Summary
Un protocolo se presenta de forma simultánea extracción de metabolitos, proteínas y lípidos en una muestra de suelo solo, permitiendo tiempos de preparación de muestra reducida y multi-omic análisis de espectrometría de masas de las muestras con cantidades limitadas.
Abstract
Espectrometría de masas (MS)-base metaproteomic integrado, metabolómicos y lipidómicos (multi-omic) estudios están transformando nuestra capacidad de comprender y caracterizar las comunidades microbianas en sistemas ambientales y biológicos. Estas mediciones están permitiendo incluso mejorados análisis de comunidades microbianas de suelo complejas, que son los más complejos sistemas microbianos conocidos hasta la fecha. Análisis multi-omic, sin embargo, tienen problemas de preparación de muestra, puesto que típicamente son necesarias extracciones separadas para cada estudio de omic, así grandemente ampliando el tiempo de preparación y cantidad de muestra necesaria. Para solucionar esta limitación, un 3 en 1 método para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) de la misma muestra de suelo fue creado mediante la adaptación de un enfoque basado en solvente. Este protocolo MPLEx ha demostrado para ser sencilla y robusta para muchos tipos de muestras, incluso cuando se utilizan para cantidades limitadas de muestras complejas. El método MPLEx también permitió la medición rápida multi-omic necesaria para obtener una mejor comprensión de los miembros de cada comunidad microbiana, mientras que la evaluación de los cambios ocurridos en las perturbaciones biológicas y ambientales.
Introduction
Evaluación de las comunidades microbianas del suelo tiene importantes implicaciones para la comprensión de carbono bicicleta y el cambio climático. Sin embargo estudios recientes han puesto de manifiesto dificultades, como la falta de los genomas secuenciados de microbiota en varios tipos de suelo y la función desconocida de muchas de las proteínas detectadas. Resultado de estos desafíos debido al suelo que la comunidad microbiana más compleja conocida hasta la fecha1,2,3. Análisis multi-omic, que combinan los resultados de la metagenómica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolómicos y lipidómicos estudios, recientemente se han aplicado en numerosos estudios de suelo para obtener una mayor comprensión en los microbios presentes, mientras que obtener información completa sobre los cambios moleculares que debido a las perturbaciones ambientales1,4,5. Un reto con multi-omic estudios que es la espectrometría de masas (MS)-basado en mediciones metaproteomic, metabolómicos y lipidómicos requieren típicamente un proceso de extracción específico para cada omic que MS compatible6,7 , 8 , 9. estos procedimientos precisa hacen su aplicación extremadamente difícil o imposible cuando sólo hay una cantidad limitada de muestra disponible. Estos desafíos han llevado a investigar un simultáneo metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) método de extracción capaz de masas o volúmenes de muestra pequeños, mejorar la precisión y proporcionando más rápidas preparaciones de muestra para los análisis de tres 10. hasta la fecha, no hay ningún procedimiento de extracción suelo alternativo que puede lograr todos estos objetivos.
Para habilitar multi-omic global análisis de una muestra de suelo solo, un protocolo de extracción con disolvente orgánico basado en cloroformo, metanol y agua separaciones fue utilizado10. Este método fue desarrollado originalmente para lípido total extracciones9,11 y más recientemente fue modificado para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos de una sola muestra12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, lo que permite menor cantidad de muestra y variabilidad experimental10. En el protocolo MPLEx, cloroformo no es miscible con agua, que proporciona la base para el trifásico separación química de los componentes de la muestra en distintas fracciones. Por lo tanto, la fase superior acuosa contiene los metabolitos hidrofílicos, seguidos de un disco de proteína y una capa lipídica en la fase de cloroformo del fondo (figura 1). Cuando MPLEx se aplica a la mayoría de los suelos, desechos de partículas se acumulan en la parte inferior de los tubos de muestreo y pueden ser desechado después de que se recogen todas las capas. Cada tipo de suelo puede ser diferente, sin embargo y en suelos altamente orgánicos como turba, los restos de suelo permanece en la capa media y no caen en la parte inferior del tubo de muestreo. MPLEx proporciona varias ventajas al aislamiento de la molécula de múltiples tipos de la misma muestra como 1) pequeñas cantidades de muestra pueden utilizarse para el análisis de multi-omic, 2) multi-omic extracciones de la misma muestra disminución variabilidad general experimental, y 3) mayor número de muestras se puede preparar mucho más rápido para mayor rendimiento de estudios10. Juntos estos beneficios son vitales para ofrecer mejores capacidades de medición para la evaluación de las muestras de suelo y de sus comunidades microbianas complejas.
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Protocol
Nota: Suelos muy húmedos pueden ser liofilizados antes de la extracción sin perjuicio de la eficacia de la extracción. Suelo mojado también se puede utilizar pero debe considerarse al agregar reactivos en proporciones específicas.
Nota: Se recomienda usar 20 g de peso de suelo seco por extracción, que debe ser dividida entre los dos tubos de 50 mL (máximo de 10 g de suelo por el tubo de 50 mL). Las extracciones se pueden escalar hacia arriba o abajo dependiendo de la muestra disponible.
Nota: Las muestras de suelo seco pueden ser tamizadas a través de una pantalla de 3 mm con el fin de homogeneizar y eliminar piedras y raíces pequeñas. Tamiz no de muestras de suelo húmedo, como la muestra se atranca en la pantalla.
1. lisis celular y extracción de metabolitos, proteínas y lípidos (sincronización d ~ 1) del suelo
- Por muestra de suelo de 20 g, pesar 10 g en dos tubos separados 50 mL metanol/cloroformo compatible. Sea extremadamente cuidadoso con los tubos escogidos, como cloroformo lixiviará a mayoría de los plásticos, contaminar las muestras. Utilizar el vidrio siempre que sea posible o plástico tubos hechas de polipropileno o politetrafluoroetileno (PTFE).
Nota: Mantener el suelo en el hielo y tan frescas como sea posible durante los primeros pasos de pesaje y homogeneización. - Añadir 10 mL de cloroformo-lavado de acero inoxidable y perlas de granate a cada tubo. En el hielo, añadir 4 mL de frío ultrapura (véase Tabla de materiales para sistema de la purificación) de agua a cada tubo (una muestra dividida entre dos tubos) y transferir las muestras en un cubo de hielo en una campana de humos.
- Rápidamente utilizando una pipeta serológica de vidrio de 25 mL, añadir 20 mL de helado 2:1 cloroformo: metanol (v/v).
Atención: Cloroformo: metanol tiene efectos de salud potenciales agudos: irritación al sistema respiratorio, irritación y posibles quemaduras químicas de la piel. Puede afectar a los riñones, hígado y corazón. Guantes, ropa y gafas de protección adecuadas y siempre trabajar en una campana de humos. - Apriete los párpados y vórtice en solución. choloroform:methanol 2:1 ayuda a romper la pared celular de procariotas y también inactiva la actividades enzimáticas.
- Fije los tubos y accesorios de 50 mL tubo vortex horizontal vortex durante 10 min a 4 ° C dentro de una nevera si es posible. Luego, coloque las muestras dentro de un congelador de-80 ° C ~ 15 minutos para enfriar completamente.
- Utilizando un sonicador de sonda dentro de una campana de humos, someter a ultrasonidos cada muestra con una sonda de 6 mm (1/4") en amplitud 60% para 30 s en el hielo.
PRECAUCIÓN: Se recomienda utilizar un sonido disminuir la protección del recinto y oído mientras sonicando. Alto voltaje está presente en el cable de alimentación y de alta frecuencia. Evite tocar el fondo o las paredes del vaso de muestra con una sonda activa; puede romper o derretir el plástico. - Coloque las muestras en el congelador de-80 ° C de ~ 15 minutos, como sonicando puede generar mucho calor.
- Repita los pasos 1.5-1.7.
Nota: Asegúrese de que las muestras permanezcan frías durante todo el procedimiento de lisis. - Centrifugar las muestras a 4.000 x g durante 5 min, 4 ° C. En este punto, la muestra se separará en la capa superior del metabolito, la capa intermediaria de la proteína y la capa más baja de lípidos (y pellets de residuos restantes). Vea la figura 1.
- Coloque las muestras en hielo en una cubitera y, dentro de una campana de humos y usando una pipeta serológica de vidrio de 10 mL, retire las capas superiores del metabolito de los dos tubos de 50 mL en frasco de vidrio grande.
Nota: Evitar la aspiración de la capa de proteína dentro de la pipeta; Deje una pequeña capa de metabolito si es necesario. - Incline levemente el tubo de 50 mL para liberar la capa de proteína que está flotando libre en la capa más baja de lípidos. Cuidadosamente con una espátula de laboratorio de cabeza plana de acero inoxidable limpio, primicia de los separadores de proteínas y colocarlos juntos en un nuevo tubo de 50 mL.
- Usando una pipeta serológica de vidrio de 25 mL, retire las capas más bajas de lípidos en un frasco de cristal grande.
Nota: Tratar de evitar a las partículas del suelo; sin embargo, algunos residuos de suelo y partículas aspiraban junto con los lípidos se eliminará posteriormente. - Lugar las membranas transpirables en la parte superior del metabolito y lípidos frascos de vidrio y seco en un concentrador de vacío hasta sequedad (lípidos ~ 4-5 h, metabolitos durante la noche).
- El tubo de muestra de la proteína y los tubos de pellets de residuos restantes, añadir 20 mL de metanol helada a cada uno y de vortex. Esto se hace para las pelotillas de escombros para enjuagar cloroformo antes de intentar solubilizar cualquier posible proteína restante fuera de la basura antes de tirarlo.
- Centrifugar el pellets de residuos y la proteína de la capa intermediaria a 4.000 x g durante 5 min, 4 ° C, luego decantar el metanol en un contenedor de residuos peligrosos dentro de una campana de humos.
- Congelar las pelotillas de la proteína y los residuos en nitrógeno líquido y en seco en un liofilizador (con una temperatura del colector de-105 ° C por metanol tiene un muy bajo punto de congelación de-98 ° C) durante 2 horas.
Nota: No seque demasiado las pelotillas, que serán más difíciles de solubilizar. - Añadir 10 mL de tampón de solubilización de proteínas (4% SDS, 100mM DTT (DL-Ditiotreitol) en 50mM de tampón tris, pH 8.0; vea Configuración reactivo complementario) a la capa intermediaria tubo de proteína y 20 mL a cada uno de los pellets de residuos.
PRECAUCIÓN: SDS causa toxicidad aguda y es inflamable. Es un irritante de las vías respiratorias, piel y ojo. Use guantes y gafas de seguridad. - En campana, sonda someter a ultrasonidos las muestras a 20% amplitud de 30 s para solución. Vortex por 2 min.
- Coloque la muestra de proteína capa intermediaria en un agitador de tubo de laboratorio durante 30 min a 300 rpm, 50 ° C, para solubilizar la proteína.
- Horizontal vórtice las muestras de escombros por un adicional 10 min para lyse las células intactas restantes, luego gire con las muestras de proteína capa intermediaria para los restantes 20 minutos.
- Centrifugar todas las muestras a 4.500 x g durante 10 min, temperatura ambiente (RT) y recoger el sobrenadante de cada tubo por muestra en dos tubos de 50 mL.
- Añadir 10 mL de solubilización del almacenador intermediario para el precipitado de proteína capa intermediaria, luego someter a ultrasonidos y vórtice en solución y centrifugar como antes.
- Igualmente se combinan los sobrenadantes en los dos tubos de 50 mL y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min, 4 ° C, en un rotor de ángulo fijo cubo.
Nota: Una centrifugación final es necesario para eliminar la contaminación excesiva de las sustancias húmicas. - Decantar el sobrenadante en dos tubos de 50 mL por lo que hay 30 mL en cada uno. Luego, utilizando una pipeta serológica de vidrio de 10 mL, añadir 7,5 mL de TCA (ácido tricloroacético) a cada tubo. Vórtice en solución. Esto hace que 20% TCA en cada muestra de 30 mL (Ayuste),
PRECAUCIÓN: TCA es cáustico, tóxico y mayo causar quemaduras en la piel. Use guantes y gafas de seguridad. - Coloque las muestras en un congelador de-20 ° C por 2 h para toda la noche.
Nota: Las proteínas precipitan típicamente dentro de 1 h pero pueden ser dejado toda la noche (hasta 18 h).
Nota: No deje que la extracción del TCA van más de 18 h debido a la posible hidrólisis ácida de la proteína. Si la muestra es congelada, la descongele el hielo; No permita que la muestra caliente más allá de deshielo. - Para la proteína precipitada de la pelotilla, centrifugar la muestra a 4.500 x g durante 10 min, 4 ° C y decantar el sobrenadante en residuos.
- Añadir 10 mL de acetona helada 100% a cada pellet de proteína, vortex y se combinan como pelotillas en un tubo.
- Centrifugar el tubo que contiene la pastilla combinada (con balanza) y luego decantar el sobrenadante en residuos.
PRECAUCIÓN: La acetona puede causar irritación de la piel y los ojos y vías respiratorias y es un líquido inflamable y el vapor de. Use gafas de seguridad guantes y una bata de laboratorio, en una campana de humos. - Lavar el pellet dos veces con 1,5 mL de acetona y por último transferir a un tubo de 2 mL para el final de la vuelta a 10.000 x g durante 5 minutos.
- Decantar el sobrenadante en residuos y permiten la pelotilla secar invertida en una toallita de papel en una campana de humos para ~ 20 min o bajo una corriente de nitrógeno hasta que el pellet ligeramente comienza a agrietarse.
- Añadir 100-200 μL del buffer de solubilización de proteína, dependiendo del tamaño de la pelotilla.
Nota: Mantenga el volumen de tampón de solubilización añadido a la muestra lo más baja posible. Posterior filtro asistido por ejemplo preparación (FASP) sólo puede utilizar hasta 50 μL de muestra solubilizado por columna; alguno más debe ser dividido en varias columnas FASP. - Someter a ultrasonidos y agitar el sedimento en solución. Tenga en cuenta que la muestra puede ser viscosa debido a sustancias húmicas precipitando junto con la proteína, que se eliminará con una posterior centrifugación.
- Agite la muestra en un incubadora/agitador durante 30 min a 300 rpm, 40 ° C, para solubilizar la proteína en solución y proceder a la digestión de proteínas.
- Snap freeze la muestra en nitrógeno líquido y guardar en un congelador de-80 ° C hasta que esté listo para la digestión de proteínas.
2. lípidos preparación (tiempo ~ 20 min)
- Una vez secas las muestras de lípidos, añadir 200 μL de 2:1 cloroformo: metanol al frasco, vortex en solución y la transferencia en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, agregar un adicional 200 μL para el vidrio del frasco, vortex y pipetee los restantes lípidos y transferir al tubo.
- Centrifugue los escombros fuera de la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un frasco de cristal lípidos y conservar a-20 ° C hasta análisis de LC-MS/MS (detalles adicionales para LC-MS/MS en Métodos complementarios).
- Si las muestras no pueden ser analizadas inmediatamente después de la preparación, los lípidos necesitan almacenarse en solvente a-20 ° C para evitar la oxidación y la degradación.
3. metabolito preparación y derivatización (tiempo ~ 5 h)
- El día después de la extracción, quitar las muestras del metabolito de la aspiradora de velocidad y almacenar seco a-20 ° C hasta que esté listo para la derivatización y análisis en el GC. Si no ejecuta los metabolitos en un GC, luego prepararlos usando el protocolo apropiado para el instrumento.
- Inmediatamente antes de derivatizando los metabolitos para análisis en el GC, transferirlas desde los frascos grandes de vidrio mediante la adición de 200 μL de metanol, Vortex y agregar a un tubo de polipropileno de 1.5 mL. Repetir una vez.
- Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 10 min, 4 ° C. Transferir el sobrenadante a pequeños frascos de cristal, añadir una membrana respirable a la parte superior y completamente seca en una aspiradora de velocidad.
- Derivatize los metabolitos añadiendo 20 μl de solución de methoxyamine al frasco de la muestra y vortex durante 30 s en un Vortex a velocidad media.
PRECAUCIÓN: El clorhidrato de Methoxyamine causa quemaduras graves y daños a los ojos, puede causar sensibilización por contacto con la piel. Usar gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio y trabajar en una campana de humos. - Utilice un sonicador de baño para asegurar que la muestra esté completamente disuelta.
- Incubar la muestra en una incubadora con una tapa de condensación prevención mantenida a 37 ° C por 1 h 30 min con agitación de 1.000 rpm.
- Invierta el frasco de una vez para mezclar las muestras con gotas condensadas en la superficie de la tapa. Desactivación la muestra a 1.000 x g durante 1 min, RT
- Realizar silanización agregando 80 μl (utilizando una jeringa) de N-metil - N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano % 1. Vortex para 10s.
PRECAUCIÓN: MSTFA + 1% TMCS puede causar corrosión de la piel, daños oculares graves y toxicidad para los órganos específicos y es un líquido inflamable y el vapor. Usar gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio y trabajar en una campana de humos. - Incubar la muestra en una incubadora con una tapa de condensación prevención mantenida a 37 ° C por 30 min con agitación de 1.000 rpm.
- Invierta el frasco de una vez para mezclar las muestras con gotas condensadas en la superficie de la tapa.
- Desactivación la muestra durante 5 min a 2.000 x g, RT
- Transferir la solución reaccionada en frascos apropiados para el análisis de GC-MS.
4. proteína digestión (tiempo ~ 1 d)
- Centrifugar la muestra a 15.000 x g durante 5 min, RT, para que sedimenten los residuos.
- Realizar filtro-ayudado--preparación de muestras (FASP) para la digestión utilizando FASP kits (véase Tabla de materiales) siguiente modificado instrucciones31,32 del fabricante:
- Añadir 400 μL de la solución de urea de 8 M en una columna FASP (500 filtro MWCO de spin μL de 30 K).
- Una vez terminada la muestra centrifugando, pipeta de sobrenadante (Deseche los pellets) y añadir hasta 50 μL de la muestra a 400 μL de urea de 8 M en la columna.
Nota: Agregar sólo hasta 50 μL de muestra por columna. Si hay más de 50 μL de muestra, utilizar múltiples columnas y los péptidos se combinan después de la digestión. Es mejor dejar este volumen tan bajo como sea posible (30 μL es ideal) para asegurar el FASP columna eliminará de la SDS que dramáticamente puede interferir con el análisis de masa spec. - Coloque la columna en el tubo incluido 1.5 mL y centrifugar la muestra a 14.000 x g por 30 min, RT
- Quitar el flujo a través a basura y añadir 400 μL de urea de 8 M para la columna y centrifugar nuevamente.
- Repita el paso anterior una vez más para un total de 3 enjuagues de urea.
Nota: Asegúrese de que la muestra va cerca de sequedad en la columna, si hay alguna más de ~ 30 μL queda en el filtro después de cada vuelta, continuar con centrifugación. - Añadir 400 μL de 50 mM NH4HCO3 y centrifugar a 14.000 x g por 20 min, desechar los residuos y repetir una vez.
- Transferir las columnas a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL.
- Añadir 75 μL de tampón de digestión de tripsina a las columnas e incubar a 37 ° C durante 3 horas en una incubadora con una tapa de condensación prevención a 750 rpm.
- Agregar 40 μl de 50 mM NH4HCO3 para las columnas.
- Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 15 minutos recoger los péptidos en el tubo manteniendo los contaminantes de alto peso molecular en la cima de la columna.
- Agregar 40 μL de 50mM NH4HCO3 a la columna y centrifugue de nuevo.
- Deseche el columna, seco abajo los péptidos en el tubo de una aspiradora de velocidad a 30 μl y ensayo BCA (kit de ensayo de proteína ácido Bicinchoninic; véase Tabla de materiales) los péptidos.
- Opcionalmente, realizar un paso de limpiar si se sospecha de contaminación de la SDS (burbujas visibles)33. Una extracción en fase sólida debe hacerse luego si elegir esta opción. Toda la información sobre este método de limpieza está disponible en los Métodos complementarios.
- Diluir la muestra para análisis de MS u opcionalmente proceder al fraccionamiento de HPLC (dos pasos).
- Para fraccionar, diluir muestras hasta un volumen de 400 μL con tampón de formiato de amonio 10 mM (pH 10.0).
- Resolver en una columna C18 (véase Tabla de materiales) separando a 0,5 mL/min utilizando un sistema HPLC con formiato de amonio fases móviles (A) 10 mM, pH 10.0 y (B) 10 formiato de amonio mM, pH 10.0/acetonitrilo (10:90).
- Ajustar el degradado de en 100% A 95% A durante los primeros 10 minutos, 95% un 65% A largo min 10 a 70, un 65% a un 30% sobre el minuto 70 a 85, mantener en 30% A sobre el minuto 85 al 95.
- Volver a equilibrar con 100% un sobre min 95 a 105 y sostenga al 100% A hasta el minuto 120.
- Recoger fracciones cada minuto 1,25 (96 fracciones sobre el gradiente de todo) y finalmente combinar cada fila para un total de 12 muestras o cada otra fila para 24 muestras (cada una con n = 8 o n = 4 fracciones agrupadas).
- Seco todas las fracciones en vacío y añadir 15 μl de agua ultrapura a cada uno para el almacenamiento a-20 ° C hasta el análisis por LC-MS/MS.
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Representative Results
Cuando se utiliza el protocolo MPLEx para extraer moléculas de suelo de pradera nativa de Kansas (un suelo Mollisol), los análisis por triplicado previeron resultados 3376 péptidos, 105 lípidos y 102 metabolitos polares (todas las identificaciones únicas). Mientras que el protocolo MPLEx ha sido bien establecido para la extracción general de lípidos y metabolitos12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, su comparación con métodos de extracción de proteína de suelo común para análisis microbianos, tales como kits de extracción de proteína de suelo (ver tabla de de Materiales) y SDS (dodecil sulfato de sodio) extracciones35, es más aquí. Para evaluar estas técnicas, proteínas de suelo de pradera nativa de Kansas se extrae con cada enfoque y se analizaron directamente con fase inversa LC-MS/MS usando un sistema UPLC acoplado con un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo/Orbitrap. Toda la información sobre los parámetros del método están disponibles en los Métodos complementarios. El resultante péptido experimental espectros MS/MS de cada enfoque de extracción fueron comparados con los predichos péptido secuencias del representante Kansas pradera nativa metagenoma2 utilizando un MS estricto-GF + atajo espectral probabilidad de 1 x 10 -10 36 , 37 y un atajo de error total de menos de 5 ppm. Cabe señalar que los analitos extraídos de suelo utilizando el protocolo MPLEx son adecuados para estudios de MS y otras técnicas analíticas. Cuando inicialmente comparando tres réplicas de los métodos conocidos de MoBio y SDS, sólo el 12% de los péptidos solapadas entre las dos técnicas que muestran la complejidad de la comunidad microbiana y los efectos de extracción diferentes (figura 2). A comparación de MPLEx con extractos MoBio y SDS, ~ 38% de los péptidos observados usando el método MPLEx también fueron detectado cuando se usa el SDS o MoBio extracciones (figura 2). Teniendo en cuenta el número de especies en el Kansas suelo comunidad bacteriana y su metagenoma2, la superposición de identificaciones en el péptido es razonable y debido a su complejidad, la combinación de los enfoques extractos péptidos más que cada uno solo 35. también, puesto que estas muestras eran unfractionated y analizadas por sólo 1-dimensional LC-MS/MS, la complejidad de la muestra muy alta posiblemente causaba algún sesgo de detección debido a la concentración de péptido diferente por cada enfoque. El protocolo MPLEx se ha aplicado también a otros tipos de suelo como permafrost y humedales, y en todos los casos los resultados preliminares de la proteómica son de calidad similar a la de los datos de suelo de pradera nativa de Kansas presentados aquí.
La amplia aplicabilidad del enfoque MPLEx, ha sido previamente evaluado un conjunto diverso de muestras, incluyendo el archaeon Sulfolobus acidocaldarius, un unicyanobacterial consorcio38, tejido de corteza de cerebro de ratón, orina humana, y hojas de Arabidopsis thaliana (figura 2)10. Para todas las muestras excepto A.thaliana, extracciones de urea son la forma más común para extraer proteínas, por lo que fueron utilizados como el enfoque de control para la evaluación. Los resultados de a. thaliana MPLEx se compararon con una extracción que se realiza con ácido tricloroacético (TCA) porque las hojas de las plantas son ricos en compuestos fenólicos que deben ser removidos antes de MS análisis39. En todos los casos, el número de proteínas observada desde el método MPLEx fue similar a la de los controles10, indicando su utilidad para muchos tipos diferentes de la muestra. También, no había tendencias asociadas con las clases de proteínas específicas extraídas en todos los tipos de muestra (incluyendo suelo). Por lo tanto, la amplia aplicabilidad de MPLEx para numerosos sistemas biológicos y ambientales, es un enfoque prometedor.
Figura 1. Un esquema mostrando el proceso MPLEx, en que metabolitos, proteínas y lípidos al mismo tiempo se extraen de la misma muestra de suelo para análisis de MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Diagramas de Venn que ilustra la superposición del péptido para un diverso conjunto de muestras extraído usando MPLEx y un método de extracción de proteína estándar de urea normalmente realizaron. Datos de MPLEx extracción del archaeon S.acidocaldariusel consorcio unicyanobacterial, orina humana, corteza de cerebro de ratón y planta de A.thaliana sale adaptados de Nakayasu, E. S. et al. 201610. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es importante tener en cuenta que no todos los laboratorios tendrán el mismo equipo disponible para que ciertos métodos, por ejemplo el paso de lisis, pueden ser adaptados. Aquí utilizamos un vórtex y sonicando, sin embargo el uso de una batidora de grano grande 50 mL funcionaría. Si no encuentra un liofilizador con una temperatura del colector de-105 ° C, las muestras pueden ser secadas bajo una corriente de nitrógeno. También tipos de suelo varían mucho y pueden incluir arena, limo, arcilla, turba y Marga (etc.), y también pueden variar en base a la riqueza de materia orgánica, pH y salinidad. Cada una de estas variaciones puede tener un impacto en el protocolo, por lo que es importante ser flexible y hacer ajustes cuando sea necesario. Sin embargo, es fundamental que los cocientes y porcentajes siguen siendo los mismos.
El protocolo MPLEx muestra gran promesa para aplicación en numerosos sistemas biológicos y ambientales y la capacidad para habilitar multi-omic análisis de comunidades microbianas del suelo. Las comparaciones anteriores de MPLEx a otros protocolos de extracción de diversos sistemas ilustran un alto grado de superposición de péptido10. Sin embargo, se observó limitación fue que no era aplicable a las proteínas del plasma de la sangre que deba ser agotado MPLEx. En estos casos, las proteínas precipitadas no fueron bien reconocidas por los anticuerpos en el immunodepletion columnas necesarias para la amplia cobertura del proteoma del plasma. Por lo tanto, se utilizará métodos de extracción más estándar en estas circunstancias. Una limitación adicional por el método de extracción MPLex es que no discernir entre proteínas intracelulares y extracelulares, sin embargo esto es cierto para todos los demás suelo proteína extracción protocolos así.
En este manuscrito, MPLEx previstas resultados 3376 péptidos, 105 lípidos y 102 metabolitos polares en el suelo de la pradera nativa de Kansas utilizando los métodos de extracción y análisis detallados en la sección de protocolo. Se observó mejor traslapo entre los péptidos extraídos en el control y MPLEx enfoques de sistemas individuales en comparación con la comunidad microbiana del suelo (figura 2). Esto no es una limitación, sino una consecuencia de trabajar con las comunidades microbianas de suelo extremadamente complicada. Estos resultados se observan como las técnicas de extracción de suelo bien conocido de SDS y MoBio no superpongan bien ya sea debido a la gran diversidad y dificultades de extracción de proteínas del suelo igualmente. Curiosamente, el protocolo MPLEx permitió la identificación de péptidos más total que el SDS o MoBio y también detecta componentes adicionales no vistos en cualquier análisis.
Estas observaciones hacen MPLEx una técnica muy prometedora para trabajar con tamaños de muestras pequeñas, reducir global multi-omic variabilidad experimental y reducir tiempo de preparación de la muestra. Las ventajas posibles con MPLEx buscan para activar las capacidades de multi-omic y análisis necesarios para estudios de comunidad microbiana a gran escala.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Nathan Johnson por su asistencia en la preparación de las figuras. Esta investigación fue apoyada por el programa de Panamericanos-ómicas que es financiado por el Departamento de energía de Estados Unidos Oficina de biológicos y la investigación ambiental (programa de Ciencias Genómicas), el Microbiomes en transición (menta) laboratorio dirigido investigación desarrollo Iniciativa en el Pacific Northwest National Laboratory, así como el nacional institutos de salud nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (R01 ES022190) y NIH (P42 ES027704). KEBJ quiere agradecer R21 HD084788 apoyo financiero desarrollar y validar técnicas de extracción de novela multi-omic. Este trabajo fue realizado en el W. R. Wiley ambiental Molecular Ciencias de laboratorio (Page), una instalación de usuario científico nacional de DOE en el laboratorio nacional del Noroeste Pacífico (PNNL). PNNL es un laboratorio nacional de multi-programa operado por Battelle para la coneja bajo contrato DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
