Summary
Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen ten opzichte van deze met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van één keten amfifielen. Hier beschrijven we technieken voor de voorbereiding, zuivering, en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van deze amfifielen.
Abstract
Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen vergeleken met degenen met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van deze amfifielen. In het bijzonder verbeteren vetzuur liposomen dynamische karakter, als gevolg van de relatief hoge oplosbaarheid van single-keten amfifielen. Liposomen met vrije vetzuren zijn ook gevoeliger voor zout en divalente kationen, als gevolg van de sterke wisselwerking tussen de carbonzuur hoofd groepen en metaalionen. We illustreren hier technieken voor voorbereiding, zuivering en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van één keten amfifielen (b.v., oliezuur zuren).
Introduction
Liposomen of blaasjes – compartimenten begrensd door dubbelgelaagde membranen bestaat uit amfifiele lipiden - hebben gebruik in talrijke biomedische toepassingen gevonden als leverende voertuigen voor farmaceutische producten, modellen van celmembranen, en voor de ontwikkeling van synthetische cellen. Wij en anderen hebben ook liposomen werkzaam als modellen van primitieve celmembranen in vroege leven. 1 , 2 , 3 , 4 typisch, in dergelijke systemen hanteren wij één-keten amfifielen die bevatten slechts één lipide koolwaterstof staart (b.v., oliezuur), zoals deze moleculen eenvoudiger zijn te synthetiseren zonder het voordeel van de enzymen van de gecodeerde eiwit moderne cellen in dienst.
Liposomen bestaat uit single-keten lipiden zijn vergelijkbaar met die gevormd uit diacylphospholipids (bijvoorbeeld1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-fosfocholine of POPC) in die zin dat de grens is samengesteld uit dubbelgelaagde membranen. Liposomen gevormd uit een klasse van lipiden kunnen een opgeloste nettolading, kunnen behouden en worden ingekrompen en gezuiverd door verschillende technieken. Aantal belangrijke verschillen het gevolg zijn van de unieke chemische kenmerken van single-keten lipiden. Blaasjes gevormd door fosfolipiden zijn stabiele over een brede pH-bereik, terwijl vetzuur blaasjes zijn slechts stabiel bij een neutrale mild standaardschijf pH (ca. 7-9), die bepaalde pH buffer vesikel voorbereiding vereist. Allermeest naar de tijd, kan deze buffer ook specifieke oplosbare molecules voor de inkapseling van het vesikel, die beide functionele materialen (bijvoorbeeldRNA) kunnen bevatten voor de verzuilde biochemische reacties of eenvoudige fluorescente kleurstoffen (bijvoorbeeld, calceïne ) voor de karakterisering van het vesikel.
De aanwezigheid van slechts een enkele koolwaterstof keten produceert een membraan dat is zowel meer luchtdoorlatend opgeloste stoffen, evenals dynamischer. Bovendien, de carbonzuur hoofd groep aanwezig zijn in de resultaten van de vetzuren in blaasjes die meer gevoelig zijn voor de aanwezigheid van zout en divalente kationen (bijv., Mg2 +). Magnesium is een van de belangrijkste divalente kationen voor het katalyseren van biochemische reacties in protocells voor oorsprong-van-leven studies. In vroege leven, voorafgaand aan de evolutie van geavanceerde eiwit enzymen, kan RNA zijn geweest van het dominante polymeer, als gevolg van zijn dubbele vermogen om zichzelf te repliceren en katalyse uitvoeren. Een representatief voorbeeld van een magnesium-vereisen RNA gerelateerde reactie is niet-enzymatische RNA kopiëren, eerst gedemonstreerd in de jaren 1960. 5 wanneer chemisch geactiveerde RNA-nucleotiden (dat wil zeggen 2-methylimidazolide nucleotiden) aan een bestaande primer-template-complex koppelen, de 3'-hydroxylgroep van de primer aanvallen de 5'-fosfaat van een aangrenzende geactiveerde monomeer verplaatsen de verlaten groep (dat wil zeggen 2-methylimidazole), en vormen een nieuwe phosphodiester bond. Deze RNA kopiëren chemie vereist een hoge concentratie van Mg2 +, die worden in chelaatvorm moet te compatibel met vetzuur protocells. 6 een ander Mg2 +-afhankelijke reactie is dat gekatalyseerd door de hammerhead Ribozym, dat is misschien het beste gekarakteriseerd katalytische RNA. Deze Ribozym, die twee korte oligonucleotides kan worden aangemaakt, voert een zelf-decollete reactie die handig is om te controleren door een verschuiving van de gel. Als zodanig, is het vaak werkzaam als een model-Ribozym in oorsprong-van-leven studies. 7 als gevolg van een eis door deze Ribozym voor unliganded magnesium, liposomen zijn meestal gebouwd door een mengsel van vetzuren en glycerol esters van vetzuren, die meer stabiel aan magnesium. 8 , 9 in dit protocol presenteren we technieken die wij hebben ontwikkeld voor de voorbereiding, de manipulatie, de karakterisering van deze blaasjes en demonstreren van de toepassing van deze blaasjes als protocells host niet-enzymatische RNA kopiëren en hammerhead Ribozym katalyse.
Protocol
1. vesikel voorbereiding
-
Voorbereiding van dunne lagen
- Gebruiken gas strakke spuiten voor het overbrengen van bepaalde hoeveelheid lipiden, zoals beschreven in tabel 1.1 met chloroform in een glazen ampul.
- Damp de oplossing onder een stroom van stikstof of argon in de zuurkast.
- De resulterende dunne film onverminderd huis vacuüm voor ten minste 2 uur te verwijderen alle residuen van chloroform. De lipide kan worden overgelaten onder drukvermindering 's nachts op dit punt.
-
Rehydratie van blaasjes
- Bereiden 10 mL 5 mM calceïne 250 mM tris-HCl pH 8,0 hydratatie buffer door ontbinding 31 mg calceïne poeder in 2.5 mL 1 M tris-HCl pH 8,0 buffer en toevoeging van een andere 7,5 mL gedeïoniseerd water (DI).
- Pipetteer 250 µL van boven hydratatie buffer in een lege buis en 1.875 µL van 10 M NaOH voor een definitieve 75 mM base (½ equivalent van de totale vetzuren) toe te voegen. Breng de oplossing over de dunne film van droge lipide naar formulier blaasjes met een totale vetgehalte van 0,15 M.
- Gebruik snelle (> 3000 rpm) vortexer naar vortex het resulterende mengsel voor 4-5 s.
- Laat het mengsel van lipide-buffer op een lage snelheid (ca. 30 rpm) roterende shaker te hydrateren, tenminste 's nachts.
-
Dimensionering van blaasjes (optioneel)
- Met pincet, het toepassen van één filterondersteuning op elke binnenzijde van de spuit-poorten van de extruder.
- NAT elke filterondersteuning met 250 mM tris-HCl, pH 8.
- Gebruik pincet, één track-geëtst 100 nm polycarbonaat membraan van toepassing op een van de extruder O-ringen en filter ondersteunt. Verzorgen om niet scheuren of perforaties van het membraan, duw voorzichtig het membraan in de O-ring zodat goed contact tussen de twee oppervlakken.
- Monteren van de extruder, verzorgen niet te verdrijven het membraan en filter ondersteunt.
- Vul een extruder-spuit met ca. 0,5 mL 250 mM tris-HCl, pH 8. Deze spuit invoegen op één zijde van de extruder.
- Plaats een lege spuit in de andere kant van de extruder.
- Duw de plunjer van de injectiespuit met buffer langzaam (≤ 50 µL/s) met de hand, en controleer dat weerstand wordt gevoeld, die aangeeft dat het track-geëtst membraan is op zijn plaats en intact. Het is handig om te oefenen deze stap zonder een membraan in plaats om te meten van het verwachte niveau van resistentie.
- Verwijder en leeg de twee spuiten. Het is niet nodig om de twee spuiten in dit stadium schoon omdat ze buffer van identieke samenstelling aan de voorbereiding van de liposomen bevatten.
- Laad de liposomen voorbereiding in een van de twee spuiten.
- Monteer de extruder met spuit met blaasje monster aan de linker kant en lege spuit op de rechterkant.
- Duw de plunjer van de injectiespuit met blaasje monster heel langzaam (10-25 µL/s) met de hand.
- Zorgvuldig observeren de spuit op de rechterkant van de extruder; duidelijke buffer treedt aanvankelijk aan de rechterkant van de extruder (ca. 50 µL, dit is verschuldigd aan de innerlijke dode volume van de extruder), gevolgd door een kleine pluim van geëxtrudeerde liposomen. Onmiddellijk stoppen op dit punt te duwen, verwijder de spuit op de rechterkant van de extruder en negeren van deze oplossing.
- Vervangen van de spuit op de rechterkant van de extruder en extruderen totdat de linker spuit leeg is.
- Omkeren van de richting van de extruder en herhaal stap 13. Blijven voor het gewenste aantal cycli (meestal 7, 9 of 11); een oneven getal wordt altijd gebruikt om ervoor te zorgen dat VN-geëxtrudeerde liposomen niet worden verzameld uit de spuit in eerste instantie met de voorbereiding van de liposomen pre inkrimping.
- Zachtjes afzien van de inhoud van de juiste spuit in een buis Eppendorf en plaats de buis op een lage snelheid (ca. 30 rpm) roterende shaker ongeveer 0.5 uur.
- Doorgaan met de zuivering van het vesikel, zoals beschreven in sectie 2. Geëxtrudeerde blaasjes moeten worden gebruikt binnen de 24u of opnieuw warm geperst voordat de volgende keer gebruikt.
2. vesikel zuivering
-
Voorbereiding van het vesikel zuivering mobiele fase
- Bereiden 5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hydratatie buffer door toevoeging van 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 buffer, 3,75 milliliters DI water tot een 15 mL Falcon buis. Voeg vervolgens 37,5 µL van 10 M NaOH (½ equivalent van base ten opzichte van unesterified vetzuur) aan de hydratatie-buffer. Pipetteer 235 µL van pure oliezuur rechtstreeks in de buis van de Falcon als gevolg van een blaasje oplossing met 0,15 M totale lipiden.
- Gebruik snelle (> 3000 rpm) vortexer naar vortex het mengsel voor 4-5 s, vervolgens droogtrommel op een lage snelheid roterende shaker voor ten minste 2 uur. Het lipide-preparaat kan worden verlaten 's nachts op de roterende shaker op dit punt. Het filteren van de mobiele fase door 0,22 μm spuit filter eenheid vóór gebruik te verwijderen elke potentiële aggregaten.
-
Zuivering van blaasjes op Sepharose
- Ca. 5 mL ethanolbevattend Sepharose 4B drijfmest uit de fles met behulp van een precisiepipet verwijderen. Dit toepassen op een wegwerp 10 mL chromatografie-kolom.
- Toestaan dat de drijfmest te regelen en ethanol doorstroming tot ethanol boven aan het bed van de hars benaderingen.
- Toepassen van 5 mL gedeïoniseerd water tot de bovenkant van de hars en laat doorstroomtest ethanol residu wegwassen.
- Toepassen van 250 mM tris-HCl, pH 8 in 1-2 mL porties naar de top van de hars, toepassing van een nieuwe gedeelte telkens het vloeistofniveau de bovenkant van het bed van de hars benadert. Herhaal dit voor 3 - 5 keer.
- Klem de kolom op de retort-stand en sluit vervolgens het uiteinde van de kolom met afsluiter connector en buizen aan de breuk-verzamelaar. Voeg een ander deel van de buffer leegmaken van de slang, de afsluiter te sluiten wanneer het vloeistofniveau in kolom nadert de bovenkant van de hars.
- De geëxtrudeerde blaasjes van sectie 1 toepassen op de bovenkant van de hars met behulp van een pipet 200 µL, verzorgen de vesikel voorbereiding zo gelijkmatig mogelijk om op te passen de hars zonder te raken de hars bed of kolom muur.
- Open de afsluiter om te beginnen de stroom en beginnen met het verzamelen van breuken in een 96-wells-plaat. Vesikel zuivering mobiele fase toepassen op de bovenkant van het bed van de hars in 0,5-1 mL porties als de buffer uitput, verzorgen niet zodat het bed van de hars te drogen. Verzamelen in vijf neerzetten breuken, het verzamelen van ten minste 36 wells (drie rijen van een 96-wells-plaat).
-
Karakterisering van de fluorescentie van zuivering breuken
- Neem de 96-wells-plaat uit de vorige sectie en lees het op een afleesapparaat (λex= 485 nm, λem= 515 nm).
- De resulterende fluorescentie gegevens uitzetten als fluorescentie vs. breuk nummer. Blaasjes Elueer eerst, gevolgd door de unencapsulated fractie (Figuur 1).
-
Repurification van blaasjes vesikel lekkage controleren
- Herhaal de stappen van de zuivering en karakterisering in secties 2.2 en 2.3. Blaasjes die hebben behouden hun inhoud zal vertonen geen piek van unencapsulated opgeloste stof (of een zeer kleine transactie van ca. 5-10% van de intensiteit van het vesikel piek).
3. gebruik van blaasjes in het bijzijn van Magnesium
-
Gebruik van unliganded magnesium
- Bereiden en te zuiveren van blaasjes, zoals beschreven in de punten 1, 2.1 en 2.2.
- Bereiden 1 mL 50 mM 250 mM tris-HCl pH 8,0 buffer oplossing MgCl2 door toevoeging van 250 µL van 1 M tris-HCl pH 8,0 buffer en 50 µL van 1 M MgCl2 tot 700 µL van DI water. Vortex te goed mengen.
- Om de gewenste magnesium concentratie van 5 mM, meng 0,9 mL van gezuiverde blaasjes en 100 µL van magnesium oplossing en roer snel om te minimaliseren van de verstoring van het vesikel door voorbijgaande Gasbedwelming met behulp van blaasjes hoge plaatselijke concentratie van magnesium.
Opmerking: Snelle mengen van magnesium oplossing is cruciaal voor vesikel stabiliteit. Als magnesium en blaasjes zijn niet snel gemengd door onmiddellijke vortexing, zullen sommige blaasjes worden blootgesteld aan hogere concentraties van magnesium, resulterend in inconsistente resultaten van steekproef om steekproef. - Laat het blaasje monster op een tuimelaar voor ten minste 30 minuten vóór repurification zoals beschreven in punt 2.4 om te controleren op lekkage van de inhoud. Dezelfde concentratie van magnesium zoals vesikel monster toevoegen aan de mobiele fase van repurification.
-
Gebruik van liganded magnesium
- Bereiden en te zuiveren van blaasjes, zoals beschreven in de punten 1, 2.1 en 2.2.
Opmerking: Gebruik ½ gelijkwaardig KOH in plaats van NaOH te deprotonate vetzuren; het is gebleken dat dit stabieler liposomen in chelaatvorm MgCl2 -systemen oplevert. - Bereiden van 2M kalium citraatoplossing en breng pH op 8.0 met KOH.
- Meng MgCl2 en kalium citraat op de opgegeven verhouding (ca. 1:4 voor stabiele oliezuur blaasjes) in 250 mM tris-HCl pH 8,0 buffer.
- Voeg voorgemengde magnesium citraatoplossing aan het blaasje monster, kort vortex.
Opmerking: Meng altijd magnesium en ligand oplossing. Nooit bloot blaasjes unchelated magnesium oplossing alleen. - Laat het blaasje monster op een tuimelaar voor ten minste 30 minuten vóór repurification zoals beschreven in punt 2.4. Voeg dezelfde concentratie van magnesium en citraat net als in het vesikel monster aan de mobiele fase van repurification.
- Bereiden en te zuiveren van blaasjes, zoals beschreven in de punten 1, 2.1 en 2.2.
4. niet-enzymatische RNA kopiëren in blaasjes
-
Voorbereiding van monodispers RNA ingekapseld blaasjes
- Een droge oliezuur film bereiden zoals beschreven in paragraaf 1.1.
- Bereiden vesikel rehydratie buffer met 50 µM fluorescerende gelabelde RNA primer, 150 µM RNA sjabloon en 250 mM tris-HCl pH 8.0 met ½ gelijkwaardig KOH ten opzichte van oliezuur.
- 250 µL van rehydratie buffer aan de lipide-film toevoegen en volg stap 1.2.2 en 1.2.3 te maken van de blaasjes met totale vetgehalte van 0,15 M.
- Volg om kleine unilamellar monodispers blaasjes, punt 1.3 voor vesikel extrusie.
-
Magnesium-citraat toevoeging en vesikel zuivering
- Meng magnesium en citraat voorraden, en meng dit met het blaasje monster tot een definitieve lipide concentratie van 0,1 M.
- Zuiveren van blaasjes op Sepharose 4B uitsluiting kolom grootte met 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0,1 M lipiden en magnesium en citraat als mobiele fase.
- Verzamelen vesikel breuken door volgende punt 2.3.
-
Primer extensie reactie
- Bereiden van 200 mM 2-MeImpG (calciumguanosine 5'-monofosfaat 2-methylimidazolide)-stockoplossing met 250 mM tris-HCl pH 8,0. (Opmerking: Volg vorige protocol10 voor 2-MeImpG synthese gepubliceerd.)
