Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering af cerebrale kapillærer fra frisk menneskelige hjernevæv

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2, 1, 3, 2
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

Summary

Isolerede hjernen kapillærerne fra menneskelige hjernevæv kan bruges som en prækliniske model til at studere barriere funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Vi præsenterer her, en optimeret protokol for at isolere hjernen kapillærerne fra frisk menneskelige hjernevæv.

Abstract

Forståelse blod - hjerne barrieren funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold er afgørende for udviklingen af nye terapeutiske strategier, at holde løftet om at forbedre hjerne medicinafgivelse, forbedre hjerne beskyttelse og behandle hjernen lidelser. Men at studere funktionen menneskelige blod - hjerne barrieren er udfordrende. Der er således et kritisk behov for passende modeller. Hjernen kapillærerne isoleret fra menneskelige hjernevæv repræsenterer i denne sammenhæng et unikt værktøj til at studere barriere funktion som tæt på menneskelig i vivo situation som muligt. Her, beskriver vi en optimeret protokol for at isolere kapillærer fra menneskelige hjernevæv på et højt udbytte og med ensartet kvalitet og renhed. Kapillærer er isoleret fra frisk menneskelige hjernevæv ved hjælp af mekaniske homogenisering, massefylde-gradient centrifugering og filtrering. Efter isolationen, kan de menneskelige hjerne kapillærer bruges til forskellige anvendelser, herunder lækage assays, levende celle imaging og immun-baserede assays til at studere protein udtryk og funktion, enzymaktivitet eller intracellulær signalering. Isolerede menneskelige hjerne kapillærer er en unik model at belyse regulering af funktionen menneskelige blod - hjerne barrieren. Denne model kan give indsigt i centralnervesystemet (CNS) patogenese, som vil bidrage til udviklingen af terapeutiske strategier for behandling af CNS lidelser.

Introduction

Blod - hjerne barrieren er en stramt kontrolleret grænseflade mellem blod og hjerne, der bestemmer, hvad går ind og kommer ud af hjernen. Anatomisk, endotelceller komponere blod - hjerne barrieren og danner en kompleks, fortløbende kapillær netværk. Fysiologisk, leverer denne kapillære netværk hjernen med ilt og næringsstoffer, mens samtidig bortskaffelse af kuldioxid og metaboliske affald produkter. Vigtigere, understøtter beviser, at ændringerne af barrieren bidrage til mange sygdomme, herunder Alzheimers sygdom, epilepsi og slagtilfælde1,2,3,4,5 , 6 , 7. brain endotelceller også tjene som en barriere for behandling af blokerende stof udbredelse ind i hjernen, fx., kemoterapi af glioblastom multiforme efter tumor resektion8,9, 10. isolerede menneskelige hjerne kapillærer repræsenterer i denne sammenhæng en unik ex vivo blod - hjerne barrieren model, der ligner barriere egenskaber in vivo, som giver mulighed for undersøgelse af barriere funktion og dysfunktion i sundhed og sygdom. I denne artikel leverer vi en protokol for at isolere hjernen kapillærerne fra menneskelige hjerne på en konsekvent høj kapillær kvalitet og udbytte for at studere blod - hjerne barrieren.

I 1969, Siakotos mfl. 11 var de første til at rapportere isolering af hjernen kapillærerne fra kvæg og menneskelige hjernevæv ved hjælp af tæthed gradient centrifugering og glas perle kolonne adskillelse. Senere, Goldstein et al. 12 forbedret denne metode ved at tilføje flere filtrering trin for at reducere mængden af væv for at studere hjernen kapillærerne isoleret fra rotter, samtidig med at den metaboliske aktivitet af glukose transport. Siden da har optimeret forskere kapillær isolation procedure adskillige gange, og slog forbedre den metode og hjernen kapillær model med hver iteration13,14,15. For eksempel, Pardridge mfl. 16 isoleret bovin kapillærer ved hjælp af enzymatiske fordøjelsen snarere end mekanisk homogenisering, og derefter bestået efterfølgende en kapillær suspension gennem en 210 µm mesh-filter og et glas perle kolonne. Disse ændringer forbedret trypan blå udstødelse pletten af isolerede hjernen kapillærerne, og dermed øget endotel cellernes levedygtighed. I begyndelsen af 1990 ' erne, Dallaire mfl. 17 isoleret kvæg og rotte kapillærer, der var klart af neuronal forurening og vedligeholdt metaboliske aktivitet af γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase), og basisk fosfatase. I 2000, Miller mfl. 18, anvendes isoleret rotte og svin hjernen kapillærerne i kombination med Konfokal mikroskopi viser ophobning af transport substrater til lumen af kapillærer. Efterfølgende vores laboratorium har fortsat med at optimere hjernen kapillær isolation procedure og vi har etableret transport assays for at bestemme P-glykoprotein (P-gp)19,20,21, brystkræft modstand protein (BCRP)22,23, og multi lægemiddelresistens protein 2 (Mrp2)24 transportaktiviteter. I 2004 offentliggjorde vi to rapporter hvor vi brugt isolerede rotte hjernen kapillærerne til at undersøge forskellige signaling veje. I Hartz mfl. 21, vi fandt, at peptid endothelin-1 hurtigt og reversibelt reduceret P-gp transport funktion i hjernen kapillærerne ved at handle gennem endothelin receptor B (ETB) receptor, nitrogenoxid syntase (NOS) og protein kinase C (PKC). I Bauer et al. 19, vi viste udtryk for nukleare receptor pregnane X receptor (PXR) og viste PXR-graduering af P-gp udtryk og transport funktion i hjernen kapillærerne. I eksperimenter med transgene humaniseret PXR mus, vi udvidet denne linje af forskning og viste i vivo stramning af barrieren ved upregulating P-gp gennem hPXR aktivering25. I 2010, Hartz mfl. 26 bruges denne fremgangsmåde til at gendanne P-gp protein udtryk og transportere aktivitet i transgene menneskelige amyloid forløber protein (hAPP) mus, der overexpress hAPP. Desuden reduceret genoprette P-gp i hAPP mus betydeligt amyloid beta (Aβ)40og Aβ42hjerne niveauer.

