Summary
Ett förfarande för uppfödning stabil flugor (Stomoxys calcitrans) presenteras. Proceduren använder lokalt tillgängliga material för kost komponenter, utrustning och förnödenheter.
Abstract
Stabil flugor, Stomoxys calcitrans, är allvarliga skadedjur av boskap, människor, sällskapsdjur och vilda djur i världen. Under de senaste 20 + år resulterade förändringar i jordbruksmetoder i allvarliga utbrott av stabil flugor i flera länder. Dessa utbrott störde animalieproduktion och människors rekreation vilket resulterar i allmänna krav för att öka forskning och förvaltning insatser för denna skadegörare. Ett enkelt och billigt förfarande för uppfödning stabil flugor för laborativa studier presenteras. Proceduren använder lokalt tillgängliga kost komponenter, utrustning och förnödenheter. Förfarandet kan anpassas för uppfödning av andra muscoid flugor inklusive ansikte fluga (Musca autumnalis), horn fluga (Haematobia irritans) och huset flyga (Musca domestica). Förfarandet ger stabil flyga puparia genomsnitt 12,5 mg och ~ 35% ägg till vuxen överlevnad. Cirka 3000 flugor produceras i varje kastrull.
Introduction
Stabil flugor, Stomoxys calcitrans (L.) är blodsugande flugor vars smärtsamma bett störa beteendet betande boskap, orsaka smärta och lidande för följeslagare djur och stör människors fritidsaktiviteter i hela världen. Omogna stabil flugor utvecklas i att jäsa vegetativa delen, ofta förorenade med animaliskt avfall. Förändrade jordbruksmetoder och grödor har producerat allvarliga utbrott av stabil flugor i växtrester, grönsaker i Australien1, sockerrör i Brasilien2och ananas i Costa Rica3. Även om bara 14 stabil flugor per djur anses vara den ekonomiska tröskel4, har observationer av mer än 2.000 flugor per djur gjorts under senaste utbrott5. Sådana angrepp nivåer minska värd produktivitet till nära noll och kan orsaka dödlighet6. Till följd av jordbruksmässigt associerade utbrott, stabil flugor får förnyat intresse och efterfrågan på laboratoriet kolonier har ökat dramatiskt.
När det gäller alla holometamorphic insekter erhålla stabil flugor alla de näringsämnen som krävs för tillväxt under omogna eller larvformer scenen. Därför är en viktig komponent i ett uppfödning larval kost eller substrat. Stabil fluglarver har observerats utveckla i ett brett spektrum av substrat i fält7 och de är beroende av mikrobiell gemenskapen av substrat8,9. Naturliga larval substrat består primärt av ruttnande eller jäsa vegetativt material ofta förorenade med kvävehaltiga avfall.
För laboratoriet uppfödning, är stabil flyga larval substrat vanligtvis består av ett vegetativt material och en extra kväve källa. Många material har använts för stabil flyga larval Dieter. De första larval Dieter härmade naturliga substrat och inkluderade jäser havre halm och häst eller ko gödsel10,11. Kolhydrat källorna inkluderar vete kli12,13,14, alfalfa måltid12,13,14 och en kommersiell formulering utvecklats av kemiska specialiteter Tillverkare Association (CSMA, 33% vetekli, 27% alfalfa måltid, 40% öljäst granulat)13,14,15,16. Kväve källor inkluderar jäst suspension12, fiskmjöl och hjorthornssalt17. Inerta fyllnadsmedel material ingår ofta i Dieter inklusive havre skrov12, bagass13, vermikulit16, flis13,18 och pelleterat jordnöt skrida14.
Ett av laboratoriet uppfödning främsta mål är att producera en produkt som är så fysiologiskt liknande ”vildtyp” som möjligt för att laborationer kommer att ge resultat som speglar de av fältet populationer. Detta kräver att i avel och urval minimeras för att upprätthålla genetiska mångfald och näringsmässiga resurser vara jämförbara med dem i fältet. Sekundära mål är att minimera arbete och utgifter. En viktig komponent för att minimera kostnader är användningen av lokalt tillgängliga kost komponenter. Stabil flugan uppfödning system presenteras utvecklades för att möta dessa mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ägg samling (figur 1)
- Förbereda eggade cup, placera ena änden av tyg i ~ 500 mL bägare fylld med varmt (~ 40 ° C) vatten. Överlappa sidorna av koppen och fäst med ett gummiband. Vik den lösa änden av tyget tillbaka över toppen av koppen.
