Summary
Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.
Abstract
Inzicht in functie van de bloed - hersenbarrière fysiologische en pathofysiologische omstandigheden is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die de belofte houdt verbeteren hersenen drug, verbetering van de bescherming van de hersenen, en behandelen van hersenen stoornissen. Echter, het bestuderen van de menselijke bloed - hersen barrière-functie is uitdagend. Dus, is er een cruciale behoefte aan passende modellen. In dit verband vertegenwoordigen hersenen haarvaten geïsoleerd van menselijk hersenweefsel een uniek instrument om te studeren barrièrefunctie als dicht bij de mens in vivo situatie mogelijk. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de haarvaten van menselijk hersenweefsel op een hoog rendement en met constante kwaliteit en zuiverheid. Haarvaten zijn geïsoleerd uit verse menselijk hersenweefsel met mechanische homogenisering, dichtheid-verloop centrifugeren en filtratie. Na het isolement, kunnen de haarvaten van het menselijk brein worden gebruikt voor diverse toepassingen waaronder lekkage testen, levende cel imaging en immuun-gebaseerd testen aan studie eiwit expressie en functie, enzymactiviteit of intracellulaire signalering. Geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten zijn een uniek model voor het ophelderen van de regulering van de functie van menselijk bloed - hersenbarrière. Dit model kan inzicht verwerven in het centrale zenuwstelsel (CNS) pathogenese, die bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën helpen zal voor de behandeling van aandoeningen van de CNS.
Introduction
De bloed - hersen-barrière is een strak gecontroleerde interface tussen het bloed en de hersenen die bepaalt wat er in en uit de hersenen komt. Anatomisch, endotheliale cellen componeren van de bloed - hersenbarrière en vormt een complexe, voortdurende capillaire netwerk. Fysiologisch, levert dit capillaire netwerk de hersenen met zuurstof en voedingsstoffen terwijl tegelijkertijd verwijdering van kooldioxide en afvalstoffen stofwisselingsproducten. Nog belangrijker is, ondersteunt bewijs dat de wijzigingen in de barrière aan vele ziekten bijdragen, waaronder de ziekte van Alzheimer, epilepsie en beroerte1,2,3,4,5 , 6 , 7. hersenen endotheliale cellen ook als een belemmering voor de behandeling dienen door het blokkeren van opname van de drug in de hersenen, bv., chemotherapie van glioblastoma multiforme na tumor resectie8,9, 10. In dit verband geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten vertegenwoordigen een unieke ex vivo bloed - hersenbarrière model dat sterk lijkt op barrière eigenschappen in vivo, die het mogelijk voor de studie van de barrièrefunctie en dysfunctie in gezondheid maakt en ziekte. In dit artikel geven wij een protocol om te isoleren van de haarvaten van de hersenen van menselijke hersenen op een constant hoog capillaire kwaliteit en opbrengst om te bestuderen van de bloed - hersenbarrière.
In 1969, Siakotos et al. 11 waren de eersten die het verslag van het isolement van de haarvaten van de hersenen van runderen en menselijk hersenweefsel met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren en glazen kraal kolom scheiding. Later, Goldstein et al. Deze methode verbeterd 12 door het toevoegen van meerdere filtratie stappen om te verminderen van de hoeveelheid weefsel te bestuderen van de haarvaten van de hersenen van ratten, geïsoleerd met behoud van de metabole activiteit van glucose vervoer nodig. Sindsdien onderzoekers geoptimaliseerd de capillaire isolatie procedure talloze malen, verbetering van de methode en de hersenen capillaire model met elke iteratie13,14,15. Bijvoorbeeld, Pardridge et al. 16 boviene haarvaten met behulp van enzymatische spijsvertering in plaats van mechanische homogenisering geïsoleerd, en dan vervolgens doorgegeven een capillaire schorsing door een 210 µm mesh filter en een glazen kraal kolom. Deze wijzigingen de trypan blauwe uitsluiting vlek van geïsoleerde hersenen haarvaten verbeterd en dus verhoogd endothelial cel levensvatbaarheid. In de vroege jaren 1990, Dallaire et al. 17 geïsoleerd runderen en rat haarvaten, die waren duidelijk van neuronale besmetting en onderhouden metabole activiteit of alkalische fosfatase en Gamma-glutamyl transferase (γ-GTase). In 2000, Miller et al. 18, gebruikt geïsoleerde rat en varkens hersenen haarvaten in combinatie met confocale microscopie te tonen van de accumulatie van vervoer substraten in het lumen van de haarvaten. Vervolgens ons laboratorium doorgegaan met het optimaliseren van de hersenen capillaire isolatie procedure en wij hebben vastgesteld dat vervoer testen om te bepalen van P-glycoproteïne (P-gp)19,20,21, borstkanker weerstand eiwit (BCRP)22,23, en meerdere drugweerstand eiwit 2 (Mrp2)24 vervoersactiviteit. In 2004 publiceerden we twee verslagen waar we gewend geïsoleerde rat hersenen haarvaten verschillende signaalroutes onderzoeken. In Hartz et al. 21, vonden we dat de peptide endothelin-1 snel en omkeerbaar verminderd P-gp vervoer functie in de haarvaten van de hersenen door te handelen via de endothelin receptor B (ETB) receptor, stikstofoxide synthase (NOS) en proteïne kinase C, (PKC). In Bauer et al. 19, we toonden expressie van de nucleaire receptor pregnane X receptor (PXR) en toonde PXR-modulatie van P-gp expressie en vervoer functie in de haarvaten van de hersenen. In experimenten met transgene gehumaniseerd PXR muizen, we uitgebreid deze lijn van onderzoek en toonde in vivo aanscherping van het blok door upregulating P-gp via hPXR activering25. In 2010, Hartz et al. 26 gebruikt deze aanpak om te herstellen van P-gp eiwit expressie en vervoer van activiteit in transgene menselijke amyloïde precursor proteïne (hAPP) muizen die overexpress hAPP. Bovendien verminderd herstellen van P-gp in hAPP muizen aanzienlijk bèta amyloid (Aβ)40en Aβ42hersenen niveaus.