Ud over at studere signaling veje, kan isolerede hjernen kapillærerne bruges til at bestemme forandringer i kapillær permeabilitet, som vi refererer til som kapillær lækage. Især bruges Texas rød lækage analysen til at vurdere lækage af fluorescerende farvestof Texas rød fra kapillær lumen over tid, og disse data bruges derefter til at analysere lækage priser. Øget kapillær lækage priser sammenlignet med dem fra kontrol kapillærer angiver ændringer i blod - hjerne barrieren2fysiske integritet. Dette er værdifuldt, fordi der er mange sygdomstilstande tilknyttet barriere forstyrrelser, fx., epilepsi, sklerose, Alzheimers sygdom og traumatisk hjerne skade27,28,29, 30. Andre grupper har også udnyttet isolerede kapillærer for at skelne signaling veje, der regulerer protein udtryk og transport aktivitet af proteiner31,32,33,34, 35,36,37. Endelig har vi fortsat at optimere denne metode til dyrkning af menneskelige hjerne kapillærer, og for nylig, viste vi øget P-gp udtryk på den menneskelige blod - hjerne barrieren hos patienter med epilepsi i forhold til beslaglæggelse-gratis kontrol personer38 . Taget sammen, viser disse udvikling, at isolerede hjernen kapillærerne kan tjene som en alsidig model at studere barriere funktion.

Forskellige in vivo, ex vivo, og in vitro- blod - hjerne barrieren modeller har været brugt i grundforskning og industrielt stof screening, hovedsageligt med mål at teste medicinafgivelse til hjernen39,40,41 ,42,43,44. Ud over isolerede ex vivo hjernen kapillærerne omfatter nuværende blod - hjerne barrieren modeller i siliciummangan modeller, in vitro- cellekultur af isolerede hjernen kapillære endotelceller eller udødeliggjort cellelinjer fra forskellige arter, i vitro kultur af humane pluripotente stamceller (hPSC) at differentiere i hjernen kapillære endotelceller, og mikrofluid modeller på en chip.

I siliciummangan modeller er mest almindeligt anvendt i udvikling af lægemidler til valg af drug kandidater baseret på forventede absorption, distribution, metabolisme og udskillelse (ADME) egenskaber. Metoder såsom kvantitative struktur-ejendom forholdet (QSPR) modeller og kvantitative struktur-aktivitet relationer (QSAR) modeller er populære metoder, der anvendes i high throughput screening af biblioteker til at forudsige hjernen penetration af lægemiddelkandidater 45 , 46. disse modeller er nyttige til raster molekylerne for barriere penetration egenskaber.

Betz et al. 47 etableret encellelag af kulturperler hjernen kapillære endotelceller som en in vitro- blod - hjerne barrieren modelsystem. In vitro celle kultur modeller bruger frisk væv eller udødeliggjort endotel cellelinjer såsom menneskelige cerebral microvessel endothelial celler (hCMECs) kan være en anden høj overførselshastighed screeningsværktøj til hjernen penetration eller Mekanistiske undersøgelser. Men hjernen kapillære endotelceller celle kultur modeller mangler den fysiologisk shear stress af blodgennemstrømningen inde kapillær lumen, er begrænset i samlede biologiske kompleksitet og undergå ændringer i udtryk og lokalisering af vigtig barriere komponenter såsom tight junction proteiner kanaler overflade receptorer, transportvirksomheder, enzymer og ion48,49,50. Omvendt, endotel encellelag stammer fra hPSCs, har lav saccharose permeabilitet i forhold til hCMEC/D3 kulturer og indeholder polariseret udtryk for nogle blod - hjerne barrieren transportvirksomheder, adhæsionsmolekyler, og stramme kryds51, 52. imidlertid disse celler er også omfattet af skiftende egenskaber i kulturen, og systemet skal være valideret til sin sammenfatning i vivo barriere egenskaber52.

Nyere tendenser i blod - hjerne barrieren forskning omfatter udnytter 3D vævskultur systemer for at skabe kunstige kapillærer, ved hjælp af orgel-on-chip-teknologi til at generere mikrofluid enheder, eller udnytte hule fibre teknologi53, 54 , 55. kunstige kapillærer, men har betydeligt større diameter (100 – 200 µm) end hjernen kapillærerne (3-7 µm). Dermed ligner shear styrker in vitro- ikke helt i vivo situation. Dette er taget op i "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrofluid enheder, hvor kunstige membraner form "blod" og "hjerne" rum og væsker er pumpet gennem disse enheder genererer mikrofluid shear styrker. Ligeledes er co kulturer i endothelial celler i forskellige kombinationer med astrocytter og vaskulære glatte muskelceller også blevet brugt med hule fibre teknologi til at genskabe rheologiske parametre findes under i vivo betingelser56 , 57 , 58. det er dog uklart, hvor godt denne model afspejler andre egenskaber af blod - hjerne barrieren som transport, metabolisme, signalering, m.fl. Disse kunstige kapillær og chip modeller er velegnede til høj overførselshastighed screening af narkotika, men de celler, der bruges til at generere disse modeller kan også ændres under kultur.

