Summary
ويقدم بروتوكول لاستخلاص نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة تربة واحدة في وقت واحد، مما يسمح عينة انخفاض إعداد مرات وتمكين متعدد omic الكتلي تحاليل العينات بكميات محدودة.
Abstract
الطيف الكتلي (مللي ثانية)-ميتابروتيوميك متكامل يستند إلى، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك (multi-أوميك) في تحويل قدرتنا على فهم وتميز المجتمعات الميكروبية في النظم البيئية والبيولوجية. هذه القياسات حتى تمكن التحليلات المعززة للمجتمعات الميكروبية التربة المعقدة، التي أكثر النظم الميكروبية المعقدة المعروفة حتى الآن. تحليلات متعددة-أوميك، ومع ذلك، قد التحديات إعداد عينة، منذ عمليات الاستخراج منفصلة مطلوبة عادة لكل دراسة أوميك، إلى حد كبير وبالتالي تضخيم إعداد الوقت وكمية العينة المطلوبة. لمعالجة هذا القيد، تم إنشاء أسلوب 3 في 1 لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (مبليكس) من نفس العينة التربة بتكييف نهج قائم على أساس مذيب. أثبت هذا البروتوكول مبليكس على حد سواء بسيطة وقوية للعديد من أنواع العينات، حتى عندما تستخدم لكميات محدودة من عينات التربة المعقدة. الأسلوب مبليكس كبير أيضا تمكين القياسات المتعددة-أوميك السريع اللازم للحصول على فهم أفضل لأعضاء كل جماعة الميكروبية، أثناء تقييم التغيرات التي تحدث عند الاضطرابات البيولوجية والبيئية.
Introduction
تقييم المجتمعات الميكروبية في التربة آثار هامة لفهم الكربون ركوب الدراجات، وتغير المناخ. قد أبرزت الدراسات الأخيرة لكن الصعوبات، مثل عدم وجود تسلسل الجينوم الحجمية في مختلف أنواع التربة والدالة غير معروف للعديد من البروتينات الكشف عن. هذه نتيجة التحديات نظراً للتربة يجري المجتمع الميكروبي أعقد المعروفة حتى الآن1،،من23. تحليلات متعددة-أوميك، التي تجمع بين النتائج من الجينومية، ميتاترانسكريبتوميك، ميتابروتيوميك، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك، قد نفذت مؤخرا في العديد من الدراسات التربة على اكتساب فهم أكبر في الميكروبات الحالية، بينما الحصول على معلومات شاملة حول التغيرات الجزيئية التي تحدث بسبب الاضطرابات البيئية1،،من45. التحدي واحدة مع دراسات متعددة-أوميك هو أن الكتلي (مللي ثانية)-استناداً إلى قياسات ميتابروتيوميك، metabolomic، ليبيدوميك، وعادة ما تتطلب عملية استخراج محددة لكل أوميك أن يكون مرض التصلب العصبي المتعدد متوافق مع6،7 , 8 , 9-هذه الإجراءات الدقيقة جعل تنفيذها صعباً أو مستحيلاً للغاية عندما فقط تتوفر كمية محدودة من عينة. هذه التحديات قد حدا بنا إلى التحقيق في أسلوب متزامنة من استخراج (مبليكس) المستقلب والبروتين والدهن قادرة على استخدام أصغر حجم العينة أو الجماهير، وتحسين دقة وتوفير الاستعدادات عينة أسرع لجميع التحاليل الثلاثة 10-حتى الآن، لا توجد أي إجراءات استخراج التربة البديلة التي يمكن تحقيق كل هذه الأهداف.
لتمكين تحليلات عالمية متعددة-أوميك من عينة التربة واحدة، كان بروتوكولا استخلاص بالمذيبات عضوية استناداً إلى كلوروفورم، والميثانول، وفصل المياه المستخدمة10. هذا الأسلوب وضعت أصلاً للدهن مجموع الاستخراج9،11 ، وفي الآونة الأخيرة عدل لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة واحدة12،13 ،14،15،16،17،،من1819،،من2021،22، 23،24،25،26،27،28،،من2930، تمكين أقل كمية العينة و 10من تقلب التجريبية. في بروتوكول مبليكس، كلوروفورم ليس الامتزاج مع الماء، مما يوفر الأساس لفصل مكونات عينة ثلاثية الأطوار الكيميائية إلى كسور متميزة. ولذلك تتضمن المرحلة مائي أعلى والايضات ماء، متبوعة بقرص بروتين، ومن ثم طبقة الدهون في مرحلة كلوروفورم السفلي (الشكل 1). عندما يتم تطبيق مبليكس على معظم أنواع التربة، جسيمات الحطام يتراكم في الجزء السفلي من أنابيب أخذ العينات ويمكن التخلص منها بعد أن يتم جمع كل الطبقات. كل نوع من أنواع التربة يمكن أن تكون مختلفة، ومع ذلك، وفي التربة العضوية العالية مثل الخث، والحطام التربة يبقى في الطبقة الوسطى، ولا تقع على الجزء السفلي من أنبوب أخذ العينات. مبليكس يوفر العديد من المزايا عند عزل جزيء عدة أنواع من نفس العينة مثل كميات 1) أصغر بعينه يمكن أن تستخدم لتحليلات متعددة-أوميك، 2) multi-omic الاستخراج من النقصان عينة نفس تقلب التجريبية عموما، و 3) يمكن إعداد أسرع بكثير عدد أكبر من العينات ل دراسات الإنتاجية أعلى10. معا هذه الفوائد أمر حيوي لتوفير قدرات القياس بشكل أفضل لتقييم عينات التربة ومجتمعاتهم الجرثومية المعقدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يمكن ليوفيليزيد التربة رطبة جداً قبل استخراج دون الأضرار بالفعالية للاستخراج. يمكن أيضا استخدام التربة الرطبة لكن ينبغي النظر عند إضافة الكواشف في نسب محددة.
ملاحظة: من المستحسن استخدام 20 غراما وزن التربة الجافة للاستخراج، التي يجب تقسيمها بين أنبوبين 50 مل (بحد أقصى 10 جرام التربة في أنبوب 50 مل). يمكن تحجيم عمليات الاستخراج صعودا أو هبوطاً يعتمد على العينة المتاحة.
ملاحظة: يمكن غربلة عينات التربة الجافة من خلال شاشة 3 مم لمجانسة وإزالة الجذور الصغيرة والصخور. لا منخل عينات التربة الرطبة، كما سوف تتعثر العينة في الشاشة.
1-التربة تحلل الخلية واستخراج من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (توقيت د ~ 1)
- كل عينة التربة ز 20، تزن 10 جرام إلى أنبوبين منفصلين 50 مل الميثانول/كلوروفورم متوافقة. تكون حذراً للغاية مع أنابيب المختار، كما سوف ليتش كلوروفورم معظم المواد البلاستيكية، تلوث العينات. استخدام الزجاج كلما كان ذلك ممكناً أو البلاستيكية أنابيب مصنوعة من بولي بروبلين أو تترافلوروايثيلين (PTFE).
ملاحظة: الحفاظ على التربة على الجليد وباردة قدر الإمكان خلال الخطوات الأولية وزنها والتجانس. - إضافة 10 مل كلوروفورم غسلها الفولاذ المقاوم للصدأ وحبات العقيق لكل أنبوبة. على الجليد، إضافة 4 مل البرد عالي النقاوة الماء (انظر الجدول للمواد لنظام تنقية) لكل أنبوبة (تقسيم عينة واحدة بين أنبوبين) ونقل العينات دلو الجليد في غطاء دخان.
- بسرعة باستخدام ماصة مصلية زجاج 25 مل، إضافة 20 مل من المثلج 2:1 كلوروفورم: الميثانول (v/v).
تنبيه: لقد كلوروفورم: الميثانول حدة الآثار الصحية المحتملة: الجلد تهيج والحروق الكيميائية المحتملة، وتهيّج الجهاز التنفسي. قد يؤثر على الكلي والكبد والقلب. ارتداء نظارات واقية مناسبة وملابس، والقفازات، والعمل دائماً في غطاء دخان. - تشديد على أغطية ودوامه في الحل. choloroform:methanol 2:1 يساعد على كسر جدار خلية بدائيات النوى ويحللها أيضا الأنشطة الانزيمية.
- إرفاق هذه الأنابيب إلى 50 مل أنبوبة الدوامة المرفقات ودوامه لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية داخل ثلاجة أفقياً إذا أمكن. ثم وضع العينات داخل ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة دقيقة ~ 15 بغية تهدئة لهم تماما.
- استخدام سونيكاتور تحقيق داخل غطاء دخان، sonicate كل عينة مع تحقيق 6 مم (1/4 ") في السعة 60% لمدة 30 ثانية كل على الجليد.
تنبيه: يوصي باستخدام صوت تخف حماية الضميمة والإذن أثناء سونيكاتينج. الجهد العالي موجود في كابل العرض والترددات العالية الطاقة. تجنب لمس الجانبين السفينة عينة أو السفلي مع فحص نشط؛ قد صدع أو ذوبان البلاستيك. - وضع العينات في الثلاجة-80 درجة مئوية ~ 15 دقيقة، كما سونيكاتينج يمكن أن تولد الكثير من الحرارة.
- كرر الخطوات من 1، 1، 5-7.
ملاحظة: تأكد من البقاء باردة طوال فترة الإجراءات تحلل العينات. - الطرد المركزي هذه العينات في س 4,000 ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. عند هذه النقطة، سيتم فصل العينة إلى الطبقة العليا المستقلب إينتيرلايير البروتين، وانخفاض طبقة الدهن (وبيليه الحطام المتبقي). انظر الشكل 1.
- وضع العينات على الجليد دلو الجليد، وداخل غطاء دخان واستخدام 10 مل زجاج ماصة مصلية، إزالة الطبقات العليا المستقلب من أنبوبين 50 مل في قنينة زجاجية كبيرة واحدة.
ملاحظة: تجنب يسفط أي طبقة البروتين إلى الماصة؛ ترك طبقة صغيرة من المستقلب إذا لزم الأمر. - إمالة أنبوب 50 مل بالإفراج عن إينتيرلايير البروتين حيث يكون العائمة مجاناً عند طبقة الدهن أقل قليلاً. باستخدام ملعقة مسطحة رئيس مختبر فولاذ المقاوم للصدأ نظيفة، حلج القطن كلا من إينتيرلاييرس البروتين بعناية ووضعها معا في أنبوب 50 مل واحد جديد.
- استخدام ماصة مصلية زجاج 25 مل، إزالة طبقات الدهون أقل في قنينة زجاجية كبيرة واحدة.
ملاحظة: في محاولة لتجنب تطمح جزيئات التربة؛ ومع ذلك، تطمح بعض التربة الحطام والجزيئات جنبا إلى جنب مع الدهون سيتم إزالة في وقت لاحق. - مكان تنفس الأغشية عبر الجزء العلوي من المستقلب والدهن زجاج قارورة وجاف في مركز فراغ حتى جفاف (الدهون ح ~ 4-5، والايضات بين عشية وضحاها).
- لأنبوب عينة البروتين وأنابيب بيليه الحطام المتبقي، بإضافة 20 مل من الميثانول المثلج لكل منهما ودوامه. ويتم ذلك بالكريات الحطام شطف كلوروفورم قبل محاولة لجعل أي البروتين المتبقية الممكنة من تحت الأنقاض قبل ينثر.
- أجهزة الطرد المركزي الكريات الحطام والبروتين المدى في 4,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، ثم صب الميثانول في حاوية نفايات الخطرة داخل غطاء دخان.
- تجميد الكريات البروتين والحطام في النتروجين السائل والجاف في ليوفيليزير (مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية بسبب الميثانول بعد نقطة تجميد منخفضة جداً من-98 درجة مئوية) لمدة ساعة ~ 2.
ملاحظة: لا جاف الإفراط الكريات، كما أنها ستكون أكثر صعوبة جعل. - إضافة 10 مل من البروتين المخزن المؤقت سولوبيليزيشن (الحزب الديمقراطي الصربي 4 ٪، 100 مم DTT (DL-ديثيوثريتول) في 50 ملم تريس العازلة، pH 8.0؛ انظر التكميلية كاشف الإعداد) إلى أنبوب البينية البروتين و 20 مل لكل من الكريات الحطام.
تنبيه: الحزب الديمقراطي الصربي يسبب السمية الحادة والقابلة للاشتعال. من الجلد والعيون، ومجرى الهواء مهيجة. ارتداء قفازات ونظارات السلامة. - في غطاء الدخان، sonicate المسبار العينات في السعة 20% لمدة 30 ق لتقديمهم إلى الحل. دوامة لمدة 2 دقيقة.
- ضع العينة البينية البروتين في المدورة أنبوب مختبر مدة 30 دقيقة 300 لفة في الدقيقة، 50 درجة مئوية، جعل البروتين.
- أفقياً دوامة العينات الحطام 10 دقيقة إضافية أي الخلايا المتبقية سليمة، ثم تدوير مع عينات البروتين البينية ل 20 دقيقة المتبقية.
- الطرد المركزي جميع العينات في س 4,500 ز لمدة 10 دقائق، درجة حرارة الغرفة (RT)، وجمع المادة طافية من كل أنبوبة كل عينة إلى أنبوبين 50 مل.
- قم بإضافة 10 مل solubilization المخزن المؤقت للبروتين بيليه البينية، ثم sonicate ودوامه بالعودة إلى الحل وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.
- دمج في supernatants اثنان أنابيب 50 مل على قدم المساواة والطرد المركزي في 8,000 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية، في دوار دلو زاوية ثابتة.
ملاحظة: الطرد المركزي نهائي ضروري لإزالة المواد الدبالية تلويث المفرط. - صب في supernatants في أنبوبين 50 مل حيث أن هناك 30 مل في كل منهما. ثم، باستخدام 10 مل زجاج ماصة مصلية، إضافة 7.5 مل من كلورفورم الميثيل (حمض التريكلوروسيتيك) لكل أنبوبة. دوامة في الحل. وهذا يجعل نسبة 20% TCA في كل عينة 30 مل (ضبط تبعاً لذلك)،
تنبيه: TCA هو الكاوية والسامة ومايو تسبب حروق الجلد. ارتداء قفازات ونظارات السلامة. - وضع العينات في ثلاجة-20 درجة مئوية ل 2 (ح) بين عشية وضحاها.
ملاحظة: البروتينات سوف يعجل عادة ضمن ح 1، لكن يمكن أن يكون بين عشية وضحاها اليسار (ما يصل إلى 18 س).
ملاحظة: لا تدع استخراج TCA الذهاب أطول من ح 18 بسبب التحلل حمض ممكن من البروتين. إذا كان يتم تجميد العينة، الذوبان في الجليد؛ لا تدع العينة الاحماء في الماضي ذوبان الجليد. - بيليه البروتين سرع، الطرد المركزي العينة في 4,500 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية، وصب المادة طافية في النفايات.
- إضافة 10 مل الأسيتون المثلج 100% لكل بروتين بيليه، ودوامه، والجمع بين مثل الكريات في أنبوب واحد.
- الطرد المركزي الأنبوبة المحتوية على بيليه مجتمعة (باستخدام توازن)، ومن ثم صب المادة طافية في النفايات.
تنبيه: الأسيتون قد يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي، وهو سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء قفازات سلامة النظارات ومعطف معمل، والعمل في غطاء دخان. - أغسل بيليه مرتين باستخدام 1.5 مل من الأسيتون ونقل أخيرا إلى أنبوب 2 مل للدوران النهائية في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- صب المادة طافية في النفايات وتسمح بيليه لتجف مقلوب على مسح ورقة في غطاء دخان ~ 20 دقيقة أو ضمن إطار دفق نيتروجين حتى تبدأ بيليه قليلاً للقضاء.
- إضافة 100-200 ميليلتر من المخزن المؤقت سولوبيليزيشن البروتين، تبعاً لحجم بيليه.
ملاحظة: الاحتفاظ بحجم المخزن المؤقت سولوبيليزيشن إضافة إلى عينة منخفضة قدر الإمكان. يمكن فقط استخدام اللاحقة تصفية مساعدة نموذج إعداد (FASP) ما يصل إلى 50 ميكروليتر من عينة solubilized كل عمود؛ أي يجب أن يكون أكثر انقسام إلى أعمدة فاسب متعددة. - Sonicate ودوامه بيليه في الحل. علما بأن العينة قد تكون اللزوجة بسبب المواد الدبالية عجل جنبا إلى جنب مع البروتين، التي سيتم إزالتها مع الطرد المركزي لاحقة.
- هزة العينة في حاضنة/شاكر مدة 30 دقيقة 300 لفة في الدقيقة، 40 درجة مئوية، جعل البروتين في الحل، والمضي قدما لهضم البروتين.
- الأداة الإضافية تجميد العينة في النتروجين السائل ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى على استعداد لهضم البروتين.
2-المادة الدهنية إعداد (توقيت ~ 20 دقيقة)
- وبمجرد عينات الدهن الجاف، إضافة 200 ميكروليتر من 2:1 كلوروفورم: الميثانول إلى القنينة، دوامة في الحل ونقل إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل، إضافة ميكروليتر 200 إضافية للزجاج فيال، دوامة و "الماصة؛" الدهون المتبقية ونقل إلى الأنبوب.
- الطرد المركزي بين الأنقاض من العينة في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية في قنينة الدهن الزجاج ومخزن في-20 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS/MS (تفاصيل إضافية ل LC-MS/MS في أساليب تكميلية).
- إذا لا يمكن تحليل العينات مباشرة بعد التحضير، الدهون تحتاج إلى تخزين في المذيبات في-20 درجة مئوية لمنع الأكسدة والتدهور.
3-المستقلب إعداد و Derivatization (توقيت ح ~ 5)
- في اليوم التالي لاستخراج، إزالة عينات المستقلب من "بطالة سرعة" وتخزين جافة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة ل derivatization والتحليل في GC. إذا لم يكن قيد التشغيل والايضات على نشرة مصورة عمومية، ثم إعداد عليها باستخدام البروتوكول المناسب لهذا الصك.
- مباشرة قبل ديريفاتيزينج الأيض للتحليل في GC، نقلها من القنينات الزجاجية الكبيرة بإضافة 200 ميكروليتر من الميثانول، فورتيكسينج، وإضافة إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل. كرر مرة واحدة.
- الطرد المركزي الأنبوب في 12,000 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية في قنينات زجاجية أصغر، إضافة غشاء تنفس إلى الأعلى، ويجف تماما في "بطالة" سرعة.
- ديريفاتيزي نواتج الأيض بإضافة 20 ميليلتر لحل ميثوكسياميني بعينه القنينة ودوامه لمدة 30 ثانية على فورتيكسير سرعة متوسطة.
تنبيه: هيدروكلوريد ميثوكسياميني يسبب حروق خطيرة وأضرار خطيرة بالعيون، وقد تسبب حساسية بتماس الجلد. ارتداء نظارات السلامة وقفازات ومعطف المعمل، والعمل في غطاء دخان. - استخدام سونيكاتور حمام لضمان حل العينة هو تماما.
- احتضان العينة في حاضنة مع غطاء منع تكثيف الحفاظ على 37 درجة مئوية عن 1 ساعة و 30 دقيقة مع لفة في الدقيقة 1,000 تهتز.
- عكس القنينة مرة واحدة لخلط العينات مع قطرات مركزة على سطح الغطاء. تدور العينة إلى أسفل في 1,000 غ س ل 1 دقيقة، الرايت
- أداء silylation بإضافة 80 ميليلتر (باستخدام المحاقن) ن-الميثيل-N-(تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي مع تريميثيلتشلوروسيلاني 1%. دوامة ل 10s.
تنبيه: مستفا + 1% فصليا يمكن أن يسبب تآكل الجلد وتلف العين الشديد السمية الشاملة لأعضاء مستهدفة محددة، وهو سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء نظارات السلامة وقفازات ومعطف المعمل، والعمل في غطاء دخان. - احتضان العينة في حاضنة مع غطاء منع تكثيف الحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع لفة في الدقيقة 1,000 تهتز.
- عكس القنينة مرة واحدة لخلط العينات مع قطرات مركزة على سطح الغطاء.
- تدور العينة إلى الأسفل لمدة 5 دقائق في 2,000 س ز، الرايت
- نقل الحل رياكتيد في قارورة المناسبة لتحليل GC-MS.
4-البروتين الهضم (توقيت د ~ 1)
- الطرد المركزي العينة في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق، الرايت، بيليه أي حطام.
- إجراء تصفية--ساعدت عينة-إعداد (FASP) لهضم فاسب باستخدام مجموعات (انظر الجدول للمواد) بعد تعديل تعليمات الشركة المصنعة31،32:
- إضافة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا المخزن المؤقت إلى عمود فاسب (500 ميكروليتر 30 ك موكو تدور التصفية).
- وبمجرد الانتهاء من العينة سينتريفوجينج، "الماصة؛" إيقاف المادة طافية (تجاهل بيليه) وإضافة تصل إلى 50 ميكروليتر من العينة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا في العمود.
ملاحظة: إضافة فقط يصل إلى 50 ميكروليتر من عينة كل عمود. إذا كان هناك أكثر من 50 ميكروليتر من عينة، استخدام أعمدة متعددة وتجمع بين الببتيدات بعد الهضم. فمن الأفضل أن تترك هذا الحجم منخفضة قدر الإمكان (30 ميليلتر مثالي) بغية ضمان FASP عمود سيؤدي إلى إزالة كل من الحزب الديمقراطي الصربي الذي هائلة يمكن أن تتداخل مع التحليل الشامل المواصفات. - مكان العمود في أنبوب شملت 1.5 مل والطرد المركزي العينة في 14,000 ز خ ل 30 دقيقة، الرايت
- إزالة التدفق عبر في النفايات وإضافة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا إلى العمود والطرد المركزي مرة أخرى.
- كرر الخطوة السابقة مرة أخرى ليصبح مجموع 3 اليوريا يشطف.
ملاحظة: تأكد من العينة يذهب ما يقرب من جفاف في العمود، إذا كان هناك أي أكثر من ~ 30 ميليلتر المتبقية على التصفية بعد كل دورة، مواصلة سينتريفوجينج. - إضافة ميكروليتر 400 50 مم NH4HCO3 وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 ز س لمدة 20 دقيقة، وتجاهل النفايات وكرر مرة واحدة.
- نقل الأعمدة إلى أنبوب الطرد مركزي نظيفة 1.5 مل.
- إضافة ميكروليتر 75 التربسين هضم المخزن المؤقت إلى الأعمدة واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3 في حاضنة مع غطاء منع تكثيف في 750 دورة في الدقيقة.
- إضافة ميليلتر 40 50 مم NH4HCO3 إلى الأعمدة.
- الطرد المركزي العينة في س 14,000 ز لمدة 15 دقيقة لجمع الببتيدات في الأنبوب مع الحفاظ على ملوثات عالية الوزن الجزيئي على رأس العمود.
- إضافة 40 ميكروليتر من 50 مم NH4HCO3 إلى العمود والطرد المركزي مرة أخرى.
- تجاهل العمود, الجاف أسفل الببتيدات في الأنبوب في "بطالة" سرعة ~ 30 ميليلتر، واتفاق التعاون الأساسي المقايسة (طقم مقايسة البروتين حمض بيسينتشونينيك؛ انظر الجدول للمواد) الببتيدات.
- بشكل اختياري، أداء خطوة التنظيف في حالة الاشتباه في تلوث مخزونات النشر الاستراتيجي (فقاعات مرئية)33. ويجب أن يتم استخراج مرحلة صلبة بعد ذلك في حالة اختيار هذا الخيار. تتوفر معلومات مفصلة حول هذا الأسلوب تنظيف في أساليب تكميلية.
- تخفيف العينة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد أو المضي قدما بشكل اختياري إلى تجزئة [هبلك] (الخطوتين التاليتين).
- أن يجزئ، تخفف من العينات إلى حجم 400 ميليلتر مع المخزن المؤقت فورمات الأمونيوم 10 ملم (pH 10.0).
- حل على عمود C18 (انظر الجدول للمواد) بفصل في 0.5 مل/دقيقة باستخدام نظام [هبلك] مع مراحل المتنقلة (A) 10 ملم فورمات الأمونيوم، pH 10.0 و (ب) 10 مم فورمات الأمونيوم، pH 10.0/الاسيتو الانيتريل (10:90).
- ضبط التدرج من نسبة 100% A إلى 95% A خلال أول 10 دقيقة، 95% A إلى 65% A خلال دقيقة 10 إلى 70، أ 65% إلى 30% على مدى دقيقة 70 إلى 85، الحفاظ على الأقل 30% A خلال دقيقة 85 إلى 95.
- إعادة توازن مع 100% A خلال دقيقة 95 إلى 105 بنسبة 100% A حتى 120 دقيقة.
- جمع الكسور كل دقيقة 1.25 (96 الكسور عبر التدرج الكامل) وأخيراً الجمع بين كل صف لما مجموعة 12 عينات أو كل صف آخر للعينات 24 (كل منها n = 8 أو n = 4 الكسور المجمعة).
- الجاف لجميع الكسور تحت الفراغ وإضافة 15 ميليلتر من الماء عالي النقاوة لكل مخزن في-20 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما تستخدم بروتوكول مبليكس لاستخراج جزيئات من كانساس البراري الأصلي التربة (تربة موليسول)، قدمت تحليلات ثلاث نتائج الببتيدات 3376 والدهون 105 والايضات القطبية 102 (كل هوية فريدة من نوعها). في حين كان البروتوكول مبليكس راسخة لاستخراج عامة من الدهون ونواتج الأيض12،13،،من1415،،من1617،18 ،19،،من2021،،من2223،24،25،26،27 ،،من2829،،من3034، المقارنة بأساليب الاستخراج البروتين التربة المشتركة للتحاليل الميكروبية، مثل مجموعات استخراج البروتين التربة (انظر الجدول من المواد)، وكذلك يتم تقييم مخزونات النشر الاستراتيجي (دوديسيل كبريتات الصوديوم) الاستخراج35، هنا. لتقييم هذه التقنيات، استخرجت مع كل نهج كانساس البراري الأصلي البروتينات التربة وتحليلها مباشرة مع المرحلة عكس LC-MS/MS باستخدام نظام UPLC مقرونا هجين الرباعي/أوربيتراب مطياف كتلة. وتتوفر معلومات مفصلة حول معلمات الأسلوب في أساليب تكميلية. الببتيد التجريبية الناتجة MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف من كل نهج استخراج قورنت مع توقع الببتيد تسلسل من الممثل كانساس البراري الأصلي ميتاجينومي2 باستخدام MS صرامة-احتمال الطيفية قطع GF + 1 × 10 -10 36 , 37 وقطع أسلحة خطأ أقل من 5 جزء في المليون. تجدر الإشارة إلى أن التحاليل المستخرجة من التربة باستخدام بروتوكول مبليكس مناسبة للدراسات المستندة إلى MS وغيرها من التقنيات التحليلية. عند مقارنة ثلاثة في البداية إنشاء نسخ متماثلة من الأساليب المعروفة موبيو والحزب الديمقراطي الصربي، 12 في المائة فقط من الببتيدات تتداخل بين طريقتي عرض تعقيد المجتمع الميكروبي واستخراج مختلف الآثار (الشكل 2). عند مقارنة مبليكس مع مقتطفات موبيو والحزب الديمقراطي الصربي، اكتشفت ~ 38% الببتيدات مراقبتها باستخدام الأسلوب مبليكس أيضا عند استخدام مخزونات النشر الاستراتيجي و/أو موبيو الاستخراج (الشكل 2). نظراً لعدد الأنواع في كانساس التربة المجتمع البكتيرية و ميتاجينومي2، تداخل تعريفات الببتيد معقول ونظرا لتعقيدها، الجمع بين النهج التي تستخرج الببتيدات أكثر من كل وحدة 35-أيضا، منذ هذه العينات غير المجزأ مع الاسبيرين وتحليلها من قبل فقط 1-الأبعاد LC-MS/MS، تعقد عينة عالية للغاية ربما يسبب بعض التحيز في الكشف عن سبب تركيزات مختلفة الببتيد المستخرجة بواسطة كل نهج. كما تم تطبيق بروتوكول مبليكس لأنواع التربة الأخرى مثل الأرض الدائمة التجمد، والأراضي الرطبة، وفي جميع الحالات نتائج أولية من البروتين ذات نوعية مماثلة كانساس البراري الأصلي التربة البيانات المعروضة هنا.
انطباق واسع النطاق للنهج مبليكس، وقد تم سابقا تقييم باستخدام مجموعة متنوعة من العينات، بما في ذلك أرتشايون أسيدوكالداريوس سولفولوبوس، أونيسيانوباكتيريال كونسورتيوم38، وأنسجة قشرة المخ الماوس، والبول البشري، و أوراق من نبات التمويل (الشكل 2)10. لجميع العينات باستثناء A.thaliana، الاستخراج اليوريا هي الطريقة الأكثر شيوعاً لاستخراج البروتينات، حتى أنها استخدمت كنهج التحكم للتقييم. تم مقارنة النتائج مبليكس ألف- التمويل لاستخراج أداء مع حمض التريكلوروسيتيك (TCA) لأن أوراق النبات غنية بالمركبات الفينولية التي يجب إزالتها قبل MS تحليلات39. وفي جميع الحالات، كان عدد البروتينات ولاحظ من الأسلوب مبليكس مماثلة لتلك لعناصر التحكم10، التي تشير إلى فائدتها للعديد من نماذج مختلفة الأنواع. وكانت هناك أيضا لا الاتجاهات المرتبطة بفئات محددة من البروتين المستخرج في جميع أنواع العينات (بما في ذلك التربة). ولذلك، يجعل من انطباق واسع النطاق من مبليكس إلى العديد من النظم البيولوجية والبيئية نهجاً واعداً.
رقم 1. تخطيطي لائحة عملية مبليكس، في أي نواتج الأيض، البروتينات والدهون تستخرج في نفس الوقت من نفس العينة التربة لتحليلات MS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. إجراء متداخل الرسوم البيانية التي توضح التداخل الببتيد لمجموعة متنوعة من العينات المستخرجة باستخدام مبليكس وطريقة استخراج بروتين قياسية المستندة إلى اليوريا عادة. يترك تكييف البيانات من استخراج مبليكس من أرتشايون S.acidocaldarius، واتحاد أونيسيانوباكتيريال والبول البشري، قشرة الدماغ الماوس، ومصنع A.thaliana من ناكاياسو، أ. س. وآخرون عام 201610. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من المهم أن نلاحظ أن ليس جميع المختبرات سوف يكون نفس المعدات المتاحة حتى يمكن تكييف أساليب معينة، وعلى سبيل المثال فإن الخطوة تحلل،. هنا نستخدم فورتيكسينج وسونيكاتينج، أن استخدام الخافق حبة كبيرة 50 مل العمل. إذا لم يتوفر ليوفيليزير مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية، ثم يمكن أن تجفف العينات تحت تيار نيتروجين. أيضا أنواع التربة تختلف اختلافاً كبيرا ويمكن أن تشمل الرمل والطمي والطين، الخث والصلصالي (إلخ)، وأنها يمكن أن تختلف أيضا بناء على درجة الحموضة والملوحة وثراء المواد العضوية. كل من هذه الفروق يمكن أن تؤثر على البروتوكول، ولذلك فمن المهم أن تكون مرنة وإجراء التعديلات عند الحاجة. بيد أنه من الحاسم، أن تبقى النسب والنسب المئوية نفسها.
ويبين البروتوكول مبليكس وعدا كبيرا للتطبيق في العديد من النظم البيولوجية والبيئية والقدرة على تمكين تحليلات omic المتعددة للمجتمعات الميكروبية في التربة. يوضح المقارنات السابقة من مبليكس إلى البروتوكولات الأخرى استخراج لنظم متنوعة بدرجة عالية من التداخل الببتيد10. بيد أن أحد لاحظ الحد هو أن مبليكس لم تنطبق على بروتينات بلازما الدم التي بحاجة إلى أن تنضب. وفي هذه الحالات، لم يعترف البروتينات سرع أيضا بالأجسام المضادة في أعمدة إيمونوديبليشن اللازمة للتغطية الواسعة للبروتين البلازما. ولذلك، ينبغي أن تستخدم نهج استخراج أكثر قياسية في ظل هذه الظروف. قيد إضافي واحد وأشار إلى نهج استخراج مبليكس أن أنه لا تمييز بين البروتين داخل الخلية وخارج الخلية، إلا أن هذا ينطبق على جميع التربة البروتين استخراج البروتوكولات الأخرى كذلك.
في هذه المخطوطة، قدمت مبليكس نتائج الببتيدات 3376 والدهون 105 102 والايضات القطبية في كانساس البراري الأصلي التربة باستخدام أساليب استخراج وتحليل مفصل في المقطع بروتوكول. ولوحظ تداخل أفضل بين الببتيدات المستخرجة في السيطرة والنهج مبليكس النظم الفردية مقارنة بالمجتمع التربة الميكروبية (الشكل 2). وهذا ليس قيداً، ولكن إحدى النتائج المترتبة على العمل مع المجتمعات الميكروبية التربة معقدة للغاية. هذه النتائج هي لاحظت كذلك كما لا تتداخل تقنيات استخراج التربة المعروفة من الحزب الديمقراطي الصربي وموبيو جيدا أما بسبب التنوع الكبير وصعوبات استخراج التربة البروتينات على قدم المساواة. من المثير للاهتمام، البروتوكول مبليكس يسمح بتحديد هوية الببتيدات إجمالي أكثر من الحزب الديمقراطي الصربي أو موبيو وأيضا الكشف عن مكونات إضافية لا ينظر في أي تحليل.
تجعل هذه الملاحظات مبليكس تقنية واعدة جداً للعمل مع أحجام عينات صغيرة والتقليل عموما multi-omic تجريبية تقلب وتخفيض وقت إعداد العينة. تبدو مزايا ممكنة مع مبليكس لتمكين قدرات متعددة-أوميك والتحليلات اللازمة لدراسات المجتمع الميكروبي على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر ناثان جونسون لمساعدته في إعداد الأرقام. هذا البحث وأيده اوميكس عموم البرنامج الذي تموله وزارة الطاقة الأمريكية مكتب البيولوجية والبحوث البيئية (برنامج العلوم المجيني)، ميكروبيوميس في المرحلة الانتقالية (النعناع) "مختبر الموجهة للبحث والتطوير" المبادرة في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ، فضلا عن الوطنية معاهد للصحة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (R01 ES022190)، والمعاهد الوطنية للصحة (P42 ES027704). كيبج يود أن يشكر R21 HD084788 لتقديم الدعم المالي لتطوير والتحقق من صحة رواية متعددة-omic تقنيات الاستخراج. هذا العمل قد أنجز في جورج ر. إيلي البيئية الجزيئي العلوم المختبرية (امسل)، منشأة الكيان التشغيلي المعين لمستخدم علمية وطنية في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ (بننل). بننل برنامج متعدد مختبر وطني تشغلها Battelle للكيان التشغيلي المعين تحت العقد دي-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