Naast het studeren signaalroutes, kunnen geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt voor het bepalen van de veranderingen in de capillaire permeabiliteit die wij capillaire lekkage noemen. In het bijzonder wordt de bepaling van de lekkage Texas Red gebruikt ter beoordeling van de lekkage van de fluorescente kleurstof Texas Red van de capillaire lumen in de tijd en deze gegevens worden vervolgens gebruikt voor het analyseren van lekkage tarieven. Verhoogde capillaire lekkage tarieven in vergelijking met die van controle haarvaten geven wijzigingen in de fysieke integriteit van de bloed - hersen barrière-2. Dit is waardevol, want er talrijke ziekte staten gekoppeld barrière ontwrichting, BV zijn., epilepsie, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer en traumatische hersenen letsel27,28,29, 30. Andere groepen hebben ook gebruikt voor geïsoleerde haarvaten te onderscheiden signaalroutes die eiwit expressie en vervoersactiviteit van proteïnen31,32,33,34regelen, 35,,36,,37. Tot slot, wij zijn blijven om het optimaliseren van deze methode voor de isolatie van menselijke hersenen haarvaten en onlangs, toonden wij verhoogde P-gp expressie op het menselijke bloed - hersenbarrière bij patiënten met epilepsie in vergelijking met inbeslagneming-gratis controle individuen38 . Samen genomen, tonen deze ontwikkelingen dat geïsoleerde hersenen haarvaten als een veelzijdig model om te studeren barrièrefunctie kunnen dienen.
Verschillende in vivo, ex vivoen in vitro de bloed - hersen barrière-modellen zijn gebruikt in basisonderzoek en industriële drug screening, hoofdzakelijk met het doel van de tests van de drug levering aan de hersenen39,40,41 ,42,43,44. Naast geïsoleerde ex vivo de haarvaten van de hersenen omvatten actuele modellen van de bloed - hersenbarrière in silico modellen, in vitro de cultuur van de cel van geïsoleerde capillaire endothelial hersencellen of vereeuwigd cellijnen uit verschillende soorten, in vitro cultuur van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) dat onderscheid in hersenen capillaire endotheliale cellen en microfluidic modellen op een chip.
In silico modellen zijn het meest gebruikt in Geneesmiddelenontwikkeling voor het selecteren van drugkandidaten op basis van het voorspelde absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) eigenschappen. Methoden zoals kwantitatieve structuur-eigenschap relatie (QSPR) en kwantitatieve structuur-activiteit relatie (QSAR) modellen zijn populaire methoden in high-throughput screening van bibliotheken gebruikt om te voorspellen hersenen penetratie van drugkandidaten 45 , 46. deze modellen zijn nuttig voor scherm moleculen voor barrière penetratie eigenschappen.
Betz et al. 47 opgericht monolayers van gekweekte capillaire endothelial hersencellen als een in vitro -systeem van het bloed - hersen barrière-model. In vitro cel cultuur modellen met behulp van vers weefsel of vereeuwigd endothelial cellijnen zoals menselijke cerebrale microvessel endotheliale cellen (hCMECs) kunnen een ander high-throughput screening hulpmiddel voor hersenen penetratie of mechanistische studies. Echter, hersenen capillaire endothelial cel cultuur modellen ontbreken de fysiologische schuifspanning van de bloedstroom in de capillaire lumen, zijn beperkt in het algemeen biologische complexiteit en ondergaan veranderingen in expressie en lokalisatie van belangrijke barrière onderdelen zoals tight junction eiwitten kanalen oppervlakte receptoren, vervoerders, enzymen en ion48,49,50. Omgekeerd, endotheel monolayers afgeleid van hPSCs, hebben lage sacharose permeabiliteit in vergelijking met hCMEC/D3 culturen en gepolariseerde expressie van sommige vervoerders van de bloed - hersen barrière, celadhesie-moleculen en strakke kruispunten51, bevatten 52. echter deze cellen ook onderhevig is aan veranderende eigenschappen in de cultuur, en het systeem moet worden gevalideerd voor haar recapitulatie van in vivo barrière eigenschappen52.
Nieuwere tendensen in de bloed - hersenbarrière onderzoek omvatten met behulp van 3D weefselkweek systemen tot kunstmatige haarvaten, met behulp van de orgel-op-spaander technologie voor het genereren van microfluidic apparaten, of met behulp van de holle vezel technologie53, 54 , 55. kunstmatige haarvaten, hebben echter aanzienlijk grotere diameters (100 – 200 µm) dan hersenen haarvaten (3-7 µm). Vandaar, de shear krachten in vitro doen niet volledig lijken op de in vivo situatie. Dit wordt behandeld in "blood-brain-barrier-on-a-chip" microfluidic apparaten, waar kunstmatige membranen formulier "bloed" en "brein" compartimenten en vloeistoffen door deze apparaten genereren microfluidic shear krachten worden gepompt. Ook zijn mede culturen van endotheliale cellen in verschillende combinaties met astrocyten en vasculaire zachte spiercellen ook gebruikt met de holle vezel technologie te herscheppen Rheologische parameters aanwezig onder in vivo voorwaarden56 , 57 , 58. het is echter onduidelijk hoe goed dit model dat andere eigenschappen van de bloed - hersenbarrière zoals vervoer, metabolisme, signalering en anderen weerspiegelt. Deze kunstmatige capillair en chip modellen zijn geschikt voor high-throughput screening van drugs, maar de cellen die worden gebruikt voor het genereren van deze modellen kunnen ook worden gewijzigd tijdens de cultuur.
Bevroren en vaste hersenen segmenten of primaire hersenen capillaire endothelial celculturen zijn extra modellen die kunnen worden gebruikt voorhet bestuderen van de menselijke microvasculature5,59,60,,61. Bijvoorbeeld, immunohistochemistry van vaste hersenweefsel wordt gebruikt om te bepalen eiwit lokalisatie en expressie in gezonde vergeleken met zieke weefsel.
Naast weefsel segmenten en de in vitro -modellen kunnen zoals hierboven beschreven, vers geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt om het bestuderen van de bloed - hersenbarrière functie. Beperkingen van dit geïsoleerde capillaire model omvatten de moeilijkheid om op te halen van de verse menselijk hersenweefsel, afwezigheid van neuronen, astrocyten en een relatief tijdrovend isolatie-proces. Een voordeel van het geïsoleerde hersenen capillaire model is dat dit model veel overeenkomsten vertoont met de situatie in vivo en daarom kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de barrièrefunctie en dysfunctie. Nog belangrijker is, kan het ook worden gebruikt om te onderscheiden van signalering mechanismen met behulp van een veelheid aan tests en moleculaire technieken3,19,62,,63.
Ons laboratorium heeft toegang tot beide verse en diepgevroren menselijk hersenweefsel door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M)64. In dit verband lijkschouwingen volgen een standaardprotocol, hersenen worden verkregen < 4 h, en alle procedures in overeenstemming zijn met de NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Deze unieke toegang krijgen tot menselijk hersenweefsel, wij opgericht en een protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel die in een hoog rendement van intact, haalbare menselijke hersenen haarvaten resulteert geoptimaliseerd. Twee gemeenschappelijke eindpunten van belang zijn de eiwituitdrukking en activiteit te bepalen. In dit verband hebben wij en anderen verschillende tests die kunnen worden gebruikt met geïsoleerde hersenen haarvaten aan studie eiwit expressie en activiteitenniveaus vastgesteld. Deze testen omvatten westelijke bevlekken, eenvoudige Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), zymography, vervoer activiteit testen, en capillaire lekkage testen. Deze tests kunnen onderzoekers te bestuderen veranderingen in functie als barrière in menselijke pathologische voorwaarden, trajecten waaraan eiwit expressie en activiteit te bepalen, en identificeren van farmacologische doelstellingen voor de behandeling van de bloed - hersen barrière gekoppeld ziekten.
Genomen samen, vers geïsoleerde hersenen haarvaten kunnen dienen als een robuuste en reproduceerbare model van de bloed - hersenbarrière. Vooral, kan dit model worden gecombineerd met veel verschillende testen om te bepalen van een breed scala van eindpunten te bestuderen barrièrefunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De informatie hieronder is gebaseerd op de huidige veiligheids- en wettelijke normen aan de Universiteit van Kentucky, Lexington, KY, Verenigde Staten. Als voorzorgsmaatregel inzake veiligheid, verwijzen naar de biologische veiligheidsprogramma van de instelling en de meest recente verordeningen en aanbevelingen voor het werken met menselijk weefsel.
Let op: Menselijk weefsel kan ook een bron van bloed overgedragen ziekteverwekkers, met inbegrip van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) en anderen. Werken met menselijk weefsel brengt het risico van infectie door bloed overgebrachte ziekteverwekkers. Bepaalde overwegingen regelgevings- en veiligheid zijn dus noodzakelijk bij het werken met menselijk weefsel te beschermen van laboratoriumpersoneel. Werken met menselijk weefsel in de VS vereist een niveau 2-laboratorium van bioveiligheid, alsmede voorzorgsmaatregelen betreffende veiligheid en opleiding overeenkomstig NIH sectie IV-B-7, OSHA Act van 1970-component 5(a)(1) en van de gebruiker institutionele biologische veiligheidsprogramma. In het algemeen, moet institutionele bioveiligheid Comité en/of institutionele Review Board goedkeuring worden verkregen voorafgaand aan een onderzoek waarbij menselijke materialen (weefsels, lichaamsvloeistoffen). De opleiding is vereist voor alle personeelsleden die werken met menselijke materialen en omvat basic Labor veiligheidstraining, bijvoorbeeld, chemische hygiëne en laboratorium veiligheid, evenals specifieke opleiding inzake biologische veiligheid, gevaarlijke afvalstoffen, en mens door bloed overgedragen ziekteverwekkers. Al het personeel werken met menselijke materialen zijn sterk aanbevolen om Hepatitis B vaccinaties, voorafgaand aan het werken met menselijke materialen. Personeel zijn verplicht te dragen specifieke persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het werken met menselijk materiaal, bijv., een radialis laboratoriumjas en een gezicht schild, en draag handschoenen te allen tijde. Alle werk wordt uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid (klasse 2). Alle apparatuur die in contact met menselijk materiaal en ieder afval uit menselijke materialen komt is behandeld om te voorkomen dat besmetting en/of besmetting van personeel. Alle apparatuur en oppervlakken worden schoongemaakt met 10% bleekwater en 75% ethanol na elke procedure waarbij menselijke materialen. Een lekkage met menselijke materialen moet onmiddellijk worden gereinigd. Glaswerk is een gesteriliseerde met autoclaaf na elk gebruik. Afval, met inbegrip van nietgefixeerde menselijk weefsel, is verzameld in een afval zak van gelabelde biohazard en gesteriliseerde met autoclaaf. Scherpe instrumenten worden verzameld in een container van de punctie - en lekvrije aangeduid als biohazardous. Alle afvalstoffen van menselijke materialen worden verwijderd volgens de biologische veiligheidsvoorschriften van de instelling.
Opmerking: Ons laboratorium verkrijgt verse frontale cortex monsters van overleden personen door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M). Inclusie criteria zijn: inschrijving in het UK-ADC autopsie longitudinale cohortstudie en een Post-Mortem-Interval (PMI) ≤4 h64. Lijkschouwingen volgen een standaard protocol en alle procedures voldoen aan NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Een korte PMI van minder dan 4 h is van hoogste belang om capillaire levensvatbaarheid na isolatie. Zowel vers als diepgevroren weefsel kan worden gebruikt. Als bevriezing nodig is, vers verkregen menselijk hersenweefsel moet schok-ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C. Verse of ontdooide weefsel moet worden opgeslagen in de buffer van de isolatie (zie hieronder) en snel verwerkt. Wij vinden dat 10 g verse menselijk weefsel opbrengsten ongeveer 100 mg van hersenen haarvaten (versgewicht).
1. setup
-
Voorbereiding van de buffer
Opmerking: De omvang van de buffer nodig afhankelijk van de hoeveelheid weefsel. Alle volumes van de buffer in de onderstaande voorschriften zijn gebaseerd op 10 g van menselijk hersenweefsel van de cortex.- L geïsoleerd Buffer: 1,5 L Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM nb2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0.49 mM MgCl2) gebruiken en aan te vullen met 5 mM D-glucose (1,35 g ) en 1 mM natrium pyruvaat (0.165 g). Na toevoeging van glucose en pyruvaat, aangepast aan de pH 7.4 met natriumhydroxide. Afkoelen en bewaar de buffer 4 ° C vóór gebruik.
- Bovien serumalbumine (BSA): Voeg 10 g BSA poeder aan 1 L geïsoleerd buffer om een eindconcentratie van de BSA van 1%. Roer langzaam om luchtbellen te vermijden, aanpassen op een pH van 7,4 en bewaren bij 4 ° C's nachts. Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, voorzichtig roeren; Vermijd bubbels Voorkom albumine denaturatie vormen.
- kleurovergang medium dichtheid: Weeg 18 g van de kleurovergang medium dichtheid in een glazen fles en een magnetische roer-balk toe te voegen. Voeg 60 mL isolatie buffer en schud krachtig gedurende 5 min, tot alle poeder is geschorst. Winkel 's nachts bij 4 ° C om het medium dichtheid kleurovergang te ontbinden. Roer gedurende 10 min vlak voor gebruik.
- Opslaan van alle buffers bij 4 ° C; Houd alle tools en buffers op ijs tijdens de gehele isolatie-procedure. Roer alle buffers vóór gebruik.
-
Experimentele opstelling
- Monteer de stamper van de Potter-Elvehjem weefsel molen op de elektronische Bovenroerder. Plaats de Potter-Elvehjem weefsel grinder en de Dounce homogenizer met stamper op ijs onder de motorkap. Bereiden van een 300 µm filter maaswijdte (5 x 5 cm2), vouw het tot een kegel, invoegen en koppelen aan een 50 mL Falcon buis met tape (figuur 1A).
- Plaats van de aansluitende ringen en cel van de stam filters (porie grootte: 30 µm) op 50 mL Falcon buizen. Biohazardous afval zakken voor te bereiden. Plaats alle benodigde apparatuur in het biosafety kabinet (Zie Tabel van materialen).
2. bereiding van de monsters van de hersenen
Opmerking: Figuur 1A ziet u op de grafiek van de werkstroom van de hieronder beschreven procedure voor de gehele isolatie. Menselijk hersenweefsel kan voortvloeien uit enig deel van de cortex en kan worden gebruikt, vers of bevroren. Bevroren hersenweefsel kan worden ontdooid bij kamertemperatuur (geen buffer; ~ 30 min. voor 10 g). Vergelijkbare om resultaten te bereiken, moet het hersenweefsel worden verkregen uit de dezelfde regio van de hersenen voor elk experiment. Dit protocol is geoptimaliseerd voor vers (PMI < 4 h) menselijke hersenschors die heeft niet bevroren.
- Voorbereiding van menselijk hersenweefsel: Document van het gewicht van het hersenweefsel. Alle getallen in het volgende protocol zijn geschikt voor 10 g verse menselijk hersenweefsel. Plaats het hersenweefsel in een petrischaal van 100 mm. Verwijder voorzichtig alle de hersenvliezen met een tang. Gebruik een scalpel afgesneden van de witte stof.
- Hakken van het menselijk hersenweefsel: zorgvuldig uitgesneden van het hersenweefsel en het gehakt met een scalpel. Gehakt voor ongeveer 5 minuten (2 – 3 mm stuks). Het hersenweefsel overbrengen in de Potter-Elvehjem weefsel molen. Voeg 30 mL isolatie buffer.
Opmerking: De stukken gehakt weefsel zijn moeilijk te zien omdat het hersenweefsel in mush door het hakken proces verandert.
3. homogenisering
- Potter-Elvehjem weefsel slijper (goedkeuring: 150 – 230 µm): Meng van elk monster met 100 lijnen met een snelheid van de homogenizer van 50 rpm. Het document van de tijd elke 25 lijnen en de totale tijd die nodig is voor 100 slagen. Zie tabel 1 voor een voorgestelde homogenisering protocol; de totale tijd voor homogenisatie van 10 g van menselijke frontale cortex is ongeveer 22 min. Niet roer in de lucht om te voorkomen dat de bubbels.
- Dounce homogenizer (goedkeuring: 80-130 µm): het homogenaat overbrengen in een Dounce homogenizer op ijs. Meng de vering met 20 lijnen (~ 6 s/lijn, totaal van ~ 2 min). Vermijd bellen.
4. centrifugeren
- De hersenen homogenaat gelijkmatig moeten verdelen in vier 50 mL centrifugeren buizen en document het totale volume van het homogenaat. 50 mL dichtheid kleurovergang buffer verdelen over het centrifugeren buizen (12,5 mL per buis). Gebruik 10 mL voor isolatie buffer te spoelen van de stamper en de homogenizer, en verdelen over de vier centrifugeren buizen (~2.5 mL per buis).
- Strak sluit de centrifuge buizen met doppen. Meng de homogenaat kleurovergang medium dichtheid en de buffer door krachtig schudden van de buizen. Centrifugeer bij 5.800 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C (vaste hoek rotor); Selecteer de snelheid van een middelgrote vertraging te houden van de pellet gekoppeld aan de buis. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 2 mL zuiver 1% BSA.
5. filtratie
Opmerking: Om te scheiden van de haarvaten van rode bloedcellen en andere cel puin, verschillende filtratie stappen nodig zijn.
- 300 µm mesh: filteren na opnieuw door de pellet te schorten, de opschorting door de Maas 300 µm. Haarvaten zijn gefilterd door de Maas, overwegende dat grotere schepen en grotere hersenen puin op de Maas blijven. De Maas met maximaal 50 mL 1% BSA grondig te wassen. Het negeren van de Maas.
Opmerking: Deze stap filtratie wist de capillaire schorsing van grotere schepen of brokken van hersenen puin. -
30 µM cel stam filter
Opmerking: Deze stap filtratie scheidt haarvaten van rode bloedcellen en andere hersenen puin.- Distribueer het capillaire filtraat uit stap 6.1 via de vijf 30 µm cel stam filters (ongeveer 10 mL capillaire filtraat per cel stam filter). Haarvaten zijn tegengehouden door dit filter, overwegende dat de rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en kleine hersenen puin het filter passeren en verzameld in het filtraat zijn.
- Elk filter met 25 mL van de 1% BSA wassen. Daarna giet alle filtraten het zesde filter te verhogen van het rendement. Wassen van elk filter met 50 mL van de 1% BSA; Houd de cel stam filters met die van de haarvaten en negeren het filtraat.
6. capillaire collectie
- De filters ondersteboven en wassen van de haarvaten met 50 mL van de 1% BSA voor elk filter in 50 mL buizen. Zachtjes toepassen van druk met het uiteinde van de pipet van een 5 mL-pipet en verplaats het over het filter voor het afwassen van de haarvaten van de hersenen.
- Zorg ervoor dat alle haarvaten van de hersenen, vooral vanuit de rand van het filter afwassen. Vermijd bellen omdat dit het proces filtratie bemoeilijkt en de kans op capillaire verlies verhoogt.
7. wassen
- Na het verzamelen van de haarvaten, centrifugeren alle monsters bij 1.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C (swingende emmer rotor). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ongeveer 3 mL isolatie buffer. Combineer alle geresuspendeerde pellets uit één monster in een conische tube van 15 mL en vullen met isolatie buffer. Centrifugeer nogmaals bij 1.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en twee keer wassen.
- Het document van de capillaire zuiverheid met een microscoop (100 X vergroting) en de camera (figuur 1B).
Opmerking: De hersenen capillaire opbrengst van 10 g van menselijk hersenweefsel is meestal ongeveer 100 mg. De haarvaten geïsoleerde hersenen kunnen nu worden gebruikt voor experimenten, verwerkt (bv., lysate, membraan isolatie), of flash-bevroren en opgeslagen bij-80 ° C in cryotubes voor een minimum van 6 – 12 maanden (Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De isolatie van menselijk hersenweefsel opbrengst een schorsing in menselijke hersenen haarvaten (figuur 1B) verrijkt met kleine hoeveelheden van grotere schepen, rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en enkele cel puin. Sommige haarvaten zijn vertakt en, in sommige, rode bloedcellen zijn gevangen in de capillaire lumen. Het typische capillair heeft een diameter van 3 – 7 µm en is ongeveer 100-200 µm lang met open lumen; meeste capillaire eindigt zijn samengevouwen. Met behulp van confocale microscopie, onthullen geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten een buisvormige, intact structuur en morfologie. Figuur 2A toont dat een vertegenwoordiger overgedragen licht beeld van een menselijk brein capillair met een bijgevoegde pericyte en een rode bloedcellen in het lumen. Al de bevindingen met betrekking tot de diameter, de grootte en morfologie zijn in overeenstemming met eerdere verslagen over de structuur van geïsoleerde hersenen haarvaten12,17,18. De geïsoleerde menselijke hersenen capillaire in figuur 2B werd immunostained voor P-gp (groen) met behulp van C219 als het primaire antilichaam (1 µg/mL); kernen werden counterstained met DAPI (1 µg/mL).
Figuur 1: stroomdiagram voor capillaire isolatie. (A) het pictogram illustreert de belangrijke stappen van de procedure voor het isoleren van hersenen haarvaten van verse menselijk weefsel. (B) de afbeelding toont geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten onder een lichte Microscoop direct na isolatie (100 X vergroting). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: geïsoleerde menselijke hersenen capillaire. (A) A uitgezonden licht beeld van een geïsoleerd menselijk brein capillaire. (B) de confocal microscoop afbeelding toont een geïsoleerd menselijk brein capillaire immunostained voor P-gp (groen; C219 1 µg/mL); kernen werden counterstained met DAPI (blauw; 1 µg/mL). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Troubleshooting dichtheid centrifugeren. Het pictogram toont het preparaat na de dichtheid kleurovergang centrifugeren. Zij wijst op de gevolgen van te veel en te weinig dichtheid kleurovergang medium en hoe dit van invloed is op de scheiding en de resulterende capillaire pellet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: P-gp eiwituitdrukking in geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten. De westelijke vlek toont sterke banden voor P-gp (1 µg/mL) in geïsoleerde menselijke haarvaten in vergelijking met hCMEC\D3 cellen. Β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden (1 µg/µL). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: toepassingen voor geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten. Een overzicht van de meest voorkomende toepassingen voor geïsoleerde hersenen haarvaten gepubliceerd in de literatuur. Geïsoleerde haarvaten zijn gebruikt voor: 1) Genomics85,86, 2) Proteomics3,38,87,88,89,90, 91,,92,94,,95,96, 3) functionele Proteomics2,38, en 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Lijnen | Tijd [min] |
| 1-25 | 7-7.5 |
| 26-50 | 5-5.5 |
| 51-75 | 5-5.5 |
| 76 – 100 | 5-5.5 |
| Totale tijd: | 22 – 24 min |
Tabel 1: homogenisering protocol. De homogenisering protocol voor de Potter-Elvehjem weefsel molen te homogeniseren 10 g van menselijke frontale cortex een homogenisering snelheid van 50 rpm. Merk op dat de eerste verschillende streken extra tijd vereisen om Meng het gehakt weefsel. Na deze eerste homogenisering, elke streek is 12 s in duur (6 s voor neerwaartse beweging, 6 s voor opwaartse beweging). Dus, na de initiële homogenisering, 5 lijnen kunnen worden bereikt in 1 min of 25 lijnen in 5 min.
| Probleem | Mogelijke oorzaak | Oplossing |
| Geen capillaire Pellet | 1) onjuiste densiteitgradiënt concentratie | 1) aanpassen van de concentratie van de densiteitgradiënt |
| 2) onjuiste centrifugeren snelheid | 2) centrifugeren snelheid aanpassen | |
| 3) verkeerde versnelling en/of vertraging snelheid | 3) versnelling en/of vertraging snelheid aanpassen | |
| Lage capillaire opbrengst | 1) hersenvliezen blokkeren filtratie stappen | 1) Verwijder alle hersenvliezen vóór filtratie |
| 2) teveel haarvaten verloren tijdens de procedure van de isolatie | 2) bereken buffer concentratie correct, spoel de pipet tips | |
| 3) wassen haarvaten uit PluriStrainer filters was onvoldoende | 3) draai filters en zorgvuldig inspecteren op haarvaten (gebruik Microscoop) | |
| 4) overtollige bubbels tijdens resuspensions | 4) Pipetteer langzaam te vermijden bubbels | |
| Niet-levensvatbare haarvaten | 1) uitgebreide post mortem interval | 1) verminderen interval indien mogelijk of module-bevroren hersenen gebruiken |
| 2) Using bevroren weefsel voor de isolatie | 2) gebruik vers weefsel | |
| 3) tijd van isolatie procedure te lang | 3) optimaliseren workflow | |
| 4) apparatuur/buffers hielden niet op ijs tijdens de isolatie-procedure | 4) houden van de apparatuur en buffers op ijs tijdens de isolatie |
Tabel 2: oplossen van gemeenschappelijke problemen. Een lijst van de meest voorkomende fouten en problemen die zich voordoen tijdens de procedure van de isolatie en hoe ze kunnen worden opgelost.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het isolement van intact en levensvatbare menselijk brein haarvaten van vers weefsel. In dit gedeelte bespreken we in detail de volgende: 1) wijzigingen in het protocol 2) oplossen van veel voorkomende fouten, 3) beperkingen van de techniek, 4) de betekenis van het model met betrekking tot bestaande en alternatieve bloed - hersenbarrière modellen, en 5). mogelijke toepassingen voor geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten.
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor 10 g verse menselijke frontale cortex weefsel. Echter, het is relatief eenvoudig te wijzigen van deze procedure voor: 1) min of meer dan 10 g weefsel, of 2) bevroren hersenweefsel 3) hersenweefsel uit een regio van de hersenen dan de frontale cortex. Eerst, met meer of minder dan 10 g van hersenweefsel, de nodige hoeveelheid de buffers kan eenvoudig worden geschaald omhoog of omlaag om het beschikbare bedrag van weefsel. Dus, als slechts 5 g van hersenweefsel beschikbaar is, het volume van de buffers moet worden gehalveerd. Ten tweede, we beschrijven een capillaire isolatie die verse hersenweefsel gebruikt, maar bevroren weefsel kan worden gebruikt als verse weefsel niet beschikbaar38 is. Ten derde, we gebruikt verse hersenweefsel ontleend aan de frontale cortex, maar haarvaten kunnen worden geïsoleerd van andere corticale hersengebieden als er genoeg beschikbaar weefsel. Het is ook mogelijk om te isoleren van de haarvaten van niet-corticale hersengebieden (bv., witte stof), maar deze regio's hebben een andere cel samenstelling en capillaire dichtheid 66,67,68. Dus, met behulp van weefsel uit een regio verschillende hersenen zou waarschijnlijk vereisen het protocol om te worden aangepast (bijvoorbeeld, buffervolume, kleurovergang middelhoge dichtheid, snelheid van centrifugeren, en/of aantal filtratie stappen).
De capillaire isolatie procedure, is terwijl niet complexe per se, gevoelig voor kleine verstoringen of wijzigingen in het protocol. Wijzigingen kunnen resulteren in een verminderde capillaire opbrengst of verminderde capillaire levensvatbaarheid. Tabel 2 overzicht van de meest voorkomende fouten en problemen die zijn opgetreden tijdens het isolement en vindt u tips om te voorkomen dat deze fouten en oplossingen voor problemen oplossen als deze zich voordoen. Het meest voorkomende probleem gekoppeld aan de procedure is een lage capillaire opbrengst. Het verlies van de haarvaten is vaak het cumulatieve totaal van kleine verliezen bij elke stap en is te wijten aan kleine afwijkingen in de procedure. Een cruciale stap in die een grote hoeveelheid haarvaten gaan mogelijk verloren is de dichtheid centrifugeren. Een onjuiste concentratie in de buffer resulteert in een onjuiste dichtheid te scheiden van de haarvaten van cellulaire puin dat het volume van de capillaire pellet vermindert. Figuur 3 toont de gevolgen van te weinig of teveel dichtheid kleurovergang medium in het centrifugeren stap ten opzichte van de hersenen homogenaat. De concentratie aan te passen aan de juiste kan het oplossen van dit probleem. Merk op dat de versnelling en vertraging snelheid van de centrifuge kan ook invloed hebben op de vorming van de hersenen capillaire pellet. Haarvaten ook mogelijk verloren tijdens de stappen 6 tot en met 7 als onderdeel van de capillaire materiaal houdt zich aan de uiteinden van de pipet. Dit probleem kan worden aangepakt door elke tip Pipetteer grondig te spoelen voordat u deze wijzigt. Tijdens stap 7, wassen van de haarvaten van de filter van de stam cel onvolledig kan zijn en/of haarvaten kunnen vasthouden aan de rand van het filter. Dit kan vermeden worden door controle van de filter onder de Microscoop gevolgd door extra wassen stappen. Verlies van haarvaten tijdens elke stap van de procedure van de isolatie kan resulteren in een te verwaarlozen capillaire pellet of weinig capillaire materiaal voor verdere verwerking en experimenten.
Isoleren van hersenen haarvaten van verse menselijk weefsel vertegenwoordigt een unieke bloed - hersen barrière-model, dat veel overeenkomsten vertoont met de situatie in vivo . Er bestaan echter verschillende beperkingen van de techniek. Een uitdaging is de beschikbaarheid van vers menselijk weefsel. Als de optimale PMI ≤4 h is, zal hersenweefsel verzameld op een aanzienlijk langere PMI niet vers genoeg voor sommige downstream toepassingen. In sommige gevallen is het wellicht moeilijk te verkrijgen van weefsel bedragen die groot genoeg zijn voor meerdere experimentele groepen, waardoor het beperken van downstream toepassingen. Dus wellicht verse haarvaten van knaagdier19, canine69, boviene42of varkens70 hersenweefsel isoleren meer geschikt voor het model van de bloed - hersenbarrière. Factoren die bepalend zijn voor de variabiliteit van menselijk hersenweefsel zoals leeftijd, geslacht, etniciteit, staat van de ziekte, medicatie geschiedenis, regio van de hersenen van monster, en PMI moet worden rekening gehouden met wanneer interpreteren en bekendmaking van gegevens. Op een experimentele niveau is het belangrijk op te merken dat geïsoleerde haarvaten nog steeds pericytes omvatten, maar astrocytic endfeet worden verwijderd door de procedure-44. Er moet rekening worden gehouden dat de hier gepresenteerde model als een ex vivo -model van de bloed - hersen-barrière (d.w.z., capillaire endotheliale cellen), maar niet als een model van de neurovasculaire eenheid fungeert.
Werken met elk menselijk weefsel altijd presenteert een inherente veiligheidsrisico's en onderzoekers moeten passende voorzorgsmaatregelen te nemen tijdens de procedure van de isolatie om te voorkomen dat infectie. In het bijzonder in de VS vereist werk met menselijk weefsel aangewezen laboratorium ruimte die is BSL 2-gecertificeerd en bevat een bioveiligheid kabinet (klasse A2). Daarnaast, personeel moet gebruiken persoonlijke beschermingsmiddelen (dwz., laboratoriumjas, handschoenen en gelaatsscherm) en apparatuur voor werk met menselijk weefsel en implementeren biohazardous afvalverwerking aangewezen. De uitvoeringsmaatregelen van deze veiligheid is tijdrovend, kostenintensieve en verhoogt de moeilijkheid van de procedure, vooral voor onervaren laboratoriumpersoneel.
De bloed - hersen-barrière is zeer bewaard onder organismen met een welomschreven CNS-71. Modelleren van de menselijk bloed - hersenbarrière is moeilijk omdat er is complexe neurovasculaire koppeling tussen de cellen van de neurovasculaire eenheid. Een volwassen menselijk brein is geraamd op gemiddeld ongeveer 86 miljard neuronen en men denkt dat bijna elk neuron een eigen capillair in de omgeving heeft om juiste voeding met zuurstof en voedingsstoffen72,73. Capillaire endotheliale cellen vormen het grootste oppervlak van de blood-brain-interface (12-18 m2 voor een gezonde volwassen mens). Strakke kruispunten vormen een belemmering voor een breed scala aan pharmacotherapeutics door het blokkeren van paracellular verspreiding van opgeloste stoffen. Bovendien talrijke studies beschrijven barrière dysfunctie in neurodegeneratieve aandoeningen, bijv., de ziekte van Alzheimer74lijn75, epilepsie38,76, multiple sclerose77, en traumatische hersenen letsel28,78. Het is dus absoluut noodzakelijk om vast te stellen modellen die nauw vertegenwoordigen de menselijk bloed - hersenbarrière en zorgen voor een beter begrip van de barrièrefunctie in gezondheid en ziekte.
Talrijke in vitro cel cultuur modellen van de bloed - hersenbarrière bestaan; Zie 41,49,51,69,79,80voor expert reviews over het onderwerp. Kort, zowel vers geïsoleerd capillaire endothelial hersencellen voor primaire cultuur en vereeuwigd hersenen capillaire endothelial cellijnen zijn beschikbaar. Primaire culturen van cerebrale microvessel endotheliale cellen worden meestal gebruikt van muis, rat, varken en koe. Primaire celculturen zijn echter arbeidsintensief omdat cellen vers geïsoleerd moeten. Vereeuwigd hersenen capillaire endothelial cellijnen zijn verkrijgbaar bij muis, rat en mens en minder arbeidsintensief zijn omdat ze voor langere termijn gebruik kunnen worden gepasseerd. Zelfs vereeuwigd cellijnen hebben echter een limiet op hoe vaak zij voor losing hun endothelial kenmerken kunnen worden gepasseerd. Zowel primaire cellen evenals vereeuwigd cellen lijnen worden vaak gekweekt op platen voor het model van de hersenen capillaire endotheel en meten het barrière-permeabiliteit en drug-vervoer over de cel enkelgelaagde, waardoor het nabootsen van bloed-naar-brain vervoer41 8281, ,. De media van de cultuur in deze modellen kunnen ook worden gewijzigd of aangevuld met astrocyten, pericytes of andere fysiologisch relevante factoren zoals8483,kamp41,.
Het voordeel van vereeuwigd cellijnen is hun relatief gemakkelijke toegang en beschikbaarheid. Terwijl gekweekte endotheliale cellen samenvloeiing bereiken kunnen, ze verliezen endothelial Celeigenschappen aangezien zij side-by-side groeien in een enkelgelaagde. Bijvoorbeeld, weergeven gekweekte hCMECs verminderde expressie van vervoerders zoals P-gp, strakke junction eiwitten en display variabele permeabiliteit xenobiotica41. Figuur 4 toont een westelijke vlek voor P-gp eiwituitdrukking in hCMEC/D3 cellen ten opzichte van vers geïsoleerde menselijke haarvaten. Ondanks een 10-fold lager bedrag van totaal eiwit is het signaal voor P-gp sterker in geïsoleerde menselijke haarvaten in vergelijking met hCMEC/D3 cellen. Dit geeft aan dat hCMEC/D3 cellen een aanzienlijke hoeveelheid P-gp eiwituitdrukking in cultuur verloren. Bovendien verschillen in cultuur, media, milieu en apparatuur invloed hebben op belangrijke maatregelen van barrière integriteit, dat wil zeggen, TEER metingen in Transwell plaat testen. Sommige van deze problemen kunnen worden opgelost door gebruik te maken van de geïsoleerde hersenen capillaire model dat nauwer het menselijke bloed - hersen barrière in vivo vertegenwoordigt.
Geïsoleerde hersenen haarvaten hebben ingezet voor een breed scala van onderzoeken, met inbegrip van genomics, proteomics, functionele proteomics en cellomics studies (Figuur 5). Daarnaast bestaan vele technieken en methoden voor het analyseren van geïsoleerde hersenen haarvaten binnen elk van deze velden. Met name kunnen de experimentele technieken die is afgebeeld in Figuur 5 worden gebruikt op de haarvaten van de hersenen van een aantal bronnen, met inbegrip van menselijke, runderen, knaagdieren en varkens weefsel, die translationeel onderzoek vergemakkelijken kan werd geïsoleerd. Bijvoorbeeld, Li et al. 85 studeerde de genomica van de bloed - hersenbarrière onderdrukking subtractieve hybridisatie via zuiveren van mRNA geïsoleerd uit de rat hersenen haarvaten. Bovendien, Ott et al. 86 gebruikt RT-PCR en qRT-PCR te bestuderen van de regulering van de P-gp door PXR. Veel proteomic studies gebruiken Western blotting3, Dot vlek analyse87, eenvoudige Western assays3,38, ELISA88,89, immunoprecipitation3, en immunokleuring3,90,91. Te onderscheiden van de vervoerder de hersenen endotheel, McCaffrey et al. mensenhandel 92 gebruikt subcellular fractionering van geïsoleerde hersenen haarvaten. Sánchez del Pino et al. 93gebruikt geïsoleerde bovine endothelial membraan blaasjes te onderscheiden van vervoerder locatie en vervoer richting over de bloed - hersenbarrière. In andere studies van proteomic, onderzoekers maakten gebruik van vloeibare chromatografie en de Spectrometrie van de massa van de tandem te kwantificeren vervoerder eiwitten94,95,96. Functionele proteomic studies hebben gebruikt vervoerder en lekkage testen2,,38. Hartz et al. 2 gebruikt zymography om te bepalen van de enzymactiviteit in geïsoleerde hersenen haarvaten. Daarnaast heeft enorme cellomic onderzoek met behulp van celkweek talrijke endothelial cellijnen en modellen van de bloed - hersenbarrière82,83,84gegenereerd. Met deze modellen zijn gemeenschappelijke testen gebruikt migratie testen97,98, levensvatbaarheid en toxiciteit assays99en angiogenese assays98.
Geïsoleerde hersenen haarvaten zorgen voor nauwkeurige karakterisering van eiwit expressie en activiteit en beschrijving van signalering van trajecten op de bloed - hersenbarrière. Dit is te wijten, gedeeltelijk aan de capillaire inhoud van de hersenen, die slechts ongeveer 1% (v/v is). Dus, met behulp van hele hersenen homogenaat of hersenen segmenten als een vervanging voor gezuiverde capillaire endotheliale cellen zal hoogstwaarschijnlijk resulteren in een slechte signal-to-noise verhouding24. Daarnaast zijn hersenen haarvaten na isolatie, levensvatbaar is voor ten minste 6 uur (niet-gepubliceerde gegevens van muis en rat), waarmee de studies te onderscheiden van specifieke signaalroutes. Het is aanbevolen om een controlegroep van de dezelfde voorbereiding omvatten.
Vertegenwoordiger en translationeel modellen van de bloed - hersen barrière, zoals het geïsoleerde capillaire model besproken in dit verslag zijn nodig om te studeren barrièrefunctie in gezondheid en ziekte. Hier presenteren we een protocol voor geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten op een goede opbrengst en de hoge kwaliteit die als een ex vivo -model van de bloed - hersenbarrière dienen kan. Geïsoleerde haarvaten behouden hun oorspronkelijke structuur en functie, waarmee ze te gebruiken voor een aantal na isolatie moleculaire, biochemische, en fysiologische tests. Zorg moet worden genomen wanneer het behandeling van menselijk weefsel monsters worden bij voorkeur in een BSL 2 of hogere instelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken en erkennen van Dr. Peter Nelson en Sonya Anderson in de UK-ADC hersenen weefselbank voor het verstrekken van alle menselijke hersenen weefselmonsters (NIH grant nummer: P30 AG028383 van het National Institute on Aging). Wij danken Matt Hazzard en Tom Dolan, Information Technology Services, academische technologie en de betrokkenheid van de faculteit, Universiteit van Kentucky voor grafische bijstand. Dit project werd ondersteund door subsidie nummer 1R01NS079507 van het nationale Instituut van Neurological Disorders and Stroke (naar B.B.) en nummer 1R01AG039621 van de subsidie van het National Institute on Aging (te A.M.S.H.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Institute of Neurological Disorders en lijn of het nationale Instituut op veroudering. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Personal Protective Equipment (PPE) | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| Disposable Protective Labcoats | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended |
| Face Shield, disposable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended |
| Safety Materials | |||
| Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | to cover working areas |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | for used scalpels |
| Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 °C Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH Meter | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Dissecting Microscope | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | used to remove meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogenizer | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | used to freeze the tissue? |
| Voyager Pro Analytical Balance | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | used to check isolated capillaries | |
| Tools and Glassware | |||
| Finnpipette II Pipette 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | wash capillaries off filter |
| Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | resuspend pellet in BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | to mince brain tissue |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | to cover beaker and volumetric flask |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | to wash capillaries off filter |
| 60 mL syringe with Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | used with connector ring to filter capillaries |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | used for mincing |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | used to remove meninges |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 mL volume, clearance: 150-230 μm |
| Dounce Homogenizer | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volume, clearance: 80-130 μm |
| Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left |
| pluriStrainers (pore size: 30 µm) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| Connector Ring | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | reuse multiple time |
| 1 L Volumetric Flask | for preparation of Isolation Buffer | ||
| 1 L Beaker | for preparation of 1% BSA | ||
| Stir Bar | for preparation of 1% BSA and Ficoll® | ||
| Schott Bottle (60 mL) | for preparation of Ficoll® | ||
| Ice Bucket | to keep everything cold | ||
| 100 mm Petri dish | for mincing of brain tissue | ||
| Tissue Culture Cell Scraper | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | to remove supernatant after centrifugation |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use. |
| DPBS with Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - part of the Isolation Buffer |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use. |
| Glucose (D-(+) Dextrose) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM |
| Sodium Hydroxide Standard Solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | to adjust pH of the DPBS |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentration: 1 mM |
References
- Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
- Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
- Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
- Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
- van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
- Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
- Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
- Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
- Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
- Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
- Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
- Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
- Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
- Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
- Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
- Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
- Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
- Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
- Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
- Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
- Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
- Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
- Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
- Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
- van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
- Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
- Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
- Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
- Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
- Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
- Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
- Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
- Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
- Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
- Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
- Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
- Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
- Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
- Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
- Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
- Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
- Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
- Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
- Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
- Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
- Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
- Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
- Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
- Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
- Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
- Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
- Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
- Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
- Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
- Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
- Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
- Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
- Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
- Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
- McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
- Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
- Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
- Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
- Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
- Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
- Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).