Frosne og faste hjernen skiver eller primære hjerne kapillære endotelceller cellekulturer er yderligere modeller, der kan bruges til atstudere den menneskelige microvasculature5,59,60,61. For eksempel, immunhistokemi fast hjernen væv bruges til at bestemme protein lokalisering og udtryk i sund sammenlignet med sygt væv.

Ud over væv skiver og in vitro- modeller kan beskrevet ovenfor, frisk isolerede hjernen kapillærerne udnyttes til at studere blod - hjerne barrieren funktion. Begrænsninger af denne isolerede kapillær model omfatter er vanskeligheden at få friske menneskelige hjernevæv, manglende astrocytter og neuroner, og en forholdsvis tidskrævende isoleret proces. En fordel ved den isolerede hjerne kapillær model er at denne model ligner i vivo situation, og derfor kan bruges til at karakterisere barriere funktion og dysfunktion. Vigtigere er, kan det også bruges til at skelne signaling mekanismer ved hjælp af et væld af assays og molekylære teknikker3,19,62,63.

Vores laboratorium har adgang til både ferske og frosne menneskelige hjernevæv gennem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. I denne forbindelse Obduktioner følger en standard-protokol, hjerner er fremstillet i < 4 h, og alle procedurer i overensstemmelse med NIH Biospecimen bedste praksis retningslinjer65. Givet denne enestående adgang til menneskelige hjernevæv, vi etableret og optimeret en protokol for at isolere hjernen kapillærerne fra menneskelige hjernevæv, der resulterer i et højt udbytte af intakt og bæredygtige menneskelige hjerne kapillærer. To fælles slutpunkter af interesse er at bestemme protein udtryk og aktivitet. Vi og andre har i denne forbindelse etableret forskellige assays, der kan bruges med isolerede hjernen kapillærerne for at studere protein udtryk og aktivitetsniveau. Disse assays omfatter Western blotting, enkle Western assay, enzymmaerket assay (ELISA), reverse transkription polymerase kædereaktion (RT-PCR), kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR), zymography, transport aktivitet assays, og kapillær lækage assays. Disse assays giver forskere til at studere ændringer i barriere funktion i menneskelige patologiske betingelser, bestemme veje, der styrer protein udtryk og aktivitet og identificere farmakologiske mål for behandling af blod - hjerne barrieren forbundet sygdomme.

Taget sammen, frisk isolerede hjernen kapillærerne kan tjene som en robust og reproducerbare model af blod - hjerne barrieren. Især, kan denne model kombineres med mange forskellige assays til at bestemme en bred vifte af slutpunkter til at studere barriere funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nedenstående oplysninger er baseret på aktuelle sikkerhed og lovgivningsmæssige standarder på University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Vedrøre institutionens biologiske sikkerhed program og mest aktuelle regler og anbefalinger som en sikkerhedsforanstaltning, før du arbejder med humant væv.

Forsigtig: Humant væv kan være en kilde af blodbårne patogener, herunder human immundefekt virus (HIV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV) m.fl. Arbejde med menneskeligt væv udgør risikoen for infektion fra blodbårne patogener. Derfor er visse lovgivningsmæssige og sikkerhed overvejelser bydende nødvendigt, når du arbejder med humant væv til at beskytte laboratoriepersonalet. Arbejde med menneskeligt væv i USA kræver en biosikkerhed niveau 2 laboratorium samt sikkerhedsforanstaltninger og uddannelse i henhold til NIH afsnit IV-B-7, OSHA Act 1970 klausul 5(a)(1) og brugerens institutionelle biologiske sikkerhed program. I almindelighed, skal institutionelle biosikkerhed udvalget og/eller institutionelle Review Board godkendelse indhentes forud for enhver forsker, der involverer menneskelige materialer (væv, kropsvæsker). Uddannelse er nødvendig for alle personale, der arbejder med menneskelige materialer og omfatter grundlæggende laboratorium sikkerhedsuddannelse, fx, kemiske hygiejne og laboratorium sikkerhed, samt særlig uddannelse for biologisk sikkerhed, farligt affald og menneskelige blodbårne patogener. Alle personale, der arbejder med menneskelige materialer er stærkt anbefales at få Hepatitis B vaccination, før arbejde med menneskelige materialer. Personale er forpligtet til at bære særlige personlige værnemidler under arbejdet med menneskers materialer, fx., en cuffed lab coat og en ansigt skjold, og bære handsker på alle tidspunkter. Alt arbejde udføres i en biosikkerhed kabinet (klasse 2). Alt udstyr, der kommer i kontakt med menneskelige materialer og alle affald fra menneskers materialer håndteres korrekt for at forhindre kontaminering og/eller infektion af personale. Alt udstyr og alle overflader rengøres med 10% blegemiddel og 75% ethanol efter hver procedure, der involverer menneskelige materialer. Et udslip med menneskelige materialer skal straks ryddet op. Glasvarer er autoklaveres efter hver brug. Affald, herunder ikke optagne humant væv, er indsamlet i en mærket smittefarligt affald taske og autoklaveres. Skarpe genstande er indsamlet i en punktering - og lækagesikre container mærket som biologisk. Alt affald fra menneskers materialer er afhændet ifølge institutionens biologiske sikkerhedsbestemmelser.