- Breng 150 µL van 2-MeImpG-stockoplossing te bereiken een eindconcentratie van lipide-75 mM en 50 mM 450 µL vesikel steekproef te initiëren primer extensie reactie geactiveerd monomeer. Start de timer en houd de reactie proeven tuimelen van de hele tijd.
- (Optioneel) Voor het voederen van dieren continu verse monomeer, overdracht van 300 µL van een kamer van een lab gebouwd klein-volume liposoom dialyzer11 reactie oplossing en put 300 µL voederen oplossing in de andere kamer. De voeding oplossing moet alle ingrediënten in de dezelfde concentratie zoals in de reactie-oplossing, met uitzondering van vervanging van RNA met blaasjes met lege blaasjes bevatten. Elke ronde van dialyse neemt 1-24 uur, afhankelijk van de analyt en de membraan gebruikt.
- Voor kinetische studies, neem een 100 µL aliquoot op elk tijdstip, en repurify van het monster door een kolom voor uitsluiting van Sepharose 4B grootte met 250 mM tris-HCl pH 8,0 als de mobiele fase.
- Het verzamelen van het vesikel breuken in een tube van 1,5 mL eppendorf.
- Pipetteer Triton naar het blaasje breuken voor een finale ongeveer 0,1% v/v.
- Voeg 0,5 mL koude ethanol aan de buis en Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 2 uur.
- Centrifugeer alle monsters op 16.1 × 1000 rcf (16.1 × g) voor 10 min en zachtjes Pipet uit de vloeistoffen. Wash de RNA pellets met 70% koude ethanol en centrifuge weer voor 5 min. negeren de vloeistof en zet de buis met RNA pellets op een blok warmte 80 ° C gedurende 2 minuten te verdampen residuele ethanol. Los de korrels in 50 µL van 8 M ureum met 1xTBE laden buffer.
-
PAGINA analyse
- Bereiden van 20% pagina gel door het mengen van 200 mL van UreaGel systeem concentraat, UreaGel systeem verdunningsmiddel, 25 mL 25 mL 10xTBE buffer, 80 µL van TEMED en 250 mg ammonium persulfate. Giet het mengsel van de gel tussen geklemd gel platen (35 cm × 45 cm) en snel invoegen de kam. Wacht minstens 30 min tot volledige polymerisatie.
- Monteren van de plaat van de gel op de stand van de gel en de gel vakken vullen met 1xTBE gel met buffer. Uittrekken van de kam en de putjes met spuit spoelen. De gel met 60 W voor 30 min vooraf worden uitgevoerd.
- Verwarm de monsters op de warmte blok van 80 ° C gedurende 2 minuten en 5 µL van elk monster per putje laden.
- Zet gel elektrobox en selecteer gel met constante watt bij 60 W gedurende 2,5 uur.
- Demonteren van de gel-plaat uit de gel-stand, veeg het glas schoon en zet de hele plaat in gel scanner om te beginnen met het scannen van de gel.
- De gel met ImageQuant TL 1D analyse te kwantificeren. Uitzetten van de natuurlijke logaritme van de verhouding tussen de hoeveelheid primer resterende op een bepaald tijdstip aan het aanvankelijke bedrag van primer vs. tijd, passen op een lijn en berekenen van de pseudo-eerste orde reactiesnelheid (Figuur 2).
5. hammerhead RNA zelf decollete in blaasjes
- Voorbereiding en reiniging van Ribozym ingekapseld in blaasjes
- Bereiden van een dunne film van lipide (OA: GGO = 9:1) zoals in punt 1.1 met onderdelen als in tabel 1.2. Opmerking: warme GGO ten minste 60 ° C voor het smelten van de volledige alvorens te gebruiken.
- Bereiden vesikel rehydratie buffer met 5 µM van elke hammerhead Ribozym strand en 250 mM tris-HCl pH 8,0.
- 250 µL van rehydratie buffer aan de lipide-film toevoegen en volg stap 1.2.2 en 1.2.3 te maken blaasjes met 0,15 M totale vetgehalte.
- Volg om kleine unilamellar monodispers blaasjes, punt 1.3 voor vesikel extrusie.
- Zuiveren van blaasjes op een Sepharose 4B uitsluiting kolom grootte met 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0,15 M gemengd lipiden als mobiele fase.
-
Hammerhead Ribozym zelf-decollete reactie
- Bereiden van magnesium oplossing en meng met gezuiverde blaasjes zoals beschreven in sectie 3.1 tot de reactie van de zelf-decollete.
- Voor kinetische studies, neem 100 µL van het mengsel op elk tijdstip en rechtstreeks repurify dit monster door een kolom voor uitsluiting van Sepharose 4B grootte met 250 mM tris-HCl pH 8,0 als mobiele fase. Het verzamelen van het vesikel breuk.
-
PAGINA analyse
- Stappen 4.3.6 aan 4.3.8 ter voorbereiding van RNA laden monster.
- Commercieel gegoten 15% TBE-ureum gel in gel vak plaatsen en vul het vak gel met 1xTBE gel met buffer.
- Verwarm de monsters op 80 ° C warmte blok voor 1 min en laden 5 µL van elk monster per putje.
- Voer de gel met constante 200 V gedurende ongeveer 1 uur.
- Scan de gel.
- Kwantificeren van de gel met een analysesoftware, zoals ImageQuant TL 1D, voor het meten van de omvang van splijten door het vergelijken van de intensiteit van de resterende substraat RNA band en gekloofd RNA fragment band (Figuur 3).
6. reus vetzuur blaasjes voor microscopie
-
Voorbereiding van gigantische vetzuur blaasjes
- Volg punt 1.1 en 1.3 van de tabel voor te bereiden op een dunne film van oliezuur met 0,2 mol % van fluorescently geëtiketteerde lipide beter membraan observatie.
- Hydrateren lipide film met 500 µL 250 mM tris-HCl pH 8,0 om het blaasje monster 10 mM lipiden in totaal. De buffer kan bevatten fluorescente kleurstoffen of molecules van RNA indien gewenst. Laat vesikel monster tumbling's nachts.
- Bereid 150 mL pure vetzuur dialyse buffer met 10 mM totale lipiden door het mengen van 470 µL van oliezuur en 150 mL 250 mM tris-HCl pH 8.0 met ½ equivalent NaOH.
- Extruderen van het vesikel monster door een 10 µm polycarbonaat membraan te verwijderen van de grote aggregaten.
- Breng het blaasje monster in 1 µm groot-porie dialyse cassette, zoals hiervoor is beschreven. 12
- Plaats de cassette dialyse in een bekerglas van 100 mL met 30 mL dialyse buffer. Agitate het bekerglas zachtjes op een tafelblad shaker van 80-100 toeren per minuut.
- Het wijzigen van de dialyse buffer elke 30 min. voor 5 keer om vrije kleurstoffen of RNA en kleine blaasjes te verwijderen.
- Verwijder voorzichtig het blaasje monster van de cassette van de dialyse met een spuit en overdracht aan een Eppendorf buis.
-
Observatie van de microscopie
- Pipetteer 10 µL van blaasjes op een schoon standaard microscoopglaasje en een glas cover slip plaats boven het monster. Afdichten van cover glazen met doorzichtige nagellak.
- De blaasjes met een 60 X olie-dispersie of soortgelijk doel observeren door confocale microscopie met behulp van de juiste laserbron voor fluorescently-geëtiketteerden membraan, RNA of encapsulated kleurstof (Figuur 4).
Representative Results
Wij voeren meestal liposoom zuivering op grootte-uitsluiting kolommen. Typische liposoom bereidingen bevatten een fluorophore van een soort. Wanneer liposomen zijn gegenereerd en geëxtrudeerd, zijn de doelsoorten worden ingekapseld aanwezig zowel binnen als buiten de liposomen. Door het zuiveren liposomen op een grootte-uitsluiting hars (Sepharose 4B), blijven unencapsulated opgeloste stoffen behouden in de poriën van de hars, terwijl de grotere liposomen niet zijn en elueer eerste (figuur 1A). Verzamelen van breuken en uitzetten van fluorescentie vs. breuk nummer (figuur 1B) meestal levert een twee-piek spoor, door de vroege-eluerende breuken die overeenkomt met de liposomen, die vervolgens worden verzameld en gebruikt voor volgende toepassingen.
We onderzoeken vaak nonenzymatic primer extensie reacties, die waarschijnlijk middel van RNA replicatie vóór de opkomst van Ribozym en op basis van eiwitten RNA polymerase waren. Deze reacties gebruiken meestal een fluorescently geëtiketteerde primer (figuur 2A), die is uitgebreid door geactiveerde monomeren. Deze reacties kunnen worden gecontroleerd door de Elektroforese van het gel (figuur 2B) en de resulterende electropherograms integreert met het verkrijgen van de snelheidsconstanten voor een bepaalde reactie aandoening (figuur 2C).
Om aan te tonen dat RNA binnen protocells functioneren kan, hanteren wij hammerhead Ribozym zelf-splitsingsproducten (figuur 3A) als een model RNA katalytische reactie. Deze reactie is gratis Mg2 + om katalyse nodig, en daarom gebruikten we OA/GGO blaasjes omdat ze stabiel in aanwezigheid van 5 mM Mg2 zijn +. Gelijkaardig aan primer extensie reacties, de hammerhead Ribozym zelf-decollete reactie kan ook worden gecontroleerd door de Elektroforese van het gel (figuur 3B) en later geanalyseerd om te verwerven van de constant onder bepaalde voorwaarden (Figuur 3 c).
We beeld liposomen met beide fluorescentie en uitgezonden licht. Liposomen kunnen gelabeld zijn met behulp van fluorescerende lipiden, die geven een membraan label (figuur 4A), of met behulp van een fluorescerende stof binnen hun lumen (figuur 4B). Doorvallend licht kan ook worden gebruikt om te observeren blaasjes (ook getoond in figuur 4B).
| Tabel 1.1 pure oliezuur in chloroform | |||
| Component | Voorraad | Bedrag | |
| Oliezuur | > 99% | 11.7 ΜL | |
| Chloroform | 1 mL | ||
| Tabel 1.2 oliezuur en Glycerolmonooleaat (9:1) in chloroform | |||
| Component | Voorraad | Bedrag | |
| Oliezuur | > 99% | 10.5 ΜL | |
| Glycerolmonooleaat | > 99% | 1.4 ΜL | |
| Chloroform | 1 mL | ||
| Tabel 1.3 oliezuur met Rhodamine-PE 0.2mol% in chloroform | |||
| Component | Voorraad | Bedrag | |
| Oliezuur | > 99% | 1.6 ΜL | |
| Rhodamine-PE in chloroform | 10 mM | 20 ΜL | |
| Chloroform | 1 mL | ||
Tabel 1. Vetzuur chloroform oplossingen.
Figuur 1. Vesikel zuivering en fluorescentie karakterisatie van Fractie zuivering. A. scheiding van blaasjes met calceïne van gratis calceïne op een Sepharose 4B kolom. B. blaasje en gratis calceïne peak detectie door het uitzetten van de fluorescentie in elk putje vs. goed nummer na breuk collectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Niet-enzymatische RNA replicatie binnen OA blaasjes. A. regeling voor niet-enzymatische RNA primer extension. B. pagina-afbeelding van een primer extensie reactie binnen pure oliezuur blaasjes, met voorwaarden zoals in punt 4. C. lineaire pasvorm van de natuurlijke logaritme van de verhouding tussen de hoeveelheid primer resterende op gegeven tijdstip aan het aanvankelijke bedrag van primer vs. tijd meer dan 30 h. reactiesnelheid, berekend op basis van de helling van ln (P/P0) vs tijd, 0,058 h-1is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Hammerhead Ribozym decollete in OA/GGO blaasjes. A. schema van hammerhead Ribozym splitsing van fluorescently geëtiketteerde substraat strand (boven). B. paginabeeld van hammerhead Ribozym decollete binnen OA/GGO blaasjes met 5 mM Mg2 +. C. de activiteit van de Ribozym binnen de blaasjes. Lineaire pasvorm van de natuurlijke logaritme van de verhouding tussen de hoeveelheid substraat nog altijd gegeven tijdstip tarief, berekend op basis van de helling van ln (S/S0) vs tijd, is het aanvankelijke bedrag van substraat vs. tijd in eerste 4 h. reactie 0,36 h-1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Reuze vetzuur blaasjes voor microscopie. A. confocale microscopie afbeelding van een PE Rhodamine label oliezuur blaasje, schaal bar 10 μm. B. confocale microscopie beeld van oliezuur blaasje met Alexa488 label RNA met membraan komt te staan in verzonden detector (TD) kanaal, schaal bar 5 μm.
Discussion
Liposomen gevormd uit vetzuren hebben gesuggereerd door velen als mogelijke modellen voor primitieve cellen vanwege hun hoge permeabiliteit en dynamische eigenschappen. De carboxylic hoofd groep van één keten vetzuren kan alleen zelf-assemblage aan membranen in een beperkte pH-bereik en de resulterende membranen zijn heel gevoelig voor de aanwezigheid van zouten. Dientengevolge, vereisen vetzuur blaasjes verschillende voorbereiding en behandeling methoden vergeleken met fosfolipide blaasjes.
In dit protocol, hoewel we oliezuur gebruiken als een voorbeeld voor de vorming van de liposomen, andere lange keten onverzadigde vetzuren (C14) en derivaten daarvan (ca. myristoleic zuur, Palmitoleïnezuur en de overeenkomstige alcoholen en glycerol-esters) vormen ook blaasjes na de dunne film rehydratie methode, zolang het totale vetgehalte boven de cmc en de pH van de buffer hydratatie is ligt dicht bij de pKa van de vetzuren in het membraan. Andere dan tris-HCl buffer in dit protocol gebruikt, werden andere systemen van de buffer (ca. bicine, fosfaat, boraat) gemeld bij het vetzuur vesikel vorming, hoewel blaasjes gevormd in fosfaat of boraat buffer meestal vrij lekke13 zijn. De resulterende vetzuur blaasjes na rehydratie zijn polydisperse en multilamellar, maar gemakkelijk worden omgezet in kleine monodispers unilamellar blaasjes door extrusie zoals beschreven. In vergelijking met ultrasoonapparaat als een alternatieve methode voor het genereren van kleine blaasjes, biedt extrusie meer opties voor de controle van de grootte van het vesikel door verschillende porie grootte membranen toe te passen. Blaasjes na extrusie zijn meestal iets groter dan de poriegrootte van het membraan, maar door het verhogen van het aantal cycli van de extrusie, blaasjes met een smaller grootteverdeling en een gemiddelde grootte dichtbij de poriegrootte van het membraan kunnen worden verkregen.
Om functionele protocells synthetiseren, moeten vetzuur blaasjes host specifieke biochemische reacties ten gevolge van de inkapseling van RNA of andere bouwstenen. De dunne film rehydratie methode biedt een gemakkelijke manier om vorm blaasjes met gewenste ingekapselde materialen. Echter de efficiëntie van de inkapseling is relatief laag, en een groot deel van kostbare materialen zoals RNA zijn meestal verloren tijdens het zuiveringsproces. In sommige gevallen kan de efficiëntie van de inkapseling bescheiden worden verbeterd door herhaalde bevriezen-ontdooien cycli voor extrusie. Microfluidic methoden voor de bereiding van de hoge opbrengst van fosfolipide liposomen toestaan voor bijna 100% inkapseling efficiëntie, maar soortgelijke methoden hebben nog geen ontwikkeld voor vetzuur blaasjes.
Wanneer behandeling protocells met chelaatvormige of gratis Mg2 +, zuivering na magnesium oplossing optellen en repurification voordat elk tijdstip zorgt voor de verwijdering van gelekte ingekapseld materialen die van invloed kan zijn op de nauwkeurigheid van de reactiesnelheid metingen binnen de blaasjes. Aangezien elke reiniging ten minste 10 min duurt om goede scheiding en voor het verzamelen van vesikel breuken, de analyse van snelle reacties is moeilijk, en de reactie moet worden gestopt voordat de kolom repurification.
Het protocol dat wij hier presenteren is geschikt voor de bouw van vetzuur liposomen die host zijn van reacties die in primitieve cellen optreden kunnen na te bootsen. Onze protocollen inschakelen ook potentiële toepassingen in de ontwikkeling van biomedische toedieningssystemen en bioreactoren voor andere biochemische reacties.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
J.W.S. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie (290363) van de Stichting Simons J.W.S. Zowel A.E.E. als K.P.A. erkentelijk voor steun van de Universiteit van Minnesota opstarten middelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
| calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
| tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
| citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
| sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
| potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
| oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
| glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
| Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
| magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
| sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
| 15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
| urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
| titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
| RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
| RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
| hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
| hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
| vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
| fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
| 96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
| plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
| confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
| gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |
References
- Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
- Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
- Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
- Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
- Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
- Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
- Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
- Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
- Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
- Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009 (2009).
- Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).