- Plats eggade kopp i bur 8 – 10 dagars gamla flugor för ~ 2 h. dräktig hona stabil flugor kommer oviposit på duken.
- Ta bort eggade cup från buren och skölj äggen bort av egging trasan i en liten kastrull med squeeze tvättflaska.
2. Förbered Larval uppfödning Pan
-
Förbereda medium (kvantiteter för 1 uppfödning pan)
- Kombinera vetekli (500 g), träspån (200 g) och fiskmjöl (115 g) i 10 L plast skålen stekpanna och blanda väl.
- Tillsätt hjorthornssalt (50 g) till vatten (~ 25 ° C, 1600 mL) och blanda tills upplöst.
- Lägga till vattenlösning till torra ingredienser och blanda för att säkerställa att inget unwetted material. Nivå medium i stekpanna men inte komprimera.
-
Lägg till stabil flyga ägg
- Göra en ytlig fåra i medium längd av pannan.
- Insättning 1 mL stabil flyga ägg (~ 8 000 ägg) i fåran med ägg pipett (figur 2).
Obs: Ägg pipett gjort genom att skära plast graderad pipett vid önskad punkt, infoga 100 mesh skärmen och limning pipett tillbaka tillsammans. - Täcka ägg med ett tunt lager av medium för att förhindra uttorkning.
- Täck pannan med örngott, nära med ett gummiband och en etikett. Placera kastruller i larval rum (23 ± 2 ° C, 30 – 50% RH och 12:12 [l] h fotoperiod).
Obs: Larval development tar 10 – 14 dagar från tiden av ovipositionen.
3. Pupp bearbetning, larver flytta till kanten av Medium 7 – 9 dagar efter Oviposition och Pupariate av dagar 13 eller 14
- Scoop puparia, primärt ligger runt kanterna av pannan under skorpan som bildas på ytan av mediet, ut och placeras i en ren kastrull.
- Fyll pannan, med puparia, ½ till ¾ full av vatten. Bryt upp klumpar av puparia och medium. Vete kli och protein komponenter av medium sjunka medan puparia > 1 dag gammal flöte19.
- Ta bort flytande material, puparia och vissa medelstora komponenter med ett durkslag och tvätta genom en serie av såll (#5, #7, #12, #20) ta bort återstående medium. #12 sikten samlar puparia och #20 håller fast avfall från att komma in i avloppet. Tvätta puparia mellan siktar med en spruta sink.
- Skölj puparia, i #12 sikten, i en ren kastrull. Fyll pannan till ½ full av vatten. Häll flytande puparia i ett durkslag och låt överflödigt vatten rinna.
- Överföring avrunna puparia till torkning skärm med fläkt och lämna tills de är torra (figur 3).
4. Pupp hylla, en alternativ metod för att samla in Puparia är med en Pupp hylla18
Obs: Hyllan är tillverkad av ett stycke plast cut från slutet av en 10 L skålen pan (10,2 cm lång x 10,2 cm bred x 31,9 cm lång).
- Förbereda medium som beskrivs i 2.1. Kona medium i pan från ~2.5 cm djupt på ena änden till ~7.5 cm djup på den andra.
-
Placera hyllan på medium i den grunda delen av uppfödning pan och tejp för att förhindra att larver kryper bredvid hyllan (figur 4).
- Mätta svamp (~14.5 x 9.0 x 4,5 cm3, regenererad cellulosa) och Linda in den i en vatten fuktad trasa (30,5 x 42 cm2, bomull) och plats på hyllan ca en halv tum från mediet.
-
Tillsätt ägg som beskrivs i 2.2 och fortsätt som förut.
- Kontrollera stekpannor dagligen så att svampen förblir fuktig.
- Skölj puparia från hyllan, svamp och trasa i en ren skål panorera och häll i durkslag 14 dagar efter ovipositionen.
5. kvalitetskontroll
- Väg alla de puparia som produceras i stekpanna (totala wt.).
- Isolera 100 puparia, väga och placeras i en 9 cm petriskål.
- Räkna och sex vuxna ~ 5 – 8 dagar senare för att bestämma uppkomsten rate och könskvot. Lagra petriskålar med framkom vuxna i en frys för att räkna vid ett senare tillfälle om det behövs. Flugor är sexed av formen på sina ögon och bredden på fronto-orbital plattan20 eller genitalier i låg förstoring.
- Spela in total vikt, vikt 100 puparia, och antalet framkom vuxna män och kvinnor.
6. förberedelse blod
- Samla in färskt nötkreatur blod från ett lokalt slakteri i 19 L hinkar innehållande 70 g tribasisk natriumcitratdihydrat i 500 mL vatten. Rör blod kraftigt i 5 – 10 min och återvände till laboratoriet.
- Sila blodet genom ett durkslag ta bort blodproppar och delat i 2 L behållare, etikett med datum för insamling och förvaras i frys (-20 ° C).
- Ta bort behållaren från frysen och placera i kylskåp 2 dagar innan behövs. Blod kan användas för ~ 2 veckor en gång tinade och förvaras i frysen upp till 1 år.
7. vuxna underhåll
- Förbereda burar, linje bur botten med slaktare papper för att underlätta rengöring.
- Placera 50 g torrt stabil flyga puppor (~ 3500) i varje bur. Vuxna eclose några timmar till ett par dagar efter Pupp bearbetning.
- Plats ett färskt blod dränkta feminina servett ovanpå varje bur för utfodring. Börja mata inom 24 h av vuxen eclosion och upprepa dagligen tills en dag före ovipositionen (9 – 10 dagar efter uppkomst).
- Efter ovipositionen (avsnitt 1), placera buren i frysen i 4 – 8 h och sedan rengöra genom att ta bort papperet, sköljning frass från sidorna och golvet med varmvatten och skura alla ytor med tvättmedel och blekmedel. Skölj burar med hett vatten och låt torka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larverna pupariate 10 – 14 dagar och vuxna fram 14 – 16 dagar efter ovipositionen. Generationstid, ägg till ägg, är ~ 24 dagar. Uppfödning data för maj 2013 till januari 2017 med tre olika fyllnadsmedel och två kolonier presenteras i figur 5. Cottonwood gav bästa avkastning, 3867 ±1442 (
± standardavvikelse) puppor väger 12,5 ±1.6 mg med 74 ±19% eclosion producerar 2.872 ±1294 vuxen flugor för etablerade laboratorium kolonin. Baserat på kön var något partisk mot kvinnor 0.97:1 (man: kvinna, 77,141 flugor könsbestämmas från 1 184 stekpannor). Ägg till vuxen överlevnad är cirka 36%. Tyvärr, cottonwood spån har blivit svårare att få tvingar oss att använda tall spån ofta. Även om produktionen med tall är lägre, ~ 1 700 vuxna per pan, storleken är något större, 13 mg.
Använder metoden Pupp hylla ca 85% av larverna migrera på hyllan, puparia är renare och de flesta av de medium som samlas in på hyllan är enkelt bort genom flotation. Denna metod kan också användas för att övervaka graden av larval utveckling när man jämför uppfödningsmetoder. Nackdelen är att kastruller måste övervakas dagligen för att säkerställa att svampar förblir fuktig.
Den aktuella kostnaden för medelstora komponenter är $ 1,17/pan eller $ 0,39/1,000 stabil flugor (tabell 1).
| Komponent | Kvantitet | Kostnad/Pan |
| Vetekli | 500 g | $0,35 |
| Träspån | 200 g | $0,06 |
| Fiskmjöl | 115 g | $0,27 |
| Vatten (≈25 ° C) | 1600 mL | |
| Hjorthornssalt | 50 g | $0,48 |
Tabell 1: stabil flyga larval kost. Blanda torra ingredienserna exklusive hjorthornssalt och blanda väl. Tillsätt hjorthornssalt till vatten och blanda tills upplöst. Lägg till ammoniumbikarbonatlösning till torra ingredienser och blanda för att säkerställa att inget unwetted material. Kvantiteten för en pan.
Figur 1: material som används för att samla stabil flyga ägg. Eggade cup, pressa tvättflaska och liten kastrull för att ta emot ägg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ägg tillämpas på förberedda medium i pan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: apparater används för torkning puparia. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Larval uppfödning pan med Pupp hylla. Observera ansamling av puparia ovanpå och runt duken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Sammanfattning av uppfödning data. Genomsnittligt antal puparia per pan (A), puparia vikt (B) och antal vuxna per pan (C) för stabil fluga uppfödning från maj 2013 till januari 2017 med tre fyllnadsmedel, cottonwood spån, tall spån och vermikulit och två kolonier . Lab kolonin har fötts upp kontinuerligt i vårt laboratorium för cirka 10 år. PL kolonin upprättades från vilda flugor som samlas in på ett mejeri i Lancaster Co, NE, USA hösten 2014. Felstaplar representera standardavvikelser. N representerar antalet pannor som data baseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabil flugor kan hittas utveckla i ett brett utbud av substrat i naturen och kan odlas i många typer av media i laboratoriet. Vi har använt träspån och vermikulit som fyllnadsmedel agenter. Vermikulit fungerat bra, men gjorde separera puparia från uppfödning medium svårt och var dyra (~$0.60/pan). Möjligen på grund av den extra stringensen att skilja puparia från mediet, var eclosion också lägre med vermikulit, 57% jämfört med 75% för träspån. Cottonwood spån var jämförbar med vermikulit, men ibland svårt att uppbringa. De viktigaste komponenterna verkar vara vegetativt eller cellulosahaltiga material att jäsa och upprätthålla en ”öppen” eller väl kolsyrat medium och ammoniak kväve21,22. Stabil fluglarver finns inte i ren dynga, föredrar äldre dynga blandas med vegetabiliskt material. Med dessa tankar, kan de uppfödning procedurer som beskrivs här anpassas till lokalt tillgängliga material att utveckla billiga förfaranden för uppfödning av stabil flugor.
Flugor som fötts upp med hjälp av dessa metoder är jämförbar i storlek med fältet samlas flugor. Flygeln är korrelerade med stabil flyga kropp vikt23. Eftersom vingarna av vilda flugor är ofta sliten, använder vi längden på discal-mediala cellen som en indikator på wing längd. Genomsnittliga längden på discal-mediala cellen av 249 flugor som fötts upp med denna metod var 2,49 0.15 mm (intervall 1,96 – 2,81) medan 3 713 flugor som samlats på sticky fällor under somrarna 2011 och 2012 nära Ithaca var NE 2.52 ±0.21 mm (intervall 1,80 – 3.58) (opubl. data). Vikten av puparia som fötts upp med denna metod är högre än som rapporterats för tidigare uppfödning protokoll14,24 och överlevnad, ägg till vuxen, är högre än 5% observerats i fält25.
Liknande metoder kan användas för uppfödning av andra muscoid flugor inklusive ansikte flugor, horn flugor och hus flugor. Ansikte fluga och horn flyga larver kräver ett färskt nötkreatur dynga medium. Huset flyga medium är gjord av 470 g kalv foder, 500 g vetekli och 1 600 mL vatten (~ 25 ° C). Som stabil flugor, horn fluga vuxna livnära sig på blod. Möta fluga och huset flyga vuxna kan matas en torr blandning av mjölkpulver och socker. Möta fluga och huset flyga vuxna behöver också en källa till vatten. Vi använder 100 mL plastflaskor med en dental veke som passerar genom locket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Anthony Weinhold och de många studenter som har arbetat med oss under åren för teknisk support samt förslag för att förbättra vår insekt uppfödning förfaranden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamalt | Premier Malt Products, Inc., Saddle Brook, NJ | 2540 | |
| CSMA Fly media | Purina Animal Nutrition, Arden Hills, MN | 5S6Z | |
| Thin Maxi Pad | The Tranzonic Co., Cleveland, OH, USA | 5001M | |
| Calf Manna | MannaPro, Chesterfield, MO, USA | Manna Pro | |
| Ammonium Bicarbonate | Spectrum Chemical Manufacturing Corp, Gardena, CA | A1125 | |
| Wheat bran, Coarse | Siemer Milling Company, Teutopolis, IL | ||
| Wood shavings | Tractor Supply Company, Brentwood, TN | 502770699 | |
| Fishmeal | Consumer Supply Distributing, North Sioux City, SD | F1550 | |
| Adult cages | All Aluminum Window Company, Lincoln, Ne | Custom | 45 × 45 × 45 cm, 18 × 16 mesh aluminum screen, stockinette access |
| 9 × 28 cm black cotton cloth | Robert Kaufman Fabrics, Los Angeles, CA | K040-114 | Egging cloth |
| 10 L plastic dish pans | Rubbermaid, Saratoga Springs, NY | FG2951ARWHT | Larval pans |
| Stockinette, Cotton, 12 inch x 25 yard roll | Tex-Care Medical Company, Burlington, NC | 91311-225 |
References
- Cook, D. F., Dadour, I. R., Keals, N. J. Stable fly, house fly (Diptera: Muscidae), and other nuisance fly development in poultry litter associated with horticultural crop production. J. Econ. Entomol. 92 (6), 1352-1357 (1999).
- Dominghetti, T. F., de Barros, A. T., Soares, C. O., Cançado, P. H. Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) outbreaks: current situation and future outlook with emphasis on Brazil. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 24 (4), 387-395 (2015).
- Solórzano, J. -A., Guilles, J., Bravo, O., Vargas, C., Gomez-Bonilla, Y., Bingham, G., Taylor, D. B. Biology and trapping of stable flies (Diptera: Muscidae) developing in pineapple residues (Ananas comosus) in Costa Rica. J. Insect Sci. 15 (1), 145 (2015).
- Berry, I. L., Stage, D. A., Campbell, J. B. Populations and economic impacts of stable flies on cattle. Trans. Am. Soc. Agric. Eng. 26, 873-877 (1983).
- Taylor, D. B. Area-wide management of stable flies. Area-wide management of insect pests. Vreysen, J., Hendrichs, R., Cardoso Pereira, R. , in press (2017).
- Bishopp, F. C. The stable fly (Stomoxys calcitrans L.), an important live stock pest. J.Econ. Entomol. 6 (1), 112-126 (1913).
- Hogsette, J. A., Ruff, J. P., Jones, C. J. Stable fly biology and control in northwest Florida. J. Agric. Entomol. 4 (1), 1-11 (1987).
- Lysyk, T., Kalischuk-Tymensen, L., Selinger, L., Lancaster, R., Wever, L., Cheng, K. Rearing stable fly larvae (Diptera: Muscidae) on an egg yolk medium. J. Med. Entomol. 38, 382-388 (1999).
- Romero, A., Broce, A., Zurek, L. Role of bacteria in the oviposition behaviour and larval development of stable flies. Med. Vet. Entomol. 20, 115-121 (2006).
- Glaser, R. W. Rearing flies for experimental purposes with biological notes. J. Econ. Entomol. 17 (4), 486-496 (1924).
- Melvin, R. Physiological studies on the effect of flies and fly sprays on cattle. J. Econ. Entomol. 25 (6), 1151-1164 (1932).
- Doty, A. E. Convenient method of rearing the stable fly. J. Econ. Entomol. 30 (2), 367-369 (1937).
- Bridges, A. C., Spates, G. E. Larval medium for the stable fly Stomoxys calcitrans (L.). Southwest. Entomol. 8 (1), 6-10 (1983).
- Hogsette, J. A. New diets for production of house flies and stable flies (Diptera: Muscidae) in the laboratory. J. Econ. Entomol. 85 (6), 2291-2294 (1992).
- McGregor, W. S., Dreiss, J. M. Rearing stable flies in the laboratory. J. Econ. Entomol. 48 (3), 327-328 (1955).
- Goodhue, L. D., Cantrel, K. E. The use of vermiculite in medium for stable fly larvae. J. Econ. Entomol. 51 (2), 250 (1958).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Augmenting laboratory rearing of stable fly (Diptera: Muscidae) larvae with ammoniacal salts. J. Insect Sci. 17 (1), 1-6 (2017).
- Berkebile, D. R., Weinhold, A. P., Taylor, D. B. A new method for collecting clean stable fly (Diptera:Muscidae) pupae of known age. Southwest. Entomol. 34 (4), 469-476 (2009).
- Champlain, R. A., Fisk, F. W., Dowdy, A. C. Some improvements in rearing stable flies. J. Econ. Entomol. 47 (5), 940-941 (1954).
- Zumpt, F. The stomoxyine biting flies of the world. , Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. (1973).
- Wienhold, B. J., Taylor, D. B. Substrate properties of stable fly (Diptera: Muscidae) developmental sites associated with round bale hay feeding sites in eastern Nebraska. Environ. Entomol. 41 (2), 213-221 (2012).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Wienhold, B. J., Durso, L., Zhu, J., Taylor, D. B. Environmental parameters associated with stable fly (Diptera: Muscidae) development at hay feeding sites. Environ. Entomol. 45 (3), 570-576 (2016).
- Albuquerque, T. A., Zurek, L. Temporal changes in the bacterial community of animal feces and their correlation with stable fly oviposition, larval development, and adult fitness. Front. Microbiol. 5 (590), 1-9 (2014).
- Bailey, D. L., Whitfield, T. L., LaBrecque, G. C. Laboratory biology and techniques for mass producing the stable fly, Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol. 12 (2), 189-193 (1975).
- Smith, J. P., Hall, R. D., Thomas, G. D. Field studies on mortality of the immature stages of the stable fly (Diptera: Muscidae). Environ. Entomol. 14 (6), 881-890 (1985).