Bemærk: Vores laboratorium opnår frisk frontale cortex prøver fra afdøde personer gennem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M). Inklusionskriterierne er: tilmelding i UK-ADC langsgående obduktion kohorteundersøgelse og en Post Mortem-Interval (PMI) ≤4 h64. Obduktioner følger en standard protokol og alle procedurer i overensstemmelse med NIH Biospecimen bedste praksis retningslinjer65. En kort PMI på mindre end 4 h er af største betydning at sikre kapillær levedygtighed efter isolation. Både ferske og frosne væv kan bruges. Hvis frysning er nødvendige, frisk fremstillede menneskelige hjernevæv bør være stød-frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C. Friske eller optøede væv bør opbevares i isolation buffer (se nedenfor) og behandles hurtigt. Vi finder at 10 g frisk humant væv udbytter ca. 100 mg hjernen kapillærerne (våd vægt).

1. opsætning

  1. Buffer forberedelse
    Bemærk: Mængden af buffer behov afhænger af mængden af væv. Alle buffer diskenheder i følgende protokol er baseret på 10 g af menneskelige hjernevæv cortex.
    1. L Isolation Buffer: Bruge 1,5 L af Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) og supplere med 5 mM D-glucose (1,35 g ) og 1 mM natrium pyruvat (0.165 g). Efter tilsætning af glucose og pyruvat, justeres til pH 7,4 med natriumhydroxid. Cool og gemme buffer til 4 ° C før brug.
    2. Bovint serumalbumin (BSA): Tilføje 10 g af BSA pulver til 1 L isolation buffer til en endelig BSA koncentration på 1%. Rør langsomt for at undgå boblerne, justeres til pH 7,4 og opbevares ved 4 ° C natten over. Umiddelbart før brug, blidt røre; undgå at danne bobler for at undgå albumin denaturering.
    3. tæthed gradient medium: vejer 18 g af tæthed gradient medium i en glasflaske og tilføje en magnetisk røre bar. Tilføje 60 mL af isolation buffer og ryst kraftigt i 5 min, indtil alle pulver er suspenderet. Butik natten over ved 4 ° C at tillade tæthed gradient medium til at opløse. Omrøres i 10 min lige før brug.
    4. Gemme alle buffere ved 4 ° C; holde alle værktøjer og buffere på isen under proceduren hele isolation. Rør alle buffere inden brug.
  2. Eksperimentel opsætning
    1. Montere pistil af Potter-Elvehjem væv vinkelsliberen på den elektroniske overhead omrører. Sted Potter-Elvehjem væv mølle og Dounce homogeniseringsapparat med pistil på isen under kølerhjelmen. Forberede en 300 µm filter mesh (5 x 5 cm2), fold det til en kegle, og Indsæt og Vedhæft den til en 50 mL Falcon tube med tape (figur 1A).
    2. Placer forbinder ringe og celle stamme filtre (pore størrelse: 30 µm) på 50 mL Falcon rør. Forberede biologisk affaldsposer. Placere alle nødvendige udstyr i biosikkerhed kabinet (Se Tabel af materialer).

2. brain prøveforberedelse

Bemærk: Figur 1A viser arbejdsprocesser diagrammet af hele isolation proceduren beskrevet nedenfor. Menneskelige hjernevæv kan stamme fra nogen del af cortex og kan bruges frisk eller frossen. Frosne hjernevæv kan optøes ved stuetemperatur (ingen buffer; ~ 30 min til 10 g). For at opnå sammenlignelige resultater, bør hjernevæv indhentes fra det samme område af hjernen for hvert forsøg. Denne protokol er optimeret til frisk (PMI < 4 h) menneskelige hjernebarken, der ikke har været frosset.

  1. Forberedelse af menneskelige hjernevæv: dokumentere vægten af hjernevæv. Alle numre i følgende protokol er egnede til 10 g af frisk menneskelige hjernevæv. Placer hjernevæv i en 100 mm petriskål. Fjern forsigtigt alle meninges med pincet. Brug en skalpel til at afskære den hvide substans.
  2. Hakning af den menneskelige hjernevæv: omhyggeligt skåret op hjernevæv og mos det med en skalpel. Hakkekød i ca 5 min (2 – 3 mm stykker). Overføre hjernevæv til Potter-Elvehjem væv grinder. Der tilsættes 30 mL af isolation buffer.
    Bemærk: Hakket væv stykker er svært at se da hjernevæv bliver til grød gennem mincing processen.

3. homogenisering

  1. Potter-Elvehjem væv grinder (clearance: 150-230 µm): homogeniseres hver prøve med 100 slag med en homogeniseringsapparat hastighed på 50 rpm. Dokumentere tid hver 25 slag og den samlede tid til 100 slag. Se tabel 1 for en foreslåede homogenisering protokol; den samlede tid til homogenisering 10 g af menneskelige frontale cortex er omkring 22 min. Rør ikke i luften for at undgå boblerne.
  2. Dounce homogeniseringsapparat (clearance: 80 – 130 µm): overførsel af homogenatet til en Dounce homogeniseringsapparat på is. Homogeniseres suspension med 20 slag (~ 6 s/slagtilfælde, samlede af ~ 2 min). Undgå boblerne.

4. centrifugering

  1. Distribuere hjernen homogenatet lige ind i fire 50 mL centrifugering rør og dokument det samlede volumen af homogenatet. Distribuere 50 mL af tæthed gradient buffer til centrifugering rør (12,5 mL pr tube). Brug 10 mL af isolation buffer til at skylle pistil og homogeniseringsapparat, og distribuere til de fire centrifugering rør (~2.5 mL pr tube).
  2. Stramt lukke centrifugeglas med hætter. Bland homogenatet, density gradient medium og buffer ved kraftigt at ryste rør. Der centrifugeres ved 5.800 x g i 15 min. ved 4 ° C (fast vinkel rotor); Vælg en mellemlang deceleration hastighed at holde pellet knyttet til røret. Supernatanten og resuspend hver pellet i 2 mL 1% BSA.

5. filtrering

Bemærk: For at adskille kapillærerne fra røde blodlegemer og andre celle debris, flere filtrering trin er nødvendige.

  1. 300 µm mesh: efter re suspendere pellet, filtrere suspension gennem 300 µm mesh. Kapillærer er filtreret gennem trådnet, hvorimod større fartøjer og større hjerne snavs forbliver på trådnet. Forsigtigt vaske trådnet med op til 50 mL af 1% BSA. Kassér trådnet.
    Bemærk: Denne filtrering trin rydder kapillær suspension fra enhver større fartøjer eller bidder af hjernen debris.
  2. 30 µM celle stamme filter
    Bemærk: Denne filtrering trin adskiller kapillærer fra røde blodlegemer og andre hjerne debris.
    1. Distribuere kapillær filtratet fra trin 6.1 over fem 30 µm celle stamme filtre (ca. 10 mL af kapillar filtratet pr. celle stamme filter). Kapillærer er holdt tilbage af dette filter, røde blodlegemer, andre enkelt celler og lille hjerne snavs passerer gennem filteret og er indsamlet på grundlag af filtrat.
    2. Vask hver filter med 25 mL af 1% BSA. Bagefter, hæld alle Filtraterne over den sjette filter til at øge udbyttet. Vask hver filter med 50 mL af 1% BSA; holde cellen stamme filtre med som indeholder kapillærer og kassér filtratet.

6. kapillær samling

  1. Vend filtrene hovedet og vaske kapillærer med 50 mL af 1% BSA til hvert filter i 50 mL rør. Forsigtigt lægge pres med pipette spidsen af en 5 mL pipette og krydse filter til at vaske af hjernen kapillærerne.
  2. Sørg for at vaske alle hjernen kapillærerne, især fra randen af filteret. Undgå boblerne, da dette vanskeliggør filtrering proces og øger chancen for kapillær tab.

7. vask

  1. Efter indsamling kapillærerne, der centrifugeres alle prøver på 1.500 x g i 3 min. ved 4 ° C (svinge spanden rotor). Fjern supernatanten og genopslæmmes pellet i ca. 3 mL isolation buffer. Kombinere alle resuspenderede pellets fra én prøve i en 15 mL konisk slange og fyld den med isolation buffer. Centrifugeres igen ved 1.500 x g i 3 min. ved 4 ° C og vaskes to gange mere.
  2. Dokumentere den kapillære renhed med et mikroskop (100 X forstørrelse) og kamera (figur 1B).
    Bemærk: Hjernen kapillær udbytte fra 10 g af menneskelige hjernevæv er normalt omkring 100 mg. Isolerede hjernen kapillærerne kan nu bruges til eksperimenter, behandles (fx., lysate, membran isolation), eller være flash-frosset og opbevares ved-80 ° C i cryotubes for et minimum af 6-12 måneder (undgå flere fryse-tø cykler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering fra menneskelige hjernevæv udbytte en suspension, beriget med menneskelige hjerne kapillærer (figur 1B) med små mængder af større fartøjer, røde blodlegemer, andre enkelt celler og nogle celle debris. Nogle kapillærer er forgrenet, og i nogle, rød blod celler er fanget i de kapillær lumen. Den typiske kapillær har en 3-7 µm diameter og er ca 100-200 µm lange med åben lumen; de fleste kapillær ender er skjult. Bruger Konfokal mikroskopi, afsløre isolerede menneskelige hjerne kapillærer en rørformet, intakt struktur og morfologi. Figur 2A viser en repræsentant transmitteres lys billede af en menneskelig hjerne kapillær med en vedhæftet pericyte og en rød blod celle i lumen. Alle undersøgelsesresultater vedrørende diameter, størrelse og morfologi, der er i overensstemmelse med tidligere betænkninger om strukturen af isolerede hjernen kapillærerne12,17,18. Den isolerede menneskelige hjerne kapillær i figur 2B var immunostained for P-gp (grøn) bruger C219 som det primære antistof (1 µg/mL); kerner blev counterstained med DAPI (1 µg/mL).

Figure 1
Figur 1: Flowchart for kapillær isolation. (A) piktogram illustrerer vigtige trin i proceduren at isolere hjernen kapillærerne fra frisk humant væv. (B) billedet viser isolerede menneskelige hjerne kapillærer under et lysmikroskop direkte efter isolation (100 X forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: isolerede menneskelige hjerne kapillær. (A) A transmitteres lys billede af en isolerede menneskelige hjerne kapillær. (B) den Konfokal mikroskop billede viser en isolerede menneskelige hjerne kapillær immunostained for P-gp (grøn; C219 1 µg/mL); kerner blev counterstained med DAPI (blå, 1 µg/mL). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fejlfinding tæthed centrifugering. Piktogram viser præparationen efter tæthed gradient centrifugering. Det fremhæver virkningerne af for meget og for lidt tæthed gradient medium og hvordan dette påvirker adskillelse og den resulterende kapillær pellet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: P-gp protein udtryk i isolerede menneskelige hjerne kapillærer. Den vestlige skamplet viser stærk bands for P-gp (1 µg/mL) i isolerede menneskelige kapillærerne i forhold til hCMEC\D3 celler. Β-Actin blev brugt som en loading kontrol (1 µg/µL). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: ansøgninger om isolerede menneskelige hjerne kapillærer. En oversigt over de mest almindelige programmer for isolerede hjernen kapillærerne offentliggjort i litteraturen. Isolerede kapillærer er blevet brugt til: 1) genomforskning85,86, 2) Proteomics3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) funktionel Proteomics2,38, og 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Slagtilfælde Tid [min]
1 – 25 7-7,5
26-50 5-5,5
51-75 5-5,5
76-100 5-5,5
Total tid: 22 – 24 min

Tabel 1: homogenisering protokol. Homogenisering protokollen for Potter-Elvehjem væv grinder til at homogenisere 10 g af menneskelige frontale cortex med en homogenisering hastighed på 50 rpm. Bemærk at den første flere strøg kræve ekstra tid til at homogenisere de hakket væv. Efter denne indledende homogenisering, hver slagtilfælde er 12 s i varighed (6 s for nedadgående bevægelse, 6 s for opadgående bevægelse). Således, efter den indledende homogenisering, 5 streger kan opnås i 1 min eller 25 slag i 5 min.

Problem Mulig årsag Løsning
Ingen kapillær Pellet 1) ukorrekt Ficoll koncentration 1) justere Ficoll koncentration
2) forkert centrifugering hastighed 2) justere centrifugering hastighed
3) forkert acceleration og/eller deceleration hastighed 3) justere hastighed, acceleration og/eller deceleration
Lav kapillær udbytte 1) meninges blokering filtrering trin 1) fjerne alle meninges inden filtrering
2) for mange kapillærer tabt under isolation procedure 2) beregner buffer koncentration korrekt, skyl pipette tips
3) vask kapillærer off PluriStrainer filtre var utilstrækkelig 3) Vend filtre og omhyggeligt Inspicér for kapillærer (brug mikroskop)
4) overskydende bobler under resuspensions 4) afpipetteres langsomt at undgå boblerne
Ikke-levedygtige kapillærer 1) udvidet post mortem interval 1) reducere intervallet hvis det er muligt eller bruge snap-frosne hjerner
2) brug af frossen væv til isolering 2) bruge frisk væv
3) tidspunktet for isolation procedure for lang 3) optimere arbejdsproces
4) udstyr/buffere blev ikke holdt på isen under proceduren isolation 4) holde udstyr og buffere på isen under isolation

Tabel 2: fejlfinding af almindelige problemer. En liste over de mest almindelige fejl og problemer, der opstår under proceduren isolation og hvordan de kan løses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver isolering af intakt og levedygtige menneskelige hjerne kapillærer fra frisk væv. I dette afsnit skal vi drøfte i detaljer følgende: 1) ændringer til protokollen, 2) fejlfinding af almindelige fejl, 3) begrænsninger af teknikken, 4) betydningen af den model med hensyn til eksisterende og alternative blod - hjerne barrieren modeller, og 5). potentielle ansøgninger om isolerede menneskelige hjerne kapillærer.

Protokollen beskrevet her er optimeret til 10 g frisk menneskelige frontale cortex væv. Men det er relativt enkelt at ændre denne procedure for: 1) mere eller mindre end 10 g væv, 2) frosne hjernevæv, eller 3) hjernevæv fra et område af hjernen end den frontale cortex. Først, med mere eller mindre end 10 g af hjernevæv, det nødvendige antal buffere kan blot skaleres op eller ned til den tilgængelige mængde væv. Således, hvis kun 5 g af hjernevæv er tilgængelig, omfanget af bufferne skal halveres. Andet, vi beskriver en kapillær isolation, der anvendes friske hjernevæv, men frossen væv kan bruges hvis frisk væv er utilgængelig38. For det tredje, vi brugt frisk hjernevæv taget fra den frontale cortex, men kapillærer kan være isoleret fra andre kortikale hjerneregioner hvis der er nok ledige væv. Det er også muligt at isolere kapillærer fra ikke-kortikale hjerneregioner (fx., hvide substans), men disse regioner har en anden celle sammensætning og kapillær densitet 66,67,68. Således, ved hjælp af væv fra en anden hjernen regionen ville sandsynligvis kræve, at protokollen skal justeres (f.eks., buffer volumen, gradient medium tæthed, centrifugering hastighed og/eller antallet af trin, filtrering).

Kapillar isolation procedure, er mens ikke komplekse per se, følsomme over for små perturbationer eller ændringer i protokollen. Ændringer kan resultere i en formindsket kapillær udbytte eller reduceret kapillær levedygtighed. Tabel 2 beskriver de mest almindelige fejl og problemer, der er stødt på under isolation og viser en liste over tips til at undgå disse fejl og løsninger til fejlfinding hvis de opstår. Det mest almindelige problem er forbundet med proceduren, der er en lav kapillær udbytte. Tabet af kapillærer er ofte den kumulative sum af små tab på hvert trin og skyldes mindre afvigelser i hele proceduren. Et kritisk trin i som en stor mængde af kapillærer muligvis tabt er tæthed centrifugering. En forkert koncentration i bufferen resulterer i en forkert tæthed til at adskille kapillærer fra celleaffald, der reducerer mængden af kapillar pellet. Figur 3 viser konsekvenserne af for lidt eller for meget tæthed gradient medium taktfast centrifugering i forhold til hjernens homogenatet. Tilpasning til den korrekte koncentration kan løse dette problem. Bemærk at centrifugen acceleration og deceleration hastighed kan også påvirke dannelsen af hjernen kapillær pellet. Kapillærerne kan også være tabt under trin 6 – 7 om en del af den kapillære materiale holder til pipette tips. Dette problem kan løses ved at skylle grundigt hver pipette tip før du ændrer den. Under trin 7, vask off kapillærer fra celle stamme filter kan være ufuldstændige og/eller kapillærer kan holde sig til kanten af filteret. Dette kan undgås ved at kontrollere filteret under mikroskop efterfulgt af yderligere vask trin. At miste kapillærer under hvert trin af proceduren isolation kan resultere i en ubetydelig kapillær pellet eller ikke nok kapillær materiale til videreforarbejdning og eksperimenter.

Isolere hjernen kapillærerne fra frisk humant væv repræsenterer en unik blod - hjerne barrieren model, der ligner i vivo situationen. Men, flere begrænsninger af teknikken findes. En udfordring er tilgængeligheden af frisk humant væv. Som den optimale PMI er ≤4 Hansen, vil hjernevæv, der opsamlet på en betydeligt længere PMI ikke være frisk nok til nogle downstream applikationer. I nogle tilfælde kan det være vanskeligt at få væv beløb, som er store nok til flere eksperimentelle grupper, dermed begrænser downstream applikationer. Således, isolere frisk kapillærer fra gnaver19, canine69, kvæg42eller svin70 hjernevæv kan være mere egnet til model blod - hjerne barrieren. Faktorer, der bestemmer variationen af menneskelige hjernevæv som alder, køn, etnicitet, sygdom stat, medicin historie, hjernen regionen i prøven, og PMI bør tages i betragtning når tolkning og offentliggørelse af data. På det eksperimentelle plan er det vigtigt at bemærke, at isolerede kapillærer stadig medtage pericytes, men astrocytic endfeet er fjernet af proceduren44. Det skal tages i betragtning, at den model præsenteres her tjener som en ex vivo model af blod - hjerne barrieren (dvs., kapillære endotelceller), men ikke som en model af den neurovaskulære enhed.

Arbejde med menneskeligt væv præsenterer altid en iboende sikkerhedsrisiko og forskere skal tage passende forholdsregler under proceduren isolering for at undgå infektion. Specifikt, i USA kræver arbejde med menneskeligt væv udpeget laboratorium plads, der er BSL 2-certificeret og omfatter en biosikkerhed kabinet (klasse A2). Desuden personalet skal bruge personlige værnemidler (dvs., laboratoriekittel, handsker og ansigtsskærm) og udpeget udstyr til arbejde med menneskeligt væv og gennemføre biologisk affald håndtering. Gennemførelsen af disse sikkerhedsforanstaltninger er tidskrævende, omkostningskrævende, og øger vanskeligheden ved proceduren, især for uerfarne laboratoriepersonalet.

Blod - hjerne barrieren er meget bevaret blandt organismer med en veldefineret CNS71. Modellering af menneskers blod - hjerne barrieren er svært, fordi der er komplekse neurovaskulære kobling mellem cellerne i den neurovaskulære enhed. En voksne menneskelige hjerne er blevet anslået til har i gennemsnit omkring 86 milliarder neuroner og det menes, at næsten hver neuron har sin egen kapillær i nærhed til at sørge for ordentlig forsyning med ilt og næringsstoffer72,73. Kapillære endotelceller udgør det største areal af blod-hjerne-grænseflade (12-18 m2 for en sundt voksent menneske). Stramme kryds udgør en hindring for en bred vifte af pharmacotherapeutics ved at blokere paracellular diffusion af opløste stoffer. Desuden talrige undersøgelser beskriver barriere dysfunktion i neurodegenerative sygdomme, fx., Alzheimers sygdom74, slagtilfælde75, epilepsi38,76, multipel sklerose77, og traumatisk hjerne skade28,78. Det er således bydende nødvendigt at fastlægge modeller, der nøje repræsenterer den menneskelige blod - hjerne barrieren og giver mulighed for en bedre forståelse af barriere funktion i sundhed og sygdom.

Talrige findes i vitro celle kultur af blod - hjerne barrieren modeller; Se 41,49,51,69,79,80for ekspertanmeldelser om emnet. Kort, både frisk isoleret hjernen kapillære endotelceller for primære kultur og udødeliggjort hjernen kapillære endotelceller cellelinjer er tilgængelige. Primære kulturer af cerebral microvessel endothelial celler er for det meste bruges fra mus, rotte, gris og ko. Men primære cellekulturer er arbejdskrævende, da celler skal være frisk isoleret. Udødeliggjort hjernen kapillære endotelceller cellelinjer fås hos mus, rotte og menneskelige og er mindre arbejdskrævende, fordi de kan være passaged til længerevarende brug. Selv udødeliggjort cellelinjer har dog en grænse for, hvor ofte de kan være passaged før du mister deres endotel karakteristika. Både primærelementer samt udødeliggjort celler linjer er ofte kulturperler på plader til model af hjernen kapillære endothelium og måle barriere permeabilitet og drug transport på tværs af celle éncellelag, dermed efterligne blod til hjernen transport41 ,81,82. Kultur medier i disse modeller kan også ændres eller suppleres med astrocytter, pericytes eller andre fysiologisk relevante faktorer såsom cAMP41,83,84.

Fordelen ved udødeliggjort cellelinjer er deres relativt nem adgang og tilgængelighed. Mens kulturperler endotelceller kan nå sammenløb, de mister endotel celleegenskaber, som de vokser side om side i en éncellelag. For eksempel, vise kulturperler hCMECs reducerede udtryk for transportvirksomheder som P-gp, tight junction proteiner og display variable permeabilitet til fremmedstoffer41. Figur 4 viser en vestlige skamplet for P-gp protein udtryk i hCMEC/D3 celler i forhold til frisk isolerede menneskelige kapillærer. Trods en 10-fold lavere mængde af total protein er signal for P-gp stærkere i isolerede menneskelige kapillærerne i forhold til hCMEC/D3 celler. Dette indikerer, at hCMEC/D3 celler mistet en betydelig mængde af P-gp protein udtryk i kultur. Forskelle i dyrkningsmedier, miljø og udstyr vedrører desuden nøgleforanstaltninger barriere integritet, dvs, TEER målinger i Transwell plade assays. Nogle af disse problemer kan overvindes ved at udnytte den isolerede hjerne kapillær model, der nærmere repræsenterer den menneskelige blod - hjerne barriere i vivo.

Isolerede hjernen kapillærerne har været brugt i en lang række undersøgelser, herunder genomik, proteomik, funktionel proteomics og cellomics undersøgelser (figur 5). Derudover eksisterer mange teknikker og metoder for at analysere isolerede hjernen kapillærerne inden for hvert af disse felter. Især kan de eksperimentelle teknikker, vist i figur 5 bruges på hjernen kapillærerne isoleret fra en række kilder, herunder menneskelige, kvæg, gnavere og svin væv, som kan lette Translationel forskning. For eksempel, Li et al. 85 studerede genomforskning af blod - hjerne barrieren ved hjælp af undertrykkelse subtraktiv hybridisering af rensende mRNA isoleret fra rotte hjernen kapillærerne. Derudover Ott et al. 86 bruges RT-PCR og qRT-PCR til at undersøge regulering af P-gp af PXR. Mange proteom undersøgelser udnytte Western blotting3, Dot duppes analyse87, enkle Western assays3,38, ELISA88,89, immunoprecipitation3, og immunfarvning3,90,91. At skelne transporter handel i hjernen endotel, McCaffrey et al. 92 brugt subcellulært fraktionering af isolerede hjernen kapillærerne. Sánchez del Pino mfl. 93anvendes isoleret bovin endotel membran vesikler for at skelne transporter placering og transport retning over blod - hjerne barrieren. I andre proteom undersøgelser brugt forskerne væskekromatografi og tandem massespektrometri for at kvantificere transportør proteiner94,95,96. Funktionelle proteom undersøgelser har udnyttet transporter og lækage-undersøgelser,2,38. Hartz et al. 2 bruges zymography til at bestemme enzymaktivitet i isolerede hjernen kapillærerne. Derudover har stort cellomic forskning ved hjælp af cellekultur genereret mange endotel cellelinjer og modeller af blod - hjerne barrieren82,83,84. Med disse modeller omfatter fælles assays bruges migration assays97,98, levedygtighed og toksicitet assays99og angiogenese analyser98.

Isolerede hjernen kapillærerne giver mulighed for præcis karakteristik af protein udtryk og aktivitet og beskrivelse af signalering veje på blod - hjerne barrieren. Dette skyldes delvis, at kapillær indholdet af hjernen, som er kun ca 1% (v/v). Således, ved hjælp af hele hjernen homogenatet eller hjernen skiver som en erstatning for renset kapillære endotelceller vil sandsynligvis resultere i en dårlig signal-støj-forholdet24. Derudover efter isolation er hjernen kapillærerne holdbar i mindst 6 timer (ikke-offentliggjorte data fra mus og rotter), som giver studier at skelne specifikke signaling veje. Det anbefales at medtage en kontrolgruppe fra den samme forberedelse.

Repræsentant og translationel modeller af blod - hjerne barrieren, såsom den isolerede kapillære model behandles i denne rapport, er nødvendige for at studere barriere funktion i sundhed og sygdom. Her præsenterer vi en protokol for at opnå isolerede menneskelige hjerne kapillærer på et godt udbytte og høj kvalitet, der kan tjene som en ex vivo model af blod - hjerne barrieren. Isolerede kapillærer bevarer deres oprindelige struktur og funktion, som tillader at bruge dem til en række efter isolation Molekylær, biokemiske og fysiologiske assays. Bør udvises forsigtighed ved håndtering af humane væv prøver, helst i en BSL 2 eller højere indstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker og anerkender Dr. Peter Nelson og Sonya Anderson på UK-ADC hjernen væv Bank for at levere alle menneskelige hjerne vævsprøver (NIH giver nummer: P30 AG028383 fra National Institute on Aging). Vi takke Matt Hazzard og Tom Dolan, informationsteknologi, akademiske teknologi og Fakultet Engagement, University of Kentucky for grafisk assistance. Dette projekt blev støttet af tilskud antal 1R01NS079507 fra det nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde (til BB) og ved tilskud antal 1R01AG039621 fra National Institute on Aging (til A.M.S.H.). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde eller National Institute on Aging. Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

Tags

Neurovidenskab sag 139 neurovidenskab neurovasculature blod - hjerne barrieren hjernen kapillærerne endotelceller menneskelige hjernevæv
Isolering af cerebrale kapillærer fra frisk menneskelige hjernevæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hartz, A. M. S., Schulz, J. A.,… More

Hartz, A. M. S., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter