Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

doi: 10.3791/57324 Published: February 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Lipozomlar tek Zincirli amphiphiles içeren, özellikle yağ asitleri, sergi farklı özellikleri nedeniyle tek zincir amphiphiles benzersiz kimyasal özelliklerini içeren bu diacylphospholipids göre. Burada hazırlık, arıtma ve kısmen oluşan lipozomlar kullanımı ya da bu amphiphiles bütün teknikleri açıklar.

Abstract

Lipozomlar tek Zincirli amphiphiles içeren, özellikle yağ asitleri, diacylphospholipids nedeniyle bu amphiphiles benzersiz kimyasal özelliklerini içeren göre farklı özellikler sergiler. Özellikle, yağ asidi lipozomlar tek Zincirli amphiphiles nispeten yüksek çözünürlük nedeniyle dinamik karakter geliştirmek. Benzer şekilde, serbest yağ asitleri içeren lipozomlar daha metal iyonları ve karboksilik asit kafa grupları arasındaki güçlü etkileşim nedeniyle tuz ve divalent kasyonları duyarlıdır. Burada hazırlık, arıtma ve kısmen oluşan lipozomlar kullanımı ya da tek zincir amphiphiles (örneğin, oleik asitleri) bütün teknikleri göstermektedir.

Introduction

Lipozomlar veya veziküller – amfifilik lipidler oluşan bilayer membranlar tarafından kapsanan bölmeleri - kullanımı çok sayıda Biyomedikal uygulamalarda teslimat araçlar için ilaç, hücre zarı, modelleri ve sentetik gelişimi için bulduk hücreleri. Aynı zamanda biz ve diğerleri lipozomlar ilkel hücre zarlarında erken yaşam modelleri olarak istihdam. 1 , 2 , 3 , 4 genellikle, tür sistemlerde, bu moleküller modern hücreleri istihdam kodlanmış protein enzimler parası olmadan sentezlemek basit olduğu gibi tek bir lipid hidrokarbon kuyruk (örneğin, oleik asit), içeren tek Zincirli amphiphiles kullanıyoruz.

Tek-zinciri lipidler oluşan lipozomlar diacylphospholipids kurulan benzer (örneğin, 1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine veya POPC) sınır bilayer zarı oluşur ki. Lipitler ya sınıfından oluşan lipozomlar çözünmüş yükü koruyabilirsiniz ve küçültme ve farklı tekniklerle saf. Birkaç önemli farklılıklar sonucu tek zincir lipidler benzersiz kimyasal özellikleri. Veziküller fosfolipitler tarafından kurulan bir geniş pH aralığında kararlı iken yağ asidi veziküller yalnızca belirli pH tampon için vezikül hazırlık gerektirir hafif temel için nötr pH (ca. 7-9), stabildir. Çoğu zaman, bu arabellek ya da işlevsel malzemeler (örneğin, RNA) olabilir vezikül kapsülleme için belirli çözünen molekülleri compartmentalized biyokimyasal reaksiyonlar veya basit floresan boyalar (örneğin, calcein-ebilmek da içermek ) vezikül karakterizasyonu için.

Sadece bir tek hidrokarbon zinciri varlığı hem daha geçirgen solutes için hem de daha dinamik bir membran üretir. Ayrıca, karboksilik asit baş grup yağ asitleri sonuçları tuz ve divalent katyonlar (örneğin, Mg2 +) varlığı daha hassas veziküller içinde mevcut. Magnezyum protocells hayat köken araştırmaları biyokimyasal reaksiyonlar kataliz için en önemli divalent katyonlar biridir. Sofistike protein enzimler, evrimi önce erken yaşamda RNA baskın polimer, kendi kendini çoğaltmak ve kataliz gerçekleştirmek üzere çift kapasitesini nedeniyle olabilir. Magnezyum gerektiren bir RNA'ın bir temsilcisi örnek ile ilgili kopyalama, 1960'lı yıllarda ilk gösterdi enzimatik olmayan RNA tepkidir. 5 kimyasal olarak aktif RNA nükleotitler (Yani 2-methylimidazolide nukleotid) için önceden varolan bir astar şablon karmaşık bağladığınızda, astar 3'-hidroksil grubuna bitişik aktif bir monomer yerinden için 5'-fosfat saldırıları bırakarak grup (Yani 2-methylimidazole) ve formları yeni bir dizide bağ. Bu RNA kopyalama kimya yağ asidi protocells ile uyumlu olması için Şelatatlı gereken Mg2 +, yüksek bir konsantrasyon gerektirir. 6 başka bir Mg2 +-bağımlı tepkidir bu belki de en çok karakterize katalitik RNA olduğu çekiç ribozyme tarafından katalize. İki kısa oligonucleotides yeniden, bu ribozyme bir jel shift tarafından izlemek uygun bir self-bölünme tepki gerçekleştirir. Bu nedenle, bu sık sık hayat kaynağı çalışmalarda bir modeli ribozyme istihdam edilmektedir. 7 unliganded magnezyum için bu ribozyme tarafından bir gereklilik nedeniyle lipozomlar genellikle yağ asidi ve magnezyum için daha istikrarlı yağ asidi gliserin esterleri tarafından inşa edilir. 8 , 9 bu protokol için sunduğumuz hazırlama, işleme, bu veziküller karakterizasyonu için geliştirdik ve bu veziküller ana bilgisayar enzimatik olmayan RNA kopyalama ve çekiç kafa ribozyme için uygulama protocells olarak göstermek teknikleri kataliz.

Protocol

1. vezikül hazırlık

  1. İnce filmleri hazırlanması
    1. Gaz sıkı şırınga lipidler belirli miktarda bir cam şişede kloroform için Tablo 1.1 açıklandığı gibi aktarmak için kullanın.
    2. Azot veya duman başlıklı argon akışı altında elde edilen çözüm buharlaşır.
    3. Elde edilen ince film ev vakum en az 2 h herhangi bir kloroform artıklarını çıkarın için tabi. Lipid vakum altında bir gecede bu noktada bırakılabilir.
  2. Rehidrasyon veziküller
    1. 5 mM calcein 250 mM tris-HCl pH 8.0 hidrasyon arabellek 10 mL calcein tozu 1 M tris-HCl pH 8.0 arabellek 2.5 ml 31 mg eriterek ve başka bir 7.5 mL deiyonize (DI) su ekleyerek hazırlayın.
    2. Hidrasyon arabellek üstüne, 250 µL boş bir tüp içine pipet ve 1,875 µL son 75 mM taban için 10 M NaOH (Toplam yağ asitleri ½ eşdeğeri) ekleyin. Çözüm için formu veziküller kuru lipid ince film 0.15 M toplam lipid konsantrasyon ile aktarın.
    3. Kullanım yüksek hızlı (> 3000 d/d) vortexer girdap 4-5 s için elde edilen karışımı için.
    4. Lipid-tampon karışımı suyla temasa, en az bir gecede üzerinde bir düşük hızlı (ca. 30 rpm) dönen bir shaker bırakın.
  3. Boyutlandırma veziküller (isteğe bağlı)
    1. Cımbız kullanarak, bir filtre destek Ekstruder şırınga noktalarından iç her yüzey için geçerlidir.
    2. Her filtre desteği 250 mM tris ile ıslak-HCl, pH 8.
    3. Cımbız kullanarak, bir parça kazınmış 100 nm polikarbonat membran Ekstruder o-Ring birine uygulamak ve filtre destekler. Değil gözyaşı veya membran ponksiyon, yavaşça içine iki yüzey arasında iyi temas yapmak için O-ring membran itmek için dikkat çekici.
    4. Membran yerinden değil için dikkat çekici Ekstruder, montaj ve filtre destekler.
    5. Bir Ekstruder şırınga ile ca. 0,5 mL 250 mM tris doldurun-HCl, pH 8. Bu şırınga ekstruder bir tarafı yerleştirin.
    6. Boş bir şırınga Ekstruder öbür yerleştirin.
    7. Elle, arabellek içeren yavaş yavaş şırınga (≤ 50 µL/s) pistonu itmek ve direnç, yer ve sağlam parça kazınmış membran olduğunu belirten hissedilir doğrulayın. Direnç beklenen düzeyini ölçmek için bu adım olmadan bir membran yerde uygulaması yararlıdır.
    8. Kaldırmak ve iki şırınga boş. Aynı kompozisyon lipozom hazırlık için arabellek içerdiğinden, bu aşamada iki şırınga temizlemek gerekli değildir.
    9. Lipozom hazırlık iki şırınga birinin içine yerleştirin.
    10. Extruder Makinası vezikül örnek sol ve sağ tarafta boş şırınga içeren şırınga ile yeniden monte.
    11. El, vezikül örnek çok yavaş içeren şırınga (10-25 µL/s) pistonu itin.
    12. Ekstruder sağ tarafında şırınga dikkatle gözlemlemek; Açık arabellek başlangıçta Ekstruder sağ tarafında girin (ca. 50 µL, bu Ekstruder ölü iç hacmi nedeniyle), haddelenmiş lipozomlar küçük bir tüy tarafından takip. Hemen bu noktada itmeyi bırak, şırınga Ekstruder sağ tarafında kaldırmak ve bu çözüm atın.
    13. Şırınga Ekstruder sağ tarafında değiştirin ve sol şırınga boşalıncaya kadar bükün.
    14. Ekstruder yönünü tersine çevirmek ve 13 arasındaki adımları yineleyin. Devir (genellikle 7, 9 veya 11); istenilen sayıda için devam bir tek sayı her zaman un haddelenmiş lipozomlar başlangıçta öncesi küçülme lipozom hazırlık içeren şırıngadan toplanan değil emin olmak için kullanılır.
    15. Yavaşça bir Eppendorf tüp içine doğru şırınga içeriğini dağıtmak ve yaklaşık 0,5 h için bir düşük hızlı (ca. 30 rpm) dönen shaker tüpü yerleştirin.
    16. Vezikül arıtma ile Bölüm 2'de açıklandığı gibi devam edin. Haddelenmiş veziküller içinde 24 h kullanılan veya sonraki saat kullanmadan önce yeniden kalıptan çekilmiş.

2. vezikül arıtma

  1. Vezikül arıtma mobil faz hazırlanması
    1. 5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hidrasyon arabellek de 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 arabelleği, 3.75 mL DI su 15 ml Falcon tüp ekleyerek hazırlayın. Sonra 10 M NaOH 37,5 µL ekleyin (Bankası unesterified yağ asidi göre ½ eşdeğeri) hidrasyon arabellek. Doğrudan bir vezikül çözüm 0.15 M toplam lipidler ile sonuçlanan Falcon tüp içine saf oleik asitin 235 µL pipet.
    2. Kullanım yüksek hızlı (> 3000 devir/dakika) girdap karışımı 4-5 s için için vortexer sonra takla shaker en az 2 h için döner bir düşük hızlı üzerinde. Lipid hazırlık gecede üzerinde dönen shaker bu noktada bırakılabilir. Herhangi bir potansiyel toplamları kaldırmak için kullanmadan önce 0.22 mikron şırınga filtre ünitesi ile mobil faz filtre.
  2. Veziküller Sepharose üzerinde arıtma
    1. CA. 5 mL ethanolic Sepharose 4B Bulamaç de bir pipet kullanarak şişeden çıkarın. Bu bir tek kullanımlık 10 mL Kromatografi sütun için geçerli.
    2. Etanol reçine yatağın üst yaklaşımlar dek yerleşmeye Bulamaç ve etanol akışı aracılığıyla izin veremeyiz.
    3. 5 mL uygulayın reçine ve izin akış-etanol kalıntı silsin için aracılığıyla üst deiyonize su.
    4. 250 mM tris uygulamak-HCl, pH 8 ' 1-2 mL bölümleri yeni bir bölümü sıvı düzeyi reçine yatağın üstündeki yaklaşımlar her zaman uygulamak reçine, dön. Yineleme için 3 - 5 kez.
    5. Sütun imbik kürsüye kelepçe, ardından stopcock bağlayıcı ve boru kesir toplayıcı için sütun ucunu bağlayın. Tampon tüp floş, Sıvı düzey sütun reçine üst yaklaştığında stopcock kapatmak için başka bir bölümüne ekleyin.
    6. Haddelenmiş veziküller 200 µL pipettor kullanarak, vezikül hazırlık mümkün olduğunca eşit uygulamak için reçine reçine yatak veya sütun duvar dokunmadan için dikkat çekici reçine üst bölüm 1 uygulamak.
    7. Akışını başlamak ve kesirler bir 96-şey plaka toplamaya başlamak için stopcock açın. 0.5-1 reçine yatakta üstündeki vezikül arıtma mobil faz uygulamak mL porsiyon arabellek depletes, reçine yatak kurumasına izin vermemek için dikkat çekici gibi. En az 36 wells (96-şey plaka üç sıra) toplama beş bırak kesirler içinde toplamak.
  3. Arıtma kesirler Floresans karakterizasyonu
    1. 96-şey plaka önceki bölümden almak ve bir plaka okuyucu okumak (λex485 = nm, λem515 = nm).
    2. Floresans kesir sayısı vs olarak elde edilen floresan verileri çizmek. Veziküller elute önce unencapsulated kısmı (şekil 1) tarafından takip.
  4. Veziküller vezikül sızıntı izlemek için repurification
    1. Bölüm 2,2 ve 2.3 arıtma ve karakterizasyonu adımlarını yineleyin. İçeriklerini berraklığını veziküller unencapsulated çözünen (ya da çok küçük bir vezikül en yüksek yoğunluk yaklaşık 5-%10) hiçbir zirvesine sergileyecek.

3. veziküller magnezyum huzurunda kullanımı

  1. Unliganded magnezyum kullanımı
    1. Hazırlamak ve veziküller 1, 2,1 ve 2,2 bölümlerinde açıklandığı gibi arındırmak.
    2. 50 mm MgCl2 çözüm içinde 250 mM tris-HCl pH 8.0 tampon 1 mL 1 M tris-HCl pH 8.0 arabelleği 250 µL ve 1 M MgCl2 50 µL DI 700 µL için ekleyerek su hazırlamak. Girdap iyice karıştırın.
    3. 5 mM istenen magnezyum konsantrasyon vermek, 0.9 mL saf veziküller ve 100 µL magnezyum çözüm mix ve hızla geçici veziküller maruz magnezyum yüksek yerel konsantrasyon vezikül kesintileri en aza indirmek için heyecan.
      Not: Magnezyum çözümü hızlı karıştırma vezikül istikrar için önemlidir. Magnezyum ve veziküller hızlı bir şekilde hemen vortexing tarafından karışık değil, bazı veziküller içinde tutarsız sonuçlar örnek örnek sonucu magnezyum, daha yüksek konsantrasyonları maruz kalacağı.
    4. 2.4 içeriği sızıntı için kontrol etmek için açıklandığı gibi bir bardak için en az 30 dk önce repurification vezikül örnek çıkarma. Magnezyum vezikül örnekteki gibi aynı yoğunlukta repurification mobil faz ekleyin.
  2. Liganded magnezyum kullanımı
    1. Hazırlamak ve veziküller 1, 2,1 ve 2,2 bölümlerinde açıklandığı gibi arındırmak.
      Not: ½ eşdeğer KOH NaOH yerine deprotonate yağ asitleri için kullanın; Bu Şelatatlı MgCl2 sistemlerinde daha istikrarlı lipozomlar üretir bulundu.
    2. 2 M potasyum sitrat çözüm hazırlamak ve pH 8,0 KOH ile ayarlayın.
    3. MgCl2 ve potasyum sitrat belirtilen oranında (ca. 1:4 için kararlı oleik asit veziküller) 250 mM tris-HCl pH 8.0 arabelleği premix.
    4. Premix Magnezyum sitrat çözüm vezikül örnek, kısaca girdap ekleyin.
      Not: Her zaman magnezyum ve ligand çözüm premix. Unchelated magnezyum çözüm yalnız veziküller pilleri.
    5. 2.4 açıklandığı gibi bir bardak için en az 30 dk önce repurification vezikül örnek çıkarma. Magnezyum ve sitrat vezikül örnekteki gibi aynı konsantrasyon repurification mobil faz ekleyin.

4. non-enzimatik RNA veziküller içinde kopyalama

  1. Monodisperse RNA hazırlanması veziküller kapsüllenmiş
    1. Bir kuru oleik asit film 1.1 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.
    2. Vezikül rehidrasyon arabellek 50 µM floresan etiketli RNA astar ile 150 µM RNA şablonu ve 250 mM tris-HCl pH ½ eşdeğer KOH göre oleik asit içeren 8.0 hazırlayın.
    3. Rehidrasyon arabelleği 250 µL lipid video eklemek ve takip adım 1.2.2 ve veziküller toplam 0.15 M lipid konsantrasyon ile yapmak 1.2.3.
    4. Küçük unilamellar monodisperse veziküller yapmak için bölümü 1.3 vezikül ekstrüzyon için izleyin.
  2. Magnezyum sitrat toplama ve vezikül arıtma
    1. Magnezyum ve sitrat stokları premix ve bu son lipid konsantrasyonu 0.1 m vezikül örnek ile karıştırın.
    2. Veziküller Sepharose 4B boyutu dışlama sütun, 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.1 M lipidler ve Magnezyum sitrat mobil faz olarak verilen arındırmak.
    3. Vezikül kesirler ile aşağıdaki bölüm 2.3 toplamak.
  3. Astar uzantısı tepki
    1. 200 mM 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile 2-MeImpG (guanozin 5'-monofosfattır 2-methylimidazolide) hisse senedi çözüm hazırlamak. (Not: takip önceki 2-MeImpG sentezi için protokol10 yayınlandı.)
    2. Astar uzantısı reaksiyonu başlatmak için 450 µL vezikül örnek için 75 mM lipid ve 50 mM aktif monomer son bir konsantrasyon ulaşmak için 2-MeImpG hisse senedi çözüm 150 µL aktarın. Örnek sayacı ve tutmak tepki her zaman yuvarlanan Başlat.
    3. (İsteğe bağlı) Sürekli taze monomer beslenmesi için 300 µL tepki çözüm bir odasına bir laboratuar inşa küçük hacimli lipozom dialyzer11 ve çözüm diğer odasında besleme yerine 300 µL aktarın. Besleme çözüm veziküller boş veziküller ile içeren RNA değiştirme dışında tepki çözüm olduğu gibi aynı konsantrasyonu, tüm malzemeyi içermelidir. Diyaliz her turun analit ve membran kullanılan bağlı olarak 1 / 24 h alır.
    4. Kinetik çalışmalar, 100 µL her zaman noktası aliquot al ve aliquot üzerinden Sepharose 4B boyutu dışlama sütun mobil faz olarak 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile repurify.
    5. Bir 1,5 mL eppendorf tüp vezikül kesirleri toplamak.
    6. Triton vezikül kesirler bir final yaklaşık %0,1 için pipet v/v.
    7. Soğuk etanol 0.5 mL tüp ekleyin ve en az 2 h için-20 ° C'de kuluçkaya.
    8. 16,1 × 1000, tüm örnekler santrifüj kapasitesi rcf (16,1 × g) 10 dk ve yavaşça pipet sıvı dışarı için. RNA % 70 soğuk etanol ve santrifüj ile granül yıkama tekrar 5 dakika süreyle sıvı atmak ve RNA parçaları ile tüp kalan etanol buharlaşır için 2 dakika için bir 80 ° C ısı blok koymak. 8 M üre 1xTBE yükleme arabelleği ile 50 µL granül geçiyoruz.
  4. SAYFA analizi
    1. % 20 hazırlamak sayfa jel 200 mL UreaGel sisteminin konsantre ol, seyreltici, UreaGel sisteminin 25 mL karıştırma 10xTBE arabelleği 25 mL, TEMED, 80 µL ve amonyum persülfat 250 mg tarafından. Hızlı bir şekilde klempe jel plaka (35 cm × 45 cm) arasındaki jel karışımı dökün ve tarak ekleyin. En az 30 dk eksiksiz polimerizasyon kadar bekleyin.
    2. Jel plaka jel stand üzerine monte ve tampon çalıştıran 1xTBE jel ile jel kutuları doldurun. Tarak almak ve kuyular şırınga ile yıkayın. 60 W 30 dk. için jel önceden çalıştırın.
    3. Örnekleri için 2 dk 80 ° C ısı blokta ısı ve iyi ücret her örneğinin 5 µL yük.
    4. Jel güç kutusunu açın ve jel 60 W 2,5 h için sürekli Watt ile çalışan ayarlayın.
    5. Jel plaka jel stand sökmeye, camı temizle ve jel taramayı başlatmak için jel tarayıcıda bütün plaka koymak.
    6. Jel ImageQuant TL 1 D analizi ile ölçmek. Astar astar zaman vs başlangıç miktarı için bir zaman noktasında kalan miktarı oranında doğal logaritması arsa, bir satır için uygun ve sözde ilk sipariş reaksiyon oranı (Resim 2) hesaplamak.

5. hammerhead RNA kendini bölünme veziküller içinde

  1. Hazırlık ve veziküller içinde kapsüllü ribozyme arıtma
    1. Lipid ince bir film hazırlamak (OA: GDO 9:1 =) bölümünde 1.1 bileşenleri ile olarak olduğu gibi Tablo 1.2. Not: en az 60 ° tam kullanmadan önce erime için c sıcak GDO.
    2. Vezikül rehidrasyon arabellek her çekiç ribozyme strand ve 250 mM tris-HCl pH 8.0 5 mikron ile hazırlayın.
    3. Rehidrasyon arabelleği 250 µL lipid video eklemek ve adım 1.2.2 ve veziküller ile 0.15 M toplam yapmak 1.2.3 lipid konsantrasyon izleyin.
    4. Küçük unilamellar monodisperse veziküller yapmak için bölümü 1.3 vezikül ekstrüzyon için izleyin.
    5. Lipidler mobil faz karışık veziküller bir Sepharose 4B boyutu sütun dışlama, 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0.15 M ile arındırmak.
  2. Çekiç kafa ribozyme öz-bölünme tepki
    1. Magnezyum çözüm hazırlamak ve öz-bölünme reaksiyonu başlatmak için bölümde 3.1 açıklandığı gibi saf veziküller ile karıştırın.
    2. Kinetik çalışmalar, her zaman noktası 100 µL karışımı alın ve doğrudan bu aliquot üzerinden Sepharose 4B boyutu dışlama sütun mobil faz olarak 250 mM tris-HCl pH 8.0 ile repurify. Vezikül kesir toplamak.
  3. SAYFA analizi
    1. Örnek yükleme RNA hazırlamak için 4.3.6 4.3.8 adımları uygulayın.
    2. Ticari olarak döküm % 15 TBE-üre jel jel kutusu koyun ve jel kutusu arabellek çalışan 1xTBE jel ile doldurun.
    3. Örnekleri için 1 dk 80 ° C ısı blokta ısı ve iyi ücret her örneğinin 5 µL yük.
    4. Jel yaklaşık 1 h için sürekli 200 V ile çalıştırın.
    5. Jel inceden inceye gözden geçirmek.
    6. Jel ImageQuant TL 1 D gibi bir analiz yazılımı ile ölçmek, kalan şiddeti karşılaştırarak bölünme kapsamını ölçmek için bant (şekil 3) substrat RNA band ve i ciddi RNA parçası.

6. dev yağ asidi veziküller mikroskopi için

  1. Dev yağ asidi veziküller hazırlanması
    1. Bölüm 1.1 ve oleik asit ince film fluorescently etiketli lipid mol % 0.2 ile daha iyi membran gözlem için hazırlamak için Tablo 1.3 izleyin.
    2. 500 µL 250 mM tris-HCl pH toplamda vezikül örnek 10 mM lipidler yapmak 8.0 ile lipid film rehydrate. Arabellek floresan boyalar veya RNA molekülleri istenirse içeriyor olabilir. Vezikül örnek gecede yuvarlanan bırakın.
    3. 150 mL saf yağ asidi diyaliz arabelleği 10 mM ile toplam lipidler 470 µL oleik asit ve 150 mL 250 mM tris-HCl pH ½ eşdeğer NaOH içeren 8.0 karıştırarak hazırlayın.
    4. Büyük toplamları kaldırmak için bir 10 µm polikarbonat membran aracılığıyla vezikül örnek A'ya.
    5. Vezikül örnek daha önce açıklandığı gibi 1 µm büyük gözenek diyaliz kaset aktarın. 12
    6. Diyaliz kaset 30 mL diyaliz arabellek içeren bir 100 mL kabı yerleştirin. Kabı hafifçe üfleyin, 80-100 rpm de bir masa üstü shaker kışkırtmak.
    7. Diyaliz arabellek her 30 dk ücretsiz boya veya RNA ve küçük veziküller kaldırmak 5 kere için değiştirin.
    8. Dikkatli bir şekilde vezikül örnek diyaliz kaset bir şırınga ve transferi ile bir Eppendorf tüp çıkarın.
  2. Mikroskopi gözlem
    1. Veziküller temiz çift mikroskop slayt üzerine 10 µL pipet ve cam kapak notu örnek yerleştirin. Cam şeffaf oje ile kapatın.
    2. Confocal mikroskobu fluorescently etiketli membran, RNA veya Kapsüllenen boya (şekil 4) için uygun lazer kaynak kullanarak tarafından bir 60 X yağ dağılım veya benzer amacı ile veziküller gözlemlemek.

Representative Results

Biz genellikle boyutu-dışlama sütunlarda lipozom purifications gerçekleştirin. Tipik lipozom hazırlıkları bir fluorophore bir tür içerir. Zaman lipozomlar oluşturulan ve kalıptan çekilmiş, içindeki ve dışındaki lipozomlar kapsüllenmiş için türler bulunur. Boyut-dışlama reçine (Sepharose 4B) üzerinde lipozomlar arındırıcı tarafından süre büyük lipozomlar değildir ve ilk (şekil 1A) elute unencapsulated solutes reçine, gözenekleri içinde korunur. Kesirleri toplama ve çizme Floresans kesir sayı (şekil 1B) vs genellikle iki tepeli izleme, daha sonra toplanan ve sonraki uygulamalarda kullanılan lipozomlar, karşılık gelen erken stentlerin kesirli sayıları verir.

Biz sık sık ribozyme ve protein bazlı RNA polimerazlar RNA çoğaltma önce ortaya çıkması muhtemel bir araç olduğunu nonenzymatic astar uzantısı reaksiyonları incelemek. Bu reaksiyonlar genellikle aktif monomerleri tarafından genişletilmiş bir fluorescently etiketli astar (şekil 2A), istihdam. Bu tepkiler Jel Elektroforez (şekil 2B) tarafından izlenebilir ve elde edilen electropherograms tümleşik hızı sabitler verilen tepki durumu (şekil 2C) elde etmek için.

RNA protocells içinde işlev olabilir göstermek için bir modeli RNA katalitik tepki çekiç ribozyme öz-bölünme (şekil 3A) kullanıyoruz. Bu reaksiyon kataliz kolaylaştırmak için ücretsiz Mg2 + gerektirir ve bu nedenle biz onlar huzurunda 5 mM Mg2 +kararlı olduğundan OA/GDO veziküller kullanılır. Benzer şekilde astar uzantısı reaksiyonlar, çekiç kafa ribozyme öz-bölünme tepki de olabilir Jel Elektroforez (şekil 3B) tarafından izlenen ve daha sonra hızı sabiti (şekil 3 c) belirli koşullarda elde etmek için analiz edilebilir.

Biz her iki floresan istihdam ve ışık aktarılan lipozomlar görüntü. Lipozomlar bir membran etiket (şekil 4A) vermek, floresan lipidler veya floresan çözünen içinde onların Lümen (şekil 4B) kullanarak etiketli. İletilen ışık ( şekil 4B' de gösterilen) veziküller gözlemlemek için kullanılabilir.

Tablo 1.1 saf oleik asit kloroform
Bileşen Hisse senedi Tutar
Oleik asit > %99 11.7 ΜL
Kloroform 1 mL
Tablo 1.2 oleik asit ve gliserol monooleate (9: kloroform içinde 1)
Bileşen Hisse senedi Tutar
Oleik asit > %99 10.5 ΜL
Gliserol monooleate > %99 1.4 ΜL
Kloroform 1 mL
Tablo 1.3 oleik asit 0.2mol% rodamine PE kloroform ile
Bileşen Hisse senedi Tutar
Oleik asit > %99 1.6 ΜL
Rodamine-kloroform PE'de 10 mM 20 ΜL
Kloroform 1 mL

Tablo 1. Yağ asidi kloroform çözümleri.

Figure 1
Şekil 1. Vezikül arıtma ve floresan karakterizasyonu arıtma kesir. A. calcein Sepharose 4B sütun ücretsiz calcein dan içeren veziküller ayrılması. B. vezikül ve her iyi iyi numarası vs Floresans kesir koleksiyonu sonra komplo tarafından ücretsiz calcein peak algılama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. OA veziküller içinde non-enzimatik RNA çoğaltma. A. düzeni enzimatik olmayan RNA astar uzantısı. B. sayfa görüntüsü bir astar uzantısı tepki olarak bölümde 4 koşullarla saf oleik asit veziküller içinde. C. doğrusal zaman noktası astar zaman üzerinde 30 h. reaksiyon oranı vs başlangıç miktarı göz önüne alındığında, astar kalan tutarı oranında doğal logaritması fit, zamanla (P/P0) vs yamaç hesaplanan, 0,058 h-1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Çekiç kafa ribozyme bölünme OA/GDO veziküller içinde. A. düzeni çekiç ribozyme dekolte fluorescently etiketli substrat Strand (üstte). B. sayfa görüntüsü çekiç ribozyme dekolte ile 5 mM Mg2 +OA/GDO veziküller içinde. C. Ribozyme etkinliği veziküller içinde. Doğrusal uyum süresi noktası göz önüne alındığında, kalan substrat miktarı oranında doğal logaritması ilk 4 h reaksiyon zamanında vs yüzey ilk miktarı vs zaman içinde (s/s0), yamaç hesaplanan 0,36 h-1oranıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Dev yağ asidi veziküller mikroskopi için. A. rodamine PE görüntüsünü Confocal mikroskobu etiketli oleik asit vezikül, ölçek 10 mikron bar. B. oleik asit vezikül Alexa488 içeren Confocal mikroskobu görüntüsü ile iletilen dedektörü (TD) kanal, ölçek 5 mikron bar gösterilen membran RNA etiketli.

Discussion

Yağ asitleri kurulan lipozomlar Yüksek geçirgenlik ve dinamik özellikleri nedeniyle ilkel hücreler için potansiyel modelleri gibi birçok kişi tarafından önerilmiştir. Tek zincirli yağ asitleri karboksilik baş grup yalnızca kendinden montajlı membranlar kısıtlı pH aralığı içine sağlar ve elde edilen membranlar tuzları varlığı oldukça duyarlıdır. Sonuç olarak, yağ asidi veziküller farklı hazırlık ve Fosfolipid veziküller ile karşılaştırıldığında yöntemleri işleme gerektirir.

Bu protokol için lipozom oluşumu için örnek olarak oleik asit kullandığımız rağmen diğer uzun zincir doymamış yağ asitleri (C14) ve onların türevleri (ca. myristoleic asit, palmitoleic asit ve karşılık gelen alkoller ve gliserin esterleri) ayrıca veziküller formu Toplam lipid konsantrasyon cmc ve hidrasyon tampon pH olduğu sürece tabi belgili tanımlık ince film rehidrasyon yöntem membran içinde yağ asitleri pKa yakındır. Tris-HCl tampon bu protokol için kullanılan dışında fosfat veya Bor arabellekte oluşan veziküller genellikle oldukça sızan13olmasına rağmen diğer tampon sistemleri (ca. bicine, fosfat, Bor) yağ asidi vezikül oluşumu, desteklemek için rapor edilmiştir. Rehidrasyon sonra elde edilen yağ asidi veziküller polydisperse vardır ve multilamellar, ancak kolayca küçük monodisperse unilamellar veziküller ekstrüzyon tarafından açıklandığı gibi dönüştürülür. Küçük veziküller oluşturmak için alternatif bir yöntem olarak sonication ile karşılaştırıldığında, ekstrüzyon farklı gözenek boyutu membranlar uygulayarak vezikül boyutta denetim için daha fazla seçenek sağlar. Ekstrüzyon sonra veziküller genellikle biraz membran gözenek boyutu büyük, fakat ekstrüzyon devir sayısını artırarak, veziküller dar bir boyut dağılımı ve membran gözenek boyutu yakın bir ortalama boyutu ile elde edilebilir.

Fonksiyonel protocells sentez için ana bilgisayar belirli biyokimyasal reaksiyonlar RNA veya diğer yapı taşlarını encapsulation kaynaklanan yağ asidi veziküller gerekmektedir. İnce film rehidrasyon yöntemi istenen kapsüllenmiş malzemeler içeren formu veziküller için kolay bir yol sağlar. Ancak, kapsülleme verimliliği nispeten düşük olduğunu ve RNA gibi değerli malzemeler büyük bir kısmı arıtma işlemi sırasında genellikle kayıp. Bazı durumlarda kapsülleme verimliliği alçakgönüllülükle tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri ekstrüzyon önce tarafından geliştirilebilir. Benzer yöntemleri henüz yağ asidi veziküller için geliştirilmiştir değil ancak mikrosıvısal yöntemler Fosfolipid lipozomlar yüksek verimli hazırlanması için neredeyse % 100 kapsülleme verimlilik için olanak sağlar.

Ne zaman protocells ya Şelatatlı ya da ücretsiz Mg2 +, magnezyum çözüm eklenmesi ve kaldırılması her zaman noktası sağlar önce repurification sonra arıtma işleme sızdırılmış kapsüllenmiş reaksiyon oranı doğruluğunu etkileyebilir malzeme ölçümler veziküller içinde. En az 10 dk iyi ayırma elde etmek ve vezikül kesirleri toplamak için her arıtma alır bu yana, hızlı reaksiyonlar analizini zordur ve reaksiyon sütun repurification önce durdurulması gerekir.

Burada mevcut protokolü bu ilkel hücreler oluşabilecek taklit reaksiyonlar ev sahipliği yağ asidi lipozomlar inşası için uygundur. Bizim protokoller de Biyomedikal vasıtalarının ve Biyoreaktörler diğer biyokimyasal reaksiyonlar için potansiyel uygulamalar geliştirme sağlar.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

J.W.S. Howard Hughes tıp Enstitüsü'nün bir dedektif olduğunu. Bu eser kısmen J.W.S. için Simons Vakfı bir hibe (290363) tarafından desteklenmiştir A.E.E. ve K.P.A. Minnesota Üniversitesi başlangıç fonlarından destek kabul edersiniz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sephorose 4B SIGMA-ALDRICH INC 4B200
calcein SIGMA-ALDRICH INC C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M LIFE TECHNOLOGIES CORP AM9851
citric acid SIGMA-ALDRICH INC 251275-500G
sodium hydroxide SIGMA-ALDRICH INC 71690-250G
potassium hydroxide Sigma 30614
oleic acid Nu-Chek U-46-A
glycerol monooleate Nu-Chek M-239
Liss Rhodamine-PE LIFE TECHNOLOGIES CORP L1392
magnesium chloride Fisher/Thermo Fisher Scientific AM9530G
sequagel concentrate National Diagnostics EC-830
sequagel DILUENT National Diagnostics EC-840
15% TBE-UREA GEL Thermo Fisher Scientific EC68852BOX
urea Sigma Aldrich U6504-500G
titon-100x SIGMA-ALDRICH INC T9284-100ML
RNA primer IDT 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template IDT 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand IDT 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand IDT 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set AVANTI POLAR LIPIDS 610000
fraction collector Gilson, Inc. 171041
96-well plates Fisher NC9995941/675
plate reader Molecular Devices SpectraMax i3
confocal microscope Nikon Nikon A1R MP Confocal
gel scanner GE Healthcare Life Sciences Typhoon 9410 scanner

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454, (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559, (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59, (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342, (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328, (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127, (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10, (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4, (4), e5009 (2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).
Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).More

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter