدة قبل استخدامها لإزالة أي مجاميع المحتملة.
  2. تنقية حويصلات على سيفاروسي
    1. إزالة ca. 5 مل ملاط 4B سيفاروسي اثانوليك من الزجاجة باستخدام ماصة. ينطبق هذا على عمود كروماتوغرافيا المتاح 10 مل.
    2. السماح الملاط تسوية والايثانول عبر تدفق حتى الإيثانول النهج العلوي من السرير الراتنج.
    3. تطبيق 5 مل من المياه إلى الأعلى من الراتنج والسماح بتدفق ليغسل بقايا الإيثانول.
    4. تطبيق تريس 250 ملم-HCl، درجة الحموضة 8 في الأجزاء 1-2 مل إلى الجزء العلوي من الراتنج، تطبيق جزء جديد في كل مرة يقترب مستوى السائل أعلى سرير الراتنج. تكرار ل 3-5 مرات.
    5. المشبك العمود على الوقوف المعوجة، ثم قم بتوصيل غيض العمود مع موصل محبس الحنفية وأنابيب للكسر وجامع. إضافة جزء آخر من المخزن المؤقت دافق الأنابيب، وأغلق في محبس الحنفية عندما يقترب مستوى السائل في العمود الأعلى من الراتنج.
    6. تطبيق الحويصلات مقذوف من الجزء 1 إلى الجزء العلوي من الراتنج باستخدام بيبيتور 200 ميليلتر، مع الحرص على تطبيق إعداد حويصلة بشكل متساو قدر الإمكان على الراتنج دون لمس الجدار السرير أو عمود الراتنج.
    7. فتح في محبس الحنفية بدء التدفق والبدء في جمع الكسور في لوحة 96-جيدا. تطبيق حويصلة تنقية المرحلة المتنقلة إلى الجزء العلوي من السرير الراتنج في 0.5-1 مل الأجزاء كما يستنفد المخزن المؤقت، مع الحرص على عدم السماح لسرير الراتنج لتجف. جمع في الكسور قطره خمسة، جمع مالا يقل عن 36 بئرا (ثلاثة صفوف من لوحة 96-جيدا).
  3. وصف الأسفار من كسور تنقية
    1. تأخذ لوحة 96-جيدا من المقطع السابق وقراءته على قارئ لوحة (λت= 485 نانومتر، λم= 515 نانومتر).
    2. رسم البيانات fluorescence الناتجة الأسفار مقابل عدد الكسر. حويصلات الوت أولاً، متبوعاً بالكسر الحاسوبية (الشكل 1).
  4. ريبوريفيكيشن حويصلات لرصد التسرب حويصلة
    1. كرر الخطوات تنقية وتوصيف في أقسام 2.2 و 2.3. الحويصلات التي احتفظت بمحتوياتها سوف يحمل لا ذروة المذاب الحاسوبية (أو واحدة صغيرة جداً من ca. 5-10% من كثافة ذروة حويصلة).

3-استخدام حويصلات حضور المغنسيوم

  1. استخدام المغنيسيوم أونليجانديد
    1. إعداد وتنقية الحويصلات كما هو موضح في المقاطع 1، 2، 1 و 2-2.
    2. إعداد 1 مل من 50 مم مجكل2 الحل في 250 ملم تريس-HCl pH 8.0 المخزن المؤقت عن طريق إضافة ميليلتر 250 1 م تريس-HCl pH 8.0 المخزن المؤقت و 50 ميليلتر من مجكل م 12 إلى 700 ميليلتر دي المياه. دوامة مزيج جيد.
    3. لإعطاء تركيز المغنيسيوم المطلوب 5 مم، مزيج 0.9 مل حويصلات المنقي و 100 ميليلتر من حل المغنيسيوم ويقلب سريعاً تقليل تعطل حويصلة بالتعرض عابرة من الحويصلات إلى تركيز المحلية عالية من المغنيسيوم.
      ملاحظة: خلط المغنيسيوم الحل السريع أمر حاسم للاستقرار حويصلة. إذا المغنيسيوم وحويصلات غير مختلطة بسرعة قبل فورتيكسينج فورا، سوف يتعرض بعض الحويصلات إلى تركيزات أعلى من المغنيسيوم، أسفر عن نتائج غير متناسقة من عينة بعينه.
    4. ترك العينة حويصلة على بهلوان لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل ريبوريفيكيشن كما هو موضح في 2.4 للتحقق من وجود تسرب المحتويات. إضافة نفس تركيز المغنيسيوم كما هو الحال في نموذج حويصلة إلى مرحلة المحمول ريبوريفيكيشن.
  2. استخدام المغنيسيوم ليجانديد
    1. إعداد وتنقية الحويصلات كما هو موضح في المقاطع 1، 2، 1 و 2-2.
      ملاحظة: استخدم كوه يعادل ½ بدلاً من هيدروكسيد الصوديوم للأحماض الدهنية ديبروتوناتي؛ فقد وجد أن تنتج هذه الدهنية أكثر استقرارا في نظم2 مجكل الكلاب.
    2. إعداد الحل سترات البوتاسيوم 2 متر وضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.0 مع كوه.
    3. بريمكس مجكل سترات2 والبوتاسيوم في نسبة محددة (ca. 1:4 حويصلات مستقرة حمض الأولييك) في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 8.0 تريس-HCl 250 ملم.
    4. إضافة حل سترات المغنيسيوم خلط العينة حويصلة، دوامة بإيجاز.
      ملاحظة: بريمكس دائماً الحل المغنيسيوم ويجند. ابدأ فضح حويصلات حل المغنيسيوم أونتشيلاتيد وحدها.
    5. ترك العينة حويصلة على بهلوان لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل ريبوريفيكيشن كما هو موضح في 2-4. إضافة نفس تركيز الماغنسيوم وسترات كما هو الحال في العينة حويصلة إلى مرحلة المحمول ريبوريفيكيشن.

4-غير الانزيمية الحمض النووي الريبي نسخ في حويصلات

  1. إعداد مونوديسبيرسي الرنا مغلفة حويصلات
    1. إعداد فيلم حمض الأولييك جافة كما هو موضح في القسم 1-1.
    2. إعداد حويصلة الإماهة المخزن المؤقت مع 50 ميكرومتر الفلورسنت المسماة الجيش الملكي النيبالي التمهيدي، 150 قالب الحمض النووي الريبي ميكرومتر و 250 ملم تريس-HCl pH 8.0 يتضمن كوه يعادل ½ مقارنة بحمض الأولييك.
    3. إضافة 250 ميليلتر الإماهة المخزن المؤقت للفيلم الدهن واتبع الخطوة 1.2.2 و 1.2.3 جعل حويصلات مع مجموع تركيز الدهن 0.15 متر.
    4. من أجل جعل أونيلاميلار صغير الحويصلات مونوديسبيرسي، اتبع قسم 1.3 لقذف حويصلة.
  2. سترات المغنيسيوم بالإضافة وحويصله وتنقية
    1. بريمكس الماغنسيوم وسترات الأرصدة، وثم خلط هذا مع العينة حويصلة لتركيز دهن نهائي من 0.1 متر.
    2. تنقية الحويصلات سيفاروسي 4B حجم الاستبعاد العمود، مع 250 ملم تريس-HCl pH 8.0، الدهون 0.1 م ونظرا الماغنسيوم وسترات كمرحلة المتنقلة.
    3. جمع الكسور حويصلة بالمقطع التالي 2.3.
  3. رد فعل التمديد التمهيدي
    1. إعداد 200 ملم 2-ميمبج (guanosine 5 '-الأدينوزين 2-ميثيليميدازوليدي) حل الأسهم مع 250 ملم تريس-HCl pH 8.0. (ملاحظة: اتبع السابق نشر البروتوكول10 لتوليف 2-ميمبج.)
    2. للشروع في رد فعل التمديد التمهيدي، ونقل 150 ميليلتر من حل الأسهم 2-ميمبج إلى 450 عينة حويصلة ميليلتر للوصول إلى نهائي تركيز الدهن 75 ملم و 50 ملم بتنشيط مونومر. بدء الموقت وتبقى رد فعل عينة تراجع طوال الوقت.
    3. (اختياري) لتغذية مستمرة مونومر جديدة، نقل 300 ميليلتر حل رد فعل لغرفة واحدة مختبر شيدت الحويصلية صغيرة الحجم دياليزير11 ووضع 300 ميليلتر تغذية الحل في قاعة أخرى. ينبغي أن يتضمن الحل تغذية كافة المكونات في تركيز نفسه كما هو الحال في الحل رد فعل، باستثناء استبدال الحمض النووي الريبي التي تحتوي على حويصلات مع حويصلات فارغة. ويأخذ كل جولة للغسيل الكلوي ح 1-24، اعتماداً على أكثر والأغشية المستخدمة.
    4. الدراسات الحركية، تتخذ من 100 ميليلتر الكوة عند كل نقطة في الوقت، ومن ريبوريفي قاسمة من خلال سيفاروسي 4B حجم استبعاد عمود مع 250 ملم تريس-HCl pH 8.0 كمرحلة المتنقلة.
    5. جمع الكسور حويصلة في أنبوب ايبندورف 1.5 مل.
    6. "الماصة؛" تريتون للكسور حويصلة إلى نهائي حوالي 0.1% v/v.
    7. إضافة 0.5 مل إيثانول البارد إلى الأنبوب واحتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 2.
    8. الطرد المركزي جميع العينات في 16.1 × 1000 إطار التعاون الإقليمي (16.1 × ز) 10 دقيقة وماصة بالسوائل بلطف. أغسل الجيش الملكي النيبالي الكريات مع 70% من الإيثانول البارد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لأدنى 5 تجاهل السائل ووضع الأنبوب مع الحمض النووي الريبي الكريات على كتلة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تتبخر الإيثانول المتبقية. حل الكريات في 50 ميليلتر من 8 م اليوريا مع 1xTBE تحميل المخزن المؤقت.
  4. تحليل صفحة
    1. إعداد 20% هلام الصفحة عن طريق خلط 200 مل أورياجيل نظام تركيز, 25 مل نظام أورياجيل مادة، 25 مل من المخزن المؤقت 10xTBE، 80 ميليلتر من تيميد و 250 ملغ من فوق كبريتات الأمونيوم. بسرعة صب جل الخليط بين جل فرضت لوحات (35 سم × 45 سم) وإدراج المشط. انتظر 30 دقيقة على الأقل حتى البلمرة كاملة.
    2. تجميع لوحة جل على موقف جل وملء المربعين هلام مع هلام 1xTBE تشغيل المخزن المؤقت. الإقلاع المشط وتدفق الآبار مع المحاقن. قبل تشغيل الهلام مع 60 واط لمدة 30 دقيقة.
    3. حرارة العينات على كتلة الحرارة 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وتحميل 5 ميليلتر لكل عينة من كل بئر.
    4. تشغيل مربع هلام السلطة وتعيين جل يعمل مع واط المستمر في 60 ث عن ح 2.5.
    5. تفكيك لوحة جل من موقف جل ومسح الزجاج نظيفة ووضع لوحة كاملة في جل الماسح الضوئي لبدء المسح الضوئي هلام.
    6. تحديد مقدار الجل مع تحليل د 1 إيماجيكوانت ليرة تركية. ارسم اللوغاريتم الطبيعي لنسبة مقدار التمهيدي المتبقية في نقطة زمنية معينة إلى مبلغ أولى قدرة التمهيدي مقابل الوقت ويصلح لخط وحساب معدل رد فعل النظام الزائفة الأولى (الشكل 2).

5-المطرقة الانقسام الذاتي الجيش الملكي النيبالي في حويصلات

  1. إعداد وتنقية رايبوزيم مغلفة في حويصلات
    1. إعداد طبقة رقيقة دهن (الزراعة العضوية: الكائنات المعدلة وراثيا = 9:1) كما هو الحال في الفرع 1-1 مع المكونات كما هو الحال في الجدول 1-2- ملاحظة: الكائنات المعدلة وراثيا الحارة إلى مالا يقل عن 60 درجة مئوية لصهر كاملة قبل استخدام.
    2. إعداد حويصلة الإماهة المخزن المؤقت مع 5 ميكرون لكل قرش أبو مطرقة رايبوزيم حبلا و 250 ملم تريس-HCl pH 8.0.
    3. إضافة 250 ميليلتر الإماهة المخزن المؤقت للفيلم الدهن واتبع الخطوات 1.2.2 و 1.2.3 جعل حويصلات مع 0.15 م مجموع تركيز الدهن.
    4. من أجل جعل أونيلاميلار صغير الحويصلات مونوديسبيرسي، اتبع قسم 1.3 لقذف حويصلة.
    5. تنقية حويصلات على عمود استبعاد حجم 4B سيفاروسي، مع 250 ملم تريس-HCl pH 8.0، 0.15 متر مختلطة الدهون كمرحلة المتنقلة.
  2. قرش أبو مطرقة رايبوزيم المتمتعة بالحكم الذاتي-الانقسام وردود الفعل
    1. إعداد الحل المغنيسيوم وخلط مع منقاة حويصلات كما هو موضح في القسم 3.1 الشروع في رد فعل الانقسام الذاتي.
    2. الدراسات الحركية، تأخذ 100 ميليلتر من الخليط في كل نقطة من الوقت ومباشرة ريبوريفي قاسمة هذا من خلال سيفاروسي 4B حجم استبعاد عمود مع 250 ملم تريس-HCl pH 8.0 كمرحلة المتنقلة. جمع الكسر حويصلة.
  3. تحليل صفحة
    1. اتبع الخطوات 4.3.6 إلى 4.3.8 لإعداد الجيش الملكي النيبالي تحميل عينة.
    2. ضع تجارياً مسبوك جل اليوريا TBE 15% في مربع هلام وملء مربع هلام مع هلام 1xTBE تشغيل المخزن المؤقت.
    3. حرارة العينات على كتلة الحرارة 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتحميل 5 ميليلتر لكل عينة من كل بئر.
    4. تشغيل الهلام مع 200 ثابت الخامس لحوالي 1 ح.
    5. المسح الضوئي للهلام.
    6. التحديد الكمي للجل مع برنامج تحليل، مثل TL إيماجيكوانت د 1، لقياس مدى الانقسام بمقارنة كثافة المتبقية الركازة الفرقة رنا ورنا ملصوق تفتيت الفرقة (الشكل 3).

6-حويصلات الأحماض الدهنية العملاقة للفحص المجهري

  1. إعداد حويصلات الأحماض الدهنية العملاقة
    1. يتبع الفرع 1-1 و الجدول 1-3 إعداد حمض الأولييك رقيقة مع 0.2 mol % من الدهن المسمى فلوريسسينتلي لأفضل غشاء المراقبة.
    2. ترطيب الفيلم الدهن مع 500 ميليلتر 250 ملم تريس-HCl pH 8.0 جعل الدهون 10 ملم عينة حويصلة في المجموع. قد يحتوي على المخزن المؤقت الأصباغ الفلورية أو جزيئات الحمض النووي الريبي إذا رغبت في ذلك. ترك حويصلة عينة هبط بين عشية وضحاها.
    3. إعداد 150 مل من المخزن المؤقت للغسيل الكلوي الأحماض الدهنية نقية مع 10 ملم إجمالي الدهون بخلط ميليلتر 470 من حمض الأولييك و 150 مل من 250 ملم تريس-HCl pH 8.0 المحتوية على هيدروكسيد الصوديوم يعادل ½.
    4. قذف العينة حويصلة عبر غشاء البولي ميكرومتر 10 لإزالة المجاميع الكبيرة.
    5. نقل العينة حويصلة في كاسيت كبير المسام الغسيل الكلوي 1 ميكرومتر، كما تم وصفه سابقا. 12
    6. ضع الكاسيت الغسيل الكلوي في كوب 100 مل يحتوي على المخزن المؤقت للغسيل الكلوي 30 مل. تحرض الكأس برفق على شاكر أعلى الجدول 80-100 لفة في الدقيقة.
    7. تغيير المخزن المؤقت الغسيل الكلوي كل 30 دقيقة 5 مرات لإزالة الأصباغ مجاناً أو الجيش الملكي النيبالي وحويصلات صغيرة.
    8. بعناية إزالة عينة حويصلة من الكاسيت الغسيل الكلوي مع المحاقن ونقل إلى أنبوب ايبندورف.
  2. مراقبة الفحص المجهري
    1. "الماصة؛" 10 ميليلتر من الحويصلات إلى شريحة مجهر قياسية نظيفة ومكان زلة غطاء زجاج أكثر من العينة. ختم تغطية الزجاج بطلاء الأظافر الشفاف.
    2. مراقبة الحويصلات مع 60 × النفط-التشتت أو هدف مماثل بالفحص المجهري [كنفوكل] استخدام مصدر الليزر المناسبة للغشاء المسمى فلوريسسينتلي، والجيش الملكي النيبالي أو صبغ مغلفة (الشكل 4).

Representative Results

عادة ما نقوم بتنقية الحويصلية على استبعاد حجم الأعمدة. الاستعدادات الحويصلية نموذجية تحتوي على فلوروفوري نوع ما. عندما يتم إنشاؤها الدهنية ومقذوف، الأنواع تكون مغلفة موجودة داخل وخارج في الدهنية. بتنقية الدهنية راتنج حجم الاستبعاد (سيفاروسي 4B)، يتم الاحتفاظ الذوائب الحاسوبية داخل مسام الراتنج، بينما لا الدهنية أكبر والوت الأولى (الشكل 1A). جمع الكسور والتآمر fluorescence مقابل عدد الكسر (الشكل 1B) عادة غلة تتبع اثنين-الذروة، مع كسور المبكر التينج المقابلة الدهنية، ومن ثم جمعها واستخدامها في التطبيقات اللاحقة.

وكثيراً ما ندرس نونينزيماتيك التمهيدي ملحق ردود الفعل، التي كانت وسيلة المحتمل للجيش الملكي النيبالي النسخ المتماثل قبل ظهور رايبوزيم ورنا بولمرس القائم على البروتين. عادة تستخدم هذه التفاعلات تمهيدي مسمى فلوريسسينتلي (الشكل 2A)، الذي تم تمديده بتنشيط مونومرات. ردود الفعل هذه يمكن أن ترصدها هلام استشراد (الشكل 2B) ومتكاملة اليكتروفيروجرامس الناجمة عن ذلك للحصول على معدل الثوابت لشرط رد فعل معين (الشكل 2).

لإظهار أن الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن تعمل داخل بروتوسيلس، نحن نوظف المطرقة رايبوزيم المتمتعة بالحكم الذاتي-انشقاق (الشكل 3A) كرد فعل الجيش الملكي النيبالي حفاز على نموذج. يتطلب هذا التفاعل الحر Mg2 + تيسيرا للحفز، وذلك استخدمنا حويصلات الزراعة العضوية/الكائنات المعدلة وراثيا حيث أنها مستقرة حضور مم 5 ملغ2 +. مشابهة للتفاعلات تمديد التمهيدي، كما يمكن رد فعل الانقسام الذاتي رايبوزيم المطرقة يرصدها هلام استشراد (الشكل 3B) وتحليلها في وقت لاحق للحصول على معدل ثابت تحت ظروف معينة (الشكل 3).

ونحن الصورة الدهنية توظف كل الأسفار وأحال الضوء. يمكن أن يكون المسمى الدهنية استخدام الدهون فلوري، الذي يعطي تسمية غشاء (الشكل 4 أ)، أو باستخدام المذاب نيون داخل التجويف بهم (الشكل 4 باء). يمكن أيضا استخدام يبث ضوء لمراقبة حويصلات (كما هو موضح في الشكل 4 باء).

الجدول 1-1 حمض الأولييك نقية في كلوروفورم
المكون الأوراق المالية المبلغ
حمض الأولييك > 99 ٪ ميليلتر 11.7
كلوروفورم 1 مل
الجدول 1.2 حمض الأولييك والجلسرين مونولياتي (9:1) في كلوروفورم
المكون الأوراق المالية المبلغ
حمض الأولييك > 99 ٪ ميليلتر 10.5
مونوليتي الجلسرين > 99 ٪ ميليلتر 1.4
كلوروفورم 1 مل
الجدول 1-3 حمض الأولييك مع 0.2mol% والرودامين-PE في كلوروفورم
المكون الأوراق المالية المبلغ
حمض الأولييك > 99 ٪ ميليلتر 1.6
والرودامين-PE في كلوروفورم 10 ملم 20 ميليلتر
كلوروفورم 1 مل

الجدول 1. حلول كلوروفورم الأحماض الدهنية.

Figure 1
رقم 1. حويصلة توصيف تنقية والأسفار لتنقية الكسر. ألف فصل حويصلات التي تحتوي على كالسين من كالسين الحرة على عمود 4B سيفاروسي. باء- حويصلة والكشف عن ذروة كالسين مجاناً برسم الأسفار في كل بئر مقابل عدد جيدا بعد جمع الكسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. النسخ المتماثل عدم الانزيمية للجيش الملكي النيبالي داخل حويصلات الزراعة العضوية. ألف مخطط ملحق التمهيدي الحمض النووي الريبي غير الانزيمية. ب صورة الصفحة من فعل التمديد التمهيدي داخل حويصلات حمض الأولييك الصرفة، مع الظروف كما في القسم 4. جيم خطي تناسب من اللوغاريتم الطبيعي لنسبة مبلغ المتبقي التمهيدي في النظر إلى نقطة الوقت مقدار التمهيدي مقابل الوقت ما يزيد على 30 h. معدل رد الفعل الأولى، محسوبة من المنحدر من ln (P/P0) مقابل الوقت، هو ح 0.058-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. قرش أبو مطرقة رايبوزيم الانقسام في حويصلات الزراعة العضوية/الكائنات المعدلة وراثيا. ألف مخطط المطرقة رايبوزيم الانقسام من الركازة المسمى فلوريسسينتلي ستراند (أعلى). صورة صفحة ب المطرقة رايبوزيم الانقسام داخل حويصلات الزراعة العضوية/المعدلة وراثيا مع مم 5 ملغ2 +. جيم رايبوزيم النشاط داخل الحويصلات. تناسب خطي من اللوغاريتم الطبيعي لنسبة مبلغ من الركازة المتبقية في النظر إلى النقطة الزمنية للمبلغ الأولى من الركازة مقابل الوقت في h. 4 أول رد فعل هو معدل، محسوبة من منحدر الوقت مقابل ln (S/S0)، ح 0.36-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. حويصلات الأحماض الدهنية العملاقة للفحص المجهري. ألف صورة مجهرية [كنفوكل] PE والرودامين المسمى حمض الأولييك حويصلة، مقياس بار 10 ميكرومترات. ب صورة مجهرية [كنفوكل] من حمض الأولييك حويصلة تحتوي على Alexa488 المسماة الجيش الملكي النيبالي مع غشاء سيظهر في قناة الكاشف المنقولة (الدفتيريا)، ومقياس بار 5 ميكرومترات.

Discussion

وقد اقترحت الدهنية التي تكونت من الأحماض الدهنية الكثيرون كنماذج محتملة للخلايا البدائية سبب نفاذية عالية وخصائص ديناميكية. كاربوكسيليك رئيس مجموعة الأحماض الدهنية سلسلة واحدة فقط يسمح التجميع الذاتي في الأغشية في مجموعة الرقم الهيدروجيني مقيدة، والأغشية الناتجة حساسة جداً لوجود الأملاح. نتيجة لذلك تتطلب حويصلات الأحماض الدهنية إعداد مختلفة والتعامل مع أساليب مقارنة مع الحويصلات فسفوليبيد.

في هذا البروتوكول، على الرغم من أننا استخدام حمض الأولييك كمثال لتكوين الحويصلية، وأخرى طويلة سلسلة الأحماض الدهنية غير المشبعة (C14) ومشتقاتها (ca. حمض ميريستوليك، وحمض palmitoleic، والكحول المقابلة والجلسرين استرات) أيضا شكل حويصلات اتباع أسلوب الإماهة رقيقة طالما تركيز الدهن المجموع أعلاه اللجنة العسكرية المركزية ودرجة الحموضة العازلة ترطيب بالقرب من pKa للأحماض الدهنية داخل الغشاء. أخرى غير HCl تريس المخزن المؤقت المستخدمة في هذا البروتوكول، نظم أخرى المخزن المؤقت (ca. بيسين، الفوسفات، بورات) أفيد بدعم تكوين حويصلة الأحماض الدهنية، على الرغم من أن عادة ما تكون حويصلات شكلت في المخزن المؤقت للفوسفات أو بورات راشح تماما13. حويصلات الأحماض الدهنية الناتجة بعد الإماهة بوليديسبيرسي ومولتيلاميلار، ولكن يتم تحويله بسهولة إلى الحويصلات أونيلاميلار مونوديسبيرسي الصغيرة بقذف كما هو موضح. مقارنة مع سونيكيشن كأسلوب بديل لتوليد حويصلات صغيرة، البثق يوفر المزيد من الخيارات للتحكم في حجم حويصلة بتطبيق أغشية حجم المسام مختلفة. عادة ما تكون أكبر قليلاً من حجم المسام غشاء الحويصلات بعد البثق، ولكن عن طريق زيادة عدد دورات البثق، يمكن الحصول على حويصلات مع توزيع حجم أضيق وحجم متوسط قريبة من حجم مسام الغشاء.

من أجل توليف بروتوسيلس الوظيفية، حويصلات الأحماض الدهنية بحاجة إلى المضيف محددة التفاعلات الكيميائية الحيوية الناتجة عن التغليف للحمض النووي الريبي أو كتل الإنشاء. الأسلوب الإماهة رقيقة يوفر طريقة سهلة لشكل الحويصلات المحتوية على المواد المغلفة المرجوة. ومع ذلك، كفاءة تغليف منخفضة نسبيا وجزء كبير من المواد الثمينة مثل الحمض النووي الريبي تضيع عادة أثناء عملية تنقية. وفي بعض الحالات يمكن تحسين كفاءة تغليف متواضعة بدورات تجميد أذاب المتكررة قبل قذف. تسمح أساليب موائع جزيئية لإعداد فسفوليبيد الدهنية عالية الغلة لكفاءة التغليف 100% تقريبا، ولكن حتى الآن لم توضع أساليب مماثلة حويصلات الأحماض الدهنية.

عند التعامل مع بروتوسيلس مع الكلاب أو الحرة Mg2 +تنقية بعد إضافة الحل المغنيسيوم وريبوريفيكيشن قبل كل نقطة الوقت يضمن الإزالة تسربت تغليف المواد التي قد تؤثر على دقة معدل التفاعل القياسات داخل الحويصلات. حيث يأخذ كل تنقية مالا يقل عن 10 دقيقة لتحقيق فصل جيدة وجمع الكسور حويصلة، تحليل ردود فعل سريعة من الصعب، وأن رد الفعل يجب أن تتوقف قبل ريبوريفيكيشن العمود.

البروتوكول ونحن الحاضرين هنا أيضا مناسبة لتشييد الدهنية الأحماض الدهنية التي تستضيف ردود فعل محاكاة تلك التي قد تحدث في الخلايا البدائية. لدينا البروتوكولات أيضا تمكين التطبيقات المحتملة في تطوير منظومات إيصال الطب الحيوي والمفاعلات الحيوية للتفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

J.W.S. هو محقق من معهد هوارد هيوز الطبي. بتأييد هذا العمل جزئيا بمنحه (290363) من "مؤسسة سيمونز" إلى J.W.S. A.E.E. و K.P.A. على حد سواء الاعتراف بدعم من جامعة مينيسوتا أموال بدء التشغيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sephorose 4B SIGMA-ALDRICH INC 4B200
calcein SIGMA-ALDRICH INC C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M LIFE TECHNOLOGIES CORP AM9851
citric acid SIGMA-ALDRICH INC 251275-500G
sodium hydroxide SIGMA-ALDRICH INC 71690-250G
potassium hydroxide Sigma 30614
oleic acid Nu-Chek U-46-A
glycerol monooleate Nu-Chek M-239
Liss Rhodamine-PE LIFE TECHNOLOGIES CORP L1392
magnesium chloride Fisher/Thermo Fisher Scientific AM9530G
sequagel concentrate National Diagnostics EC-830
sequagel DILUENT National Diagnostics EC-840
15% TBE-UREA GEL Thermo Fisher Scientific EC68852BOX
urea Sigma Aldrich U6504-500G
titon-100x SIGMA-ALDRICH INC T9284-100ML
RNA primer IDT 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template IDT 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand IDT 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand IDT 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set AVANTI POLAR LIPIDS 610000
fraction collector Gilson, Inc. 171041
96-well plates Fisher NC9995941/675
plate reader Molecular Devices SpectraMax i3
confocal microscope Nikon Nikon A1R MP Confocal
gel scanner GE Healthcare Life Sciences Typhoon 9410 scanner

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009 (2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، المسألة 132، الدهنية، حويصلات، بروتوسيلس، والخلايا الاصطناعية، سينيلس، أصل الحياة
إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala,… More

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter