Summary
Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.
Abstract
Verständnis-Blut - Hirn-Schranke-Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, die halten das Versprechen Gehirn Drug-Delivery, Gehirn-Schutz zu verbessern, und Gehirn zu behandeln Störungen. Studium der menschlichen Blut - Hirn-Schranke-Funktion ist jedoch schwierig. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für geeignete Modelle. In diesem Zusammenhang vertreten Gehirn Kapillaren isoliert aus menschlichen Hirngewebe ein einzigartiges Werkzeug, Barriere-Funktion als in der Nähe der menschlichen in-Vivo -Situation wie möglich zu studieren. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu eine hohe Ausbeute und mit gleichbleibender Qualität und Reinheit zu isolieren. Kapillaren sind aus frischen menschlichen Gehirngewebe mit mechanischer Homogenisierung, Dichtegradienten Zentrifugation und Filtrierung isoliert. Nach der Isolierung können die menschliche Gehirn-Kapillaren für verschiedene Anwendungen einschließlich Leckage-Assays, live Cell Imaging und Immune basierende Assays verwendet werden, Protein-Expression und Funktion, Enzym-Aktivität oder intrazellulären Signalisierung zu studieren. Isolierte Gehirn-Kapillaren sind ein einzigartiges Modell die Verordnung der menschlichen Blut - Hirn-Schranke Funktion aufzuklären. Dieses Modell bieten Einblicke in die Pathogenese der zentralen Nervensystems (ZNS), die die Entwicklung von Therapiestrategien zur Behandlung von CNS Störungen helfen.
Introduction
Die Blut - Hirn-Schranke ist eine streng kontrollierte Schnittstelle zwischen Blut und Gehirn, der bestimmt, was geht in und aus dem Gehirn heraus kommt. Anatomisch, Endothelzellen der Blut - Hirn-Schranke zu komponieren und bildet eine komplexe, durchgehende kapillarnetzes. Physiologisch, versorgt dieses engmaschiges Netz das Gehirn mit Sauerstoff und Nährstoffen während gleichzeitig Entsorgung von Kohlendioxid und Abfallprodukte des Stoffwechsels. Wichtig ist, unterstützt Beweise, dass die Änderungen an der Schranke zu zahlreichen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Epilepsie und Schlaganfall1,2,3,4,5 beitragen , 6 , 7. Gehirn endotheliale Zellen auch als ein Hindernis für die Behandlung dienen durch die Blockierung der Droge Aufnahme ins Gehirn, zB., Chemotherapie von Glioblastoma Multiforme nach Tumor Resektion8,9, 10. In diesem Zusammenhang isolierte Gehirn-Kapillaren stellen eine einzigartige ex Vivo Blut - Hirn-Schranke Modell, das Barriere Eigenschaften in-vivo, ähnelt die für das Studium der Barriere-Funktion und Dysfunktion im Gesundheitswesen ermöglicht und Krankheit. In diesem Artikel bieten wir ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren vom menschlichen Gehirn auf eine gleichbleibend hohe Qualität der Kapillare zu isolieren und Ertrag um die Blut - Hirn-Schranke zu studieren.
Im Jahr 1969 Siakotos Et Al. 11 waren die ersten, die Isolation der Gehirn-Kapillaren aus Rind- und menschlichen Hirngewebe mit Steigung Zentrifugierung und Glas Bead Spalte dichtetrennung zu melden. Später, Goldstein Et al. 12 verbessert diese Methode, indem mehrere filtrationsschritte verringern die Menge des Gewebes erforderlich, Gehirn-Kapillaren von Ratten, unter Beibehaltung der Stoffwechselaktivität der Glukose Transport isoliert zu studieren. Seitdem optimiert Forscher die Kapillare Isolierung Verfahren mehrfach, Verbesserung der Methode und des Gehirns Kapillaren Modells mit jeder Iteration13,14,15. Z. B. Pardridge Et Al. 16 bovine Kapillaren mit enzymatischen Verdauung anstelle mechanischer Homogenisierung isoliert, und dann anschließend eine Kapillare Suspension durch ein Filtersieb 210 µm und eine Glassäule Wulst. Diese Änderungen verbessert den Trypan blau Ausgrenzung Fleck isolierte Gehirn-Kapillaren und so erhöhte endotheliale Zellviabilität. Anfang der 1990er Jahre Dallaire Et Al. 17 isoliert Rindern und Ratte Kapillaren, die waren frei von neuronalen Kontamination und metabolische Aktivität der γ-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTase) und alkalische Phosphatase gepflegt. Im Jahr 2000 Miller Et Al. 18, verwendet isolierten Ratten und Schweinen Gehirn Kapillaren in Kombination mit konfokalen Mikroskopie um zu zeigen, die Anhäufung von Transport-Substrate in das Lumen der Kapillaren. Anschließend haben unser Labor hat weiterhin das Gehirn Kapillare Isolierung Verfahren zu optimieren und wir Transport Tests ermitteln, P-Glykoprotein (P-Gp)19,20,21, Brustkrebs Widerstand Protein (BCRP)22,23und Multi-Drug Resistance Protein 2 (Mrp2)24 Transportaktivität. Im Jahr 2004 veröffentlichten wir zwei Berichte wo wir isolierte Ratte Gehirn Kapillaren verwendet, um verschiedene Signalwege zu untersuchen. In Hartz Et Al. 21, fanden wir, dass das Peptid Endothelin-1 schnell und reversibel P-Gp Transportfunktion im Gehirn Kapillaren durch Einwirkung durch Endothelin-Rezeptor B (ETB) Rezeptor, Stickoxid-Synthase (NOS) und Proteinkinase C (PKC) reduziert. In Bauer Et al. 19, haben wir bewiesen, Ausdruck des nuklearen Rezeptoren Pregnane X-Rezeptors (PXR) und zeigte PXR-Modulation des P-Gp Ausdruck und Transport-Funktion im Gehirn-Kapillaren. In Experimenten mit transgenen Mäusen, humanisierter PXR wir diese Linie der Forschung erweitert und zeigte in Vivo Verschärfung der Barriere von heraufregulierende P-Gp durch hPXR Aktivierung25. Im Jahr 2010 Hartz Et Al. 26 verwendet diesen Ansatz zur Wiederherstellung von P-Gp-Protein-Expression und Aktivität in transgenen menschlichen Amyloid-Precursor-Protein (hAPP)-Mäuse, die hAPP overexpress zu transportieren. Darüber hinaus reduziert Wiederherstellung des P-Gp in hAPP Mäuse Beta-Amyloid (Aβ)40und Aβ-42-Gehirn-Spiegel.
Neben dem Studium Signalwege, lässt die isolierte Gehirn-Kapillaren Veränderungen in Kapillare Permeabilität bestimmen, welche wir als Kapillare durchsickern bezeichnen. Insbesondere dient der Texas Red-Leckage-Test zur Bewertung Austreten von der Fluoreszenzfarbstoff Texas Red aus der Kapillare Lumen über Zeit und diese Daten werden verwendet, um die Leckraten zu analysieren. Verstärkte Kapillare Leckraten im Vergleich zu denen von Kontrolle Kapillaren anzugeben Änderungen in die körperliche Integrität der Blut - Hirn-Schranke2. Dies ist wertvoll, denn es zahlreiche Krankheitszustände Barriere Störung, z.B.zugeordnet gibt., Epilepsie, Multiple Sklerose, Alzheimer-Krankheit und Schädel-Hirn Verletzungen27,28,29, 30. Andere Gruppen haben auch isolierte Kapillaren um Signalwege zu erkennen, die Protein-Expression und Transportaktivität Proteine31,32,33,34regulieren genutzt, 35,36,37. Schließlich haben wir diese Methode für die Isolierung der Kapillaren des menschlichen Gehirns zu optimieren und, vor kurzem, wir zeigten erhöhte P-Gp Ausdruck im menschlichen Blut - Hirn-Schranke bei Patienten mit Epilepsie im Vergleich zu anfallsfrei Kontrolle38 . Zusammengenommen zeigen diese Entwicklungen, dass isolierte Gehirn-Kapillaren als ein vielseitiges Modell Barrierefunktion studieren dienen können.
Verschiedenen in vivo, ex-Vivound in Vitro Blut - Hirn-Schranke-Modelle wurden in Grundlagenforschung und der industriellen Drogentest, vor allem mit dem Ziel der Drug-Delivery zum Gehirn39,40,41 Tests verwendet ,42,43,44. Neben isolierten ex Vivo Gehirn-Kapillaren sind aktuelle Modelle der Blut - Hirn-Schranke in Silico Modelle, in Vitro Zellkultur von isolierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen oder immortalisierte Zelllinien aus verschiedenen Arten, in-vitro- Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC), die in Kapillare endothelial Zellen des Gehirns und mikrofluidischen Modelle auf einem Chip zu differenzieren.
In Silico Modelle sind am häufigsten in der Medikamentenentwicklung verwendet, für die Auswahl von Arzneimittelkandidaten anhand der prognostizierten Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) Eigenschaften. Methoden wie quantitative Struktur-Eigenschaft Beziehung (QSPR) Modelle und quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (QSAR) Modelle sind beliebte Methoden im Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken, Gehirn Eindringen von Wirkstoffkandidaten vorauszusagen 45 , 46. diese Modelle eignen sich zur Bildschirm-Moleküle für Barriereeigenschaften eindringen.
Betz Et al. 47 Monolagen der kultivierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen als ein in-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modellsystem etabliert. In-vitro- Kultur zellmodelle mit frischem Gewebe oder verewigt endotheliale Zell-Linien wie menschlichen zerebralen kapilläre Endothelzellen (hCMECs) können ein weiteres Hochdurchsatz-Screening-Tool für Gehirn eindringen oder mechanistische Studien sein. Jedoch Gehirn Kapillare endothelial Zelle Kultur Modelle fehlen die physiologischen Scherspannung des Blutflusses in der Kapillare Lumen, sind in ihrer gesamten biologischen Komplexität begrenzt und Veränderungen in Ausdruck und Lokalisierung der Hindernis-Komponenten wie tight Junction Proteinen Kanäle Oberfläche Rezeptoren, Transporter, Enzyme und Ionen-48,49,50. Umgekehrt, endotheliale Monolagen abgeleitet hPSCs, niedrigen Saccharose Durchlässigkeit im Vergleich zu hCMEC/D3 Kulturen und enthalten polarisierte Ausdruck einige Blut - Hirn-Schranke Transporter, Adhäsionsmoleküle und tight Junctions51, 52. allerdings diese Zellen unterliegen ebenfalls ändern Eigenschaften in der Kultur, und das System muss für die Reprise des in Vivo Barriere Eigenschaften52validiert werden.
Neuere Trends in der Blut - Hirn-Schranke Forschung umfassen unter Verwendung 3D Zellkultur Systeme schaffen künstliche Kapillaren, mit der Orgel-on-Chip-Technologie um mikrofluidischen Geräte verursachen, oder unter Verwendung der Hohlfaser-Technologie53, 54 , 55. künstliche Kapillaren haben jedoch deutlich größere Durchmesser (100 – 200 µm) als Gehirn-Kapillaren (3 – 7 µm). Daher ähneln die Schere Kräfte in Vitro nicht vollständig die in-Vivo -Situation. Dies richtet sich in "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrofluidischen Geräten, wo künstliche Membranen Form "Blut" und "Gehirn" Fächern und Flüssigkeiten durch diese Geräte erzeugen mikrofluidischen Scherkräfte gepumpt werden. In ähnlicher Weise wurden ko-Kulturen von Endothelzellen in verschiedenen Kombinationen mit Astrozyten und vaskulären glatten Muskelzellen auch mit der Hohlfaser-Technologie zur rheologischen Parameter unter in Vivo Bedingungen56 neu , 57 , 58. es ist jedoch unklar, wie gut dieses Modell andere Eigenschaften die Blut - Hirn-Schranke, wie Transport, Stoffwechsel, Signalisierung und andere reflektiert. Diese künstliche Kapillare und Chip-Modelle eignen sich für Hochdurchsatz-Screening von Drogen, aber die Zellen zur Erzeugung von diesen Modells vorbehalten auch während der Kultur.
Gefrorene und festen Gehirnscheiben oder primäre Gehirn, die Kapillare endothelial Zellkulturen sind weitere Modelle, dieStudie der menschlichen Microvasculature5,59,60,61genutzt werden können. Zum Beispiel Immunohistochemistry von festen Hirngewebe dient zur Bestimmung von Protein-Lokalisierung und Ausdruck in gesunden im Vergleich zu erkranktem Gewebe.
Neben Gewebe Scheiben und die in-vitro- Modelle können oben beschrieben, frisch isolierte Gehirn-Kapillaren genutzt werden, um die Funktion der Blut - Hirn-Schranke zu untersuchen. Einschränkungen dieses isolierte Kapillare Modells umfassen die Schwierigkeit zu frischem menschlichen Hirngewebe, Abwesenheit von Astrozyten und Neuronen und eine relativ aufwändige Isolierung Prozess. Ein Vorteil der Kapillare isolierte Gehirn-Modells ist, dass dieses Modell die in-Vivo -Situation ähnelt und daher verwendet werden, kann um die Barriere-Funktion und Dysfunktion zu charakterisieren. Wichtig ist, kann auch verwendet werden, zu erkennen, Signalisierung Mechanismen, die mit einer Vielzahl von Tests und Verfahren der molekularen3,19,62,63.
Unser Labor hat Zugang zu beiden frischen und gefrorenen menschlichen Hirngewebe durch die Sanders-Brown-Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. In diesem Zusammenhang Autopsien folgen ein Standardprotokoll, Gehirne erhalten in < 4 h und alle Verfahren entsprechen den Best Practices von NIH Ibbl65. Angesichts dieser einzigartigen Zugang zum menschlichen Hirngewebe, wir eingerichtet und optimiert ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu isolieren, der eine hohe Ausbeute an intakten, lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren führt. Zwei gemeinsame Endpunkte von Interesse sind die Protein-Expression und Aktivität zu bestimmen. In diesem Zusammenhang haben wir u.a. verschiedene Assays etabliert, die mit isolierte Gehirn-Kapillaren verwendet werden können, um Protein-Expression und Aktivität zu studieren. Diese Tests umfassen, Western blotting, einfache Western-Assay, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Zymography, Transport-Aktivität-Assays, und Kapillare durchsickern Assays. Diese Tests erlauben Forschern Änderungen in Barriere-Funktion im menschlichen pathologischen Bedingungen zu studieren, bestimmen Signalwege, die Protein-Expression und Aktivität zu regieren und ermitteln pharmakologische Ziele für die Behandlung von Blut - Hirn-Schranke verbunden Krankheiten.
Frisch zusammen genommen können isolierte Gehirn-Kapillaren als stabile und reproduzierbare Modell der Blut - Hirn-Schranke dienen. Dieses Modell ist vor allem, mit vielen verschiedenen Assays zu bestimmen, eine breite Palette von Endgeräten, Barrierefunktion zu studieren kombinierbar.
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Protocol
Die nachstehenden Informationen basiert auf aktuellen Sicherheits- und Regulierungsstandards an der University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Als Vorsichtsmaßnahme beziehen sich auf die Institution biologische Sicherheitsprogramm und den aktuellsten Vorschriften und Empfehlungen vor der Arbeit mit menschlichem Gewebe.
Achtung: Menschliches Gewebe kann eine Quelle von Blut übertragene Krankheitserreger, einschließlich Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B-Virus (HBV) und Hepatitis C-Virus (HCV). Arbeiten mit menschlichem Gewebe besteht die Gefahr einer Infektion durch Blut übertragbaren Krankheitserregern. Daher sind bestimmte regulatorische und Sicherheitserwägungen unerlässlich, bei der Arbeit mit menschlichem Gewebe, Laborpersonal zu schützen. Arbeiten mit menschlichem Gewebe in den USA erfordert Biosafety Level 2 Labor und Sicherheitsvorkehrungen sowie Ausbildung im Einklang mit NIH Abschnitt IV-B-7, OSHA Act von 1970-Klausel 5(a)(1) und des Benutzers institutionelle biologische Sicherheitsprogramm. Im Allgemeinen muss institutionelle Biosafety Committee und/oder Institutional Review Board Genehmigung eingeholt werden, vor der Durchführung jeder Forschung am menschlichen Material (Gewebe, Körperflüssigkeiten). Das Training ist für alle Mitarbeiter mit menschlichen Materialien erforderlich und enthält grundlegende Labor Sicherheitstraining, z.B., chemische Hygiene und Sicherheit im Labor, sowie spezifische Ausbildung für biologische Sicherheit, gefährliche Abfälle und Mensch Blut übertragbaren Krankheitserregern. Alle Mitarbeiter arbeiten mit menschlichen Materialien sind dringend empfohlen, Hepatitis B Impfungen, vor der Arbeit mit menschlichen Materialien zu erhalten. Mitarbeiter sind verpflichtet, bestimmten persönlichen Schutzausrüstung bei der Arbeit mit menschlichen Materialien, z.B.tragen., einen gefesselten Laborkittel und ein Gesicht zu schützen, und tragen Sie Handschuhe zu allen Zeiten. Alle Arbeiten werden in eine biologische Kabinett (Klasse 2) ausgeführt. Alle Geräte, der in Kontakt mit menschlichen Materialien und Abfällen aus menschlichen Materialien kommt ist entsprechend behandelt, um Verschmutzung und/oder Infektion des Personals zu verhindern. Alle Geräte und Oberflächen werden mit 10 % Bleichmittel und 75 % Ethanol jedes Verfahrens unter Beteiligung menschlichen Materialien gereinigt. Ein Überlauf mit menschlichen Materialien muss sofort bereinigt werden. Glas ist nach jedem Gebrauch autoklaviert. Abfälle, einschließlich der fixierten menschliches Gewebe, ist in einer beschrifteten Biohazard Auffangbeutel gesammelt und autoklaviert. Sharps werden in eine Punktion und auslaufsicheren Behälter beschriftet als biogefährlichen gesammelt. Alle Abfälle aus menschlichen Materialien ist die Institution biologische Sicherheitsvorschriften entsprechend entsorgt.
Hinweis: Unser Labor erhält frische frontalen Kortex Proben von verstorbenen Personen durch den Sanders-Brown-Center on Aging (IRB #B15-2602-M). Einschlusskriterien sind: Einschreibung in der UK-ADC längs Autopsie Kohortenstudie und ein Post-Mortem-Intervall (PMI) ≤4 h64. Autopsien folgen ein Standardprotokoll und alle Verfahren entsprechen den NIH Ibbl Best Practice-Richtlinien65. Eine kurze PMI von weniger als 4 h ist von höchster Bedeutung für Kapillare Tragfähigkeit nach Isolierung. Frisches und gefrorenes Gewebe kann verwendet werden. Wenn einfrieren notwendig ist, frisch gewonnenen menschlichen Hirngewebe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei-80 ° c gelagert Frisch oder aufgetaut Gewebe sollte in Isolation Puffer (siehe unten) gespeichert und schnell verarbeitet werden. Wir finden, dass 10 g frisches menschliches Gewebe Erträge etwa 100 mg der Gehirn-Kapillaren (Frischgewicht).
1. setup
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Puffer-Vorbereitung
Hinweis: Die Lautstärke des Puffers benötigt richtet sich nach der Menge des Gewebes. Alle Puffer Volumes in das folgende Protokoll basieren auf 10 g der menschlichen Hirnrinde Hirngewebe.- L-Isolation-Puffer: Verwenden Sie 1,5 L Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) und ergänzen mit 5 mM D-Glukose (1,35 g ) und 1 mM Natrium Pyruvat (0,165 g). Nach dem Hinzufügen der Glukose und Pyruvat, passen Sie sich an pH 7.4 mit Natriumhydroxid. Abkühlen lassen und den Puffer um 4 ° C vor der Verwendung zu speichern.
- Rinderserumalbumin (BSA): Fügen Sie 10 g BSA Pulver 1 L Puffer, Isolierung um eine BSA-Endkonzentration von 1 hinzu %. Rühren Sie langsam um Luftblasen zu vermeiden, auf pH 7.4 einstellen und über Nacht bei 4 ° C lagern. Unmittelbar vor Gebrauch rühren Sie sanft; vermeiden Sie Luftblasen zur Vermeidung von Albumin Denaturierung.
- Dichte-Gradienten-Medium: wiegen 18 g Dichte Gradienten Mediums in eine Flasche und fügen Sie eine magnetische Stir Bar. Fügen Sie 60 mL Isolierung Puffer und 5 min lang kräftig schütteln Sie, bis alle Pulver ausgesetzt ist. Laden über Nacht bei 4 ° C, Dichte Gradienten Mittel-und auflösen lassen. Für 10 min vor Gebrauch umrühren.
- Speichern Sie alle Puffer bei 4 ° C; halten Sie alle Werkzeuge und Puffer auf dem Eis während des gesamten Isolierung-Verfahrens. Umrühren Sie alle Puffer vor Gebrauch.
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Versuchsaufbau
- Montieren Sie den Stößel der Potter-Elvehjem Gewebe Mühle auf der elektronischen Overhead Rührer. Legen Sie die Potter-Elvehjem-Gewebe-Mühle und Dounce-Homogenisator mit Stößel auf Eis unter der Haube. Bereiten Sie eine 300 µm Filternetz (5 x 5 cm2) Falten Sie es auf einem Kegel und einlegen Sie und verbinden Sie es mit einem 50 mL Falcon-Röhrchen mit Klebeband (Abbildung 1A).
- Miteinander verbundene Ringe und Zelle Stamm Filter (Porengröße: 30 µm) auf 50 mL Falcon Röhren. Bereiten Sie biogefährlichen Müllbeutel. Legen Sie alle benötigten Geräte in der Biosicherheit Schrank (siehe Tabelle der Materialien).
2. Gehirn Probenvorbereitung
Hinweis: Abbildung 1A zeigt das Workflow-Diagramm der unten beschriebenen Verfahren die gesamte Isolierung. Menschliche Gehirngewebe kann von jedem Teil des Kortex stammen und kann verwendet werden, frisch oder gefroren. Gefrorene Hirngewebe kann bei Raumtemperatur (kein Puffer; ~ 30 min für 10 g) aufgetaut werden. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, sollte der gleichen Hirnregion für jedes Experiment das Hirngewebe eingeholt werden. Dieses Protokoll ist optimiert für frisch (PMI < 4 h) menschlichen Hirnrinde, die nicht fixiert wurde.
- Vorbereitung der menschlichen Hirngewebe: das Gewicht des Hirngewebes zu dokumentieren. Alle Zahlen in das folgende Protokoll eignen sich für 10 g frische menschlichen Hirngewebe. Platzieren Sie das Hirngewebe in einem 100 mm Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute mit der Pinzette. Verwenden Sie ein Skalpell zum Abschneiden der weißen Substanz.
- Zerkleinerung von menschlichen Hirngewebe: sorgfältig zerschnitten das Hirngewebe und zerkleinere es mit einem Skalpell. Hackfleisch für ca. 5 min (2 – 3 mm Stück). Übertragen Sie das Gehirngewebe zum Potter-Elvehjem Gewebe Mahlwerk. 30 mL Isolierung Puffer hinzugeben.
Hinweis: Die Hackfleisch / Gewebe-Stücke sind schwer zu sehen, da das Gehirngewebe in Brei durch den affektierten Prozess verwandelt.
3. Homogenisierung
- Potter-Elvehjem Gewebe Schleifer (Abstand: 150-230 µm): jede Probe mit 100 Schlägen Homogenisator Geschwindigkeiten von 50 u/min zu homogenisieren. Dokumentieren Sie der Zeit, jede 25 Schlägen und den gesamten Zeitaufwand für 100 Hüben. Siehe Tabelle 1 für eine vorgeschlagene Homogenisierung Protokoll; die Gesamtzeit für Homogenisieren 10 g des menschlichen frontalen Kortex ist ca. 22 Minuten. Rühren Sie nicht in Luft, um Luftblasen zu verhindern.
- Dounce-Homogenisator (Abstand: 80 – 130 µm): Das Homogenat in einem Dounce-Homogenisator auf Eis zu übertragen. Das Fahrwerk mit 20 Schlägen (~ 6 s/Hub, insgesamt ~ 2 min) zu homogenisieren. Vermeiden Sie Luftblasen.
(4) Zentrifugieren
- Verteilen Sie das Gehirn Homogenat ebenso in vier 50 mL Zentrifugation Röhren und dokumentieren das Gesamtvolumen der Homogenat. 50 mL Dichte Gradienten Puffer in die Zentrifugation Röhren (12,5 mL pro Röhrchen) zu verteilen. Verwenden Sie 10 mL Isolierung Puffer spülen Sie den Stößel und Homogenisator und verteilen in die vier Zentrifugation Röhren (~2.5 mL pro Röhre).
- Schließen Sie dicht die Zentrifuge Rohre mit Kappen. Mischen Sie Homogenat, Dichte-Gradienten-Medium und Puffer durch die Rohre kräftig schütteln. Zentrifugieren Sie bei 5.800 X g für 15 min bei 4 ° C (Rotor mit festen Winkeln); Wählen Sie eine mittlere Verzögerung Geschwindigkeit zu halten das Pellet am Rohr befestigt. Den überstand verwerfen und jedes Pellet in 2 mL 1 % BSA aufzuwirbeln.
(5) filtration
Hinweis: Um die Kapillaren von roten Blutkörperchen und andere zellenrückstand zu trennen, sind mehrere filtrationsschritte notwendig.
- 300 µm Netz: nach Re Aussetzung der Pellet, filtern die Aussetzung durch den 300 µm-Sieb. Kapillaren sind durch das Gitter gefiltert, während größere Schiffe und größeren Gehirn Ablagerungen auf dem Netz bleiben. Waschen Sie sorgfältig das Netz mit bis zu 50 mL 1 % BSA. Entsorgen Sie das Netz.
Hinweis: Diese Filtrationsschritt löscht die Kapillare Aussetzung von jedem größeren Schiffe oder Teile des Gehirns Schutt. -
30 µM Zelle Stamm filter
Hinweis: Diese Filtrationsschritt trennt Kapillaren von roten Blutkörperchen und andere Gehirn Ablagerungen.- Verteilen Sie die Kapillare Filtrat aus Schritt 6.1 über die fünf 30 µm Zelle Stamm Filter (ca. 10 mL der Kapillare Filtrat pro Zelle Stamm Filter). Kapillaren sind durch diesen Filter zurückgehalten, während rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und kleinen Gehirn Schmutz durch den Filter passieren und sind in das Filtrat gesammelt.
- Waschen Sie jeden Filter mit 25 mL 1 % BSA. Danach alle Filtrate übergießen der sechsten Filter, um den Ertrag zu steigern. Waschen Sie jeden Filter mit 50 mL 1 % BSA; halten Sie die Zelle Stamm Filter mit den Kapillaren und entsorgen Sie das Filtrat.
(6) Kapillare Sammlung
- Drehen Sie den Filter um und waschen Sie die Kapillaren mit 50 mL 1 % BSA für jeden Filter in 50 mL Röhrchen. Sanft andrücken mit einer 5 mL-Pipette pipettieren und bewegen Sie es über den Filter auf die Gehirn-Kapillaren abwaschen.
- Achten Sie darauf, alle Gehirn-Kapillaren, vor allem vom Rand des Filters abwaschen. Vermeiden Sie Luftblasen, denn dies die Filtration erschwert und die Wahrscheinlichkeit der Kapillare Verlust erhöht.
7. Waschen
- Nach dem Sammeln der Kapillaren, Zentrifugieren Sie alle Proben bei 1.500 X g für 3 min bei 4 ° C (schwingende Eimer Rotor). Entfernen Sie den überstand zu und wieder auszusetzen Sie das Pellet in etwa 3 mL Isolierung Puffer. Kombinieren Sie alle resuspendierte Pellets aus einer Probe in einem 15 mL konische Röhrchen und mit Isolierung Puffer zu füllen. Zentrifuge wieder bei 1.500 X g für 3 min bei 4 ° C und zwei Mal waschen.
- Dokumentieren Sie die Kapillare Reinheit mit einem Mikroskop (100 X Vergrößerung) und Kamera (Abbildung 1 b).
Hinweis: Der Gehirn Kapillare Ertrag von 10 g des menschlichen Hirngewebe ist in der Regel etwa 100 mg. Die isolierte Gehirn-Kapillaren können nun verwendet werden, für Experimente, verarbeitet (z. B.., lysate, Membran-Isolierung), oder Blitz eingefroren und bei-80 ° C im Cryoröhrchen für ein Minimum von 6 – 12 Monaten (vermeiden Sie mehrere Gefrier-tau-Zyklen) gelagert werden.
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Representative Results
Die Isolationen aus menschlichen Hirngewebe ergeben eine Suspension im menschlichen Gehirn Kapillaren (Abbildung 1 b) angereichert mit geringen Mengen an größere Schiffe, rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und einige zellenrückstand. Einige Kapillaren verzweigt sind, und in einigen, roten Blutkörperchen in den Kapillaren Lumen gefangen sind. Die typische Kapillare hat einen 3 – 7 µm Durchmesser und ist etwa 100-200 µm lang mit offenen Lumen; die meisten Kapillare enden werden reduziert. Mit der konfokalen Mikroskopie, offenbaren isolierte Gehirn-Kapillaren eine röhrenförmige, intakte Struktur und Morphologie. Abbildung 2A zeigt, dass ein Vertreter Licht Bild eines menschlichen Gehirns Kapillare mit einem angehängten Pericyte und ein rotes Blutkörperchen in das Lumen übertragen. Alle Feststellungen in Bezug auf Durchmesser, Größe und Morphologie sind im Einklang mit früheren Berichten über die Struktur der isolierte Gehirn-Kapillaren12,17,18. Das isolierte menschliche Gehirn Kapillare in Abbildung 2 b war Immunostained für P-Gp (grün) mit C219 als den primären Antikörper (1 µg/mL); Kerne wurden counterstained mit DAPI (1 µg/mL).
Abbildung 1: Flussdiagramm für die Kapillare Isolierung. (A) das Piktogramm zeigt wichtige Schritte des Verfahrens, Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichem Gewebe zu isolieren. (B) das Bild zeigt isolierte Gehirn-Kapillaren unter einem Lichtmikroskop direkt nach Isolierung (100 X Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: isolierte menschliche Gehirn Kapillare. (A) A Durchlicht Bild eines isolierten menschlichen Gehirns Kapillare. (B) die confocal Mikroskop-Bild zeigt eine isolierte menschliche Gehirn Kapillare Immunostained für P-Gp (grün; C219 1 µg/mL); Kerne wurden mit DAPI (blau; 1 µg/mL) counterstained. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Problembehandlung Dichte Zentrifugation. Das Piktogramm zeigt die Vorbereitung nach der Dichte-Gradienten-Zentrifugation. Es zeigt die Auswirkungen von zu viel und zu wenig Dichte-Gradienten-Medium und ihr Einfluß auf die Trennung und die daraus resultierende Kapillare Pellet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: P-Gp-Protein-Expression in isolierten menschlichen Gehirns Kapillaren. Der Western-Blot zeigt starke Bänder für P-Gp (1 µg/mL) in isolierten menschlichen Kapillaren im Vergleich zu hCMEC\D3 Zellen. Β-Aktin diente als ein Steuerelement laden (1 µg/µL). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Anwendungen für isolierte Gehirn-Kapillaren. Ein Überblick über die häufigsten Anwendungen für isolierte Gehirn-Kapillaren in der Literatur veröffentlicht. Isolierte Kapillaren werden seit: (1) Genomics85,86, 2) Proteomics3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) funktionelle Proteomik2,38und 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Striche | Zeit [min] |
| 1-25 | 7-7,5 |
| 26-50 | 5-5,5 |
| 51-75 | 5-5,5 |
| 76-100 | 5-5,5 |
| Gesamtzeit: | 22 – 24 min. |
Tabelle 1: Homogenisierung Protokoll. Die Homogenisierung Protokoll für das Potter-Elvehjem Gewebe Mahlwerk 10 g der menschlichen frontalen Kortex Homogenisierung Geschwindigkeiten von 50 u/min zu homogenisieren. Beachten Sie, dass die ersten mehrere Schläge zusätzliche Zeit erfordern, um das Hackfleisch / Gewebe zu homogenisieren. Nach dieser anfänglichen Homogenisierung ist jeder Strich 12 s Dauer (6 s zur Abwärtsbewegung, 6 s für Aufwärtsbewegung). So können nach der anfänglichen Homogenisierung 5 Schlägen in 1 min. oder 25 Schläge in 5 min erreicht werden.
| Problem | Mögliche Ursache | Lösung |
| Keine Kapillare Pellet | (1) falsche Ficoll-Konzentration | (1) stellen Sie Ficoll Konzentration |
| (2) falsche Zentrifugation Geschwindigkeit | (2) Zentrifugation Geschwindigkeit anpassen | |
| (3) falsche/Beschleunigung oder Verlangsamung Geschwindigkeit | (3) / Beschleunigung oder Verlangsamung Geschwindigkeit anpassen | |
| Geringe Kapillare Ausbeute | (1) Hirnhaut filtrationsschritte blockieren | (1) entfernen Sie alle Hirnhaut vor der filtration |
| (2) zu viele Kapillaren während Isolierung Verfahren verloren | (2) berechnen Sie Puffer Konzentration korrekt zu, spülen Sie Pipettenspitzen | |
| (3) Waschmaschine Kapillaren aus PluriStrainer Filter war nicht ausreichend | (3) umdrehen Sie Filter und überprüfen Sie sorgfältig für die Kapillaren (Verwendung Mikroskop) | |
| (4) überschüssige Luftblasen während resuspensions | (4) Pipette langsam um Luftblasen zu vermeiden | |
| Nicht lebensfähige Kapillaren | (1) erweiterte Post-Mortem-Intervall | (1) reduzieren Sie Intervall wenn möglich oder verwenden Sie Snap eingefroren Gehirne |
| (2) Using eingefroren Gewebe für die Isolierung | (2) verwenden Sie frische Gewebe | |
| (3) Zeit der Isolation Verfahren zu lang | (3) optimieren Sie workflow | |
| (4) Geräte/Puffer wurden nicht auf Eis bei der Isolierung gehalten. | (4) halten Sie Ausrüstung und Puffer auf Eis während der isolation |
Tabelle 2: Problembehandlung für allgemeine Probleme. Eine Liste der häufigsten Fehler und Probleme, die auftreten, während die Isolierung-Verfahren und wie sie gelöst werden können.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakt und lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren aus frischem Gewebe. In diesem Abschnitt besprechen wir im Detail Folgendes: (1) Änderungen des Protokolls, 2) Problembehandlung für häufige Fehler, (3) die Grenzen der Technik, (4) die Bedeutung des Modells im Hinblick auf bestehende und alternative Blut - Hirn-Schranke-Modelle, und 5). Einsatzmöglichkeiten für isolierte Gehirn-Kapillaren.
Das hier beschriebene Protokoll ist für 10 g frische menschliche frontalen Kortex Gewebe optimiert. Allerdings ist es relativ einfach, diese Vorgehensweise zu ändern: (1) mehr oder weniger als 10 g Gewebe, 2) gefrorene Hirngewebe oder 3) Hirngewebe aus einer Hirnregion als frontalen Kortex. Erstens kann mit mehr oder weniger als 10 g von Hirngewebe, das nötige Volumen der Puffer einfach nach oben oder unten der verfügbare Betrag des Gewebes skaliert werden. Also, wenn nur 5 g des Gehirngewebes verfügbar ist, sollte das Volumen der Puffer um die Hälfte reduziert werden. Zweitens, wir beschreiben eine Kapillare Isolation, die frischen Gehirngewebe verwendet, aber gefrorenes Gewebe verwendet werden, wenn frische Gewebe nicht verfügbar38. Drittens: wir verwendet frische Hirngewebe frontalen Kortex entnommen, aber Kapillaren eventuell isoliert von anderen kortikalen Hirnregionen gibt es genügend verfügbare Gewebe. Es ist auch möglich, Kapillaren aus nicht-kortikalen Gehirnregionen zu isolieren (zB., weiße Substanz), aber diese Regionen haben eine andere Zelle Komposition und Kapillare Dichte 66,67,68. So, mit Gewebe aus einer anderen Gehirnregion wahrscheinlich müsste das Protokoll werden angepasst (z.B., Puffervolumen, gradient mittlerer Dichte, Zentrifugation Geschwindigkeit und/oder Anzahl der filtrationsschritte).
Das Kapillare Isolierung-Verfahren ist zwar nicht per Se Komplex empfindlich auf kleine Störungen oder Veränderungen im Protokoll. Änderungen können eine verminderte Kapillare Ertrag oder reduzierten Kapillare Lebensfähigkeit führen. Tabelle 2 beschreibt die häufigsten Fehler und Probleme, die während der Isolation angetroffen werden und enthält Tipps zur Vermeidung dieser Fehler und Lösungen für die Fehlersuche, wenn sie auftreten. Das häufigste Problem mit dem Verfahren verbundenen ergibt sich eine geringe Kapillare. Der Verlust der Kapillaren ist oft die kumulierte Summe der kleine Verluste bei jedem Schritt und ist aufgrund der geringen Abweichungen über das Verfahren. Ein wichtiger Schritt in die eine große Menge an Kapillaren verloren gehen kann ist die Dichte Zentrifugation. Eine falsche Konzentration im Puffer führt eine falsche Dichte, die Kapillaren von zelltrümmer zu trennen, das reduziert die Lautstärke des Pellet-Kapillare. Abbildung 3 zeigt die Folgen von zu wenig oder zu viel Dichte-Gradienten-Medium in den Zentrifugationsschritt relativ Gehirn Homogenat. Die Konzentration auf die richtige Einstellung kann dieses Problem lösen. Beachten Sie, dass die Beschleunigungs- und Verzögerungswerte Geschwindigkeit der Zentrifuge auch die Bildung des Kapillaren Pellet-Gehirn beeinflussen kann. Kapillaren können auch während 6 – 7 Schritte verloren wenn die Pipettenspitzen Teil der Kapillare Material klebt. Dieses Problem kann behoben durch gründlich spülen jedes pipettieren Tipp bevor Sie es ändern. Während Schritt 7 waschen Sie die Kapillaren aus der Zelle Stamm Filter möglicherweise unvollständig bzw. Kapillaren können halten Sie sich an den Rand des Filters. Dies kann vermieden werden, indem Sie den Filter unter dem Mikroskop, gefolgt von weiteren Waschschritten überprüfen. Verlieren die Kapillaren während der einzelnen Schritte des Verfahrens Isolierung führt zu eine vernachlässigbare Kapillare Pellet- oder nicht genügend Kapillare Material zur weiteren Verarbeitung und experimentieren.
Isolieren von Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichem Gewebe stellt ein einzigartiges Blut - Hirn-Schranke-Modell, das die in-Vivo -Situation ähnelt. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen der Technik. Eine Herausforderung ist die Verfügbarkeit von frischem menschlichem Gewebe. Wie die optimale PMI ≤4 h, werden Hirngewebe gesammelt bei einer deutlich längeren PMI nicht frisch genug für einige downstream-Anwendungen. In einigen Fällen ist es möglicherweise schwierig, Gewebe-Mittel zu erhalten, die groß genug für mehrere Versuchsgruppen, damit downstream-Anwendungen zu beschränken. So kann frische Kapillaren von Nagetier19, eckzahn69, bovine42oder porcinen70 Hirngewebe zu isolieren besser geeignet, um die Blut - Hirn-Schranke Modell sein. Faktoren, die die Variabilität des menschlichen Gehirngewebe wie Alter, Geschlecht, Ethnizität, Krankheit, Medikamente Geschichte zu bestimmen, sollten Hirnregion der Probe und PMI beim Dolmetschen und Veröffentlichung von Daten berücksichtigt werden. Auf experimenteller Ebene ist es wichtig zu beachten, dass isolierte Kapillaren noch perizyten unter anderem astrocytic Endfeet werden entfernt, indem die Prozedur44. Es muss berücksichtigt werden, dass das hier vorgestellte Modell als ein Ex-Vivo -Modell der Blut - Hirn-Schranke (d.h. Kapillare endothelial Zellen) aber nicht als ein Modell der Neurovaskuläre Einheit dient.
Arbeiten mit jedem menschlichen Gewebe stellt immer eine inhärente Sicherheitsrisiko und Forscher müssen entsprechende Vorsichtsmaßnahmen bei der Isolierung um Infektion zu vermeiden. Insbesondere in den USA erfordert Arbeit mit menschlichem Gewebe benannten Labor-Raum, ist BSL 2 zertifiziert und beinhaltet ein Biosafety-Kabinett (Klasse A2). Darüber hinaus müssen Mitarbeiter persönlichen Schutzausrüstung verwenden (i.e., Kittel, Handschuhe und Gesichtsschutz) und Ausrüstung für die Arbeit mit menschlichem Gewebe und implementieren biogefährlichen Abfallbehandlung bezeichnet. Umsetzung dieser Sicherheitsmaßnahmen ist zeitaufwendig, kostenintensiv und erhöht die Schwierigkeit des Verfahrens, vor allem für unerfahrene Laborpersonal.
Die Blut - Hirn-Schranke ist zwischen den Organismen mit einem klar definierten CNS71hoch konserviert. Modellierung der menschlichen Blut - Hirn-Schranke ist schwierig, da gibt es komplexe Neurovaskuläre Kopplung zwischen den Zellen der Neurovaskuläre Einheit. Eine Erwachsene menschliche Gehirn voraussichtlich im Durchschnitt rund 86 Milliarden Neuronen haben und es wird vermutet, dass fast jedes Neuron seine eigene Kapillare in Nähe zur ordnungsgemäßen Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen72,73zu gewährleisten hat. Kapillare endotheliale Zellen bilden die größte Fläche der Blut-Hirn-Schnittstelle (12-18 m2 für einen gesunden erwachsenen Menschen). Tight Junctions stellen ein Hindernis für eine breite Palette von Pharmakotherapie durch die Blockierung parazellulär Diffusion von gelösten Stoffen. Darüber hinaus zahlreiche Studien beschreiben Barriere Dysfunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen, zB., Alzheimer-Krankheit74, Hub75, Epilepsie38,76, Multiple Sklerose77, und Schädel-Hirn Verletzungen28,78. Daher ist es unerlässlich, die Modelle zu schaffen, die genau das menschliche Blut - Hirn-Schranke darstellen und ermöglichen ein besseres Verständnis der Barrierefunktion in Gesundheit und Krankheit.
Zahlreiche in-vitro- Kultur zellmodelle der Blut - Hirn-Schranke vorhanden sind; Experten-Reviews zu diesem Thema finden Sie unter 41,49,51,69,79,80. Kurz, beide frisch isolierte Gehirn Kapillare endothelial Zellen für Primärkultur und verewigt Gehirn Kapillare endothelial Zelllinien zur Verfügung. Primärkulturen von zerebralen kapilläre Endothelzellen sind meist von Maus, Ratte, Schwein und Kuh verwendet. Primären Zellkulturen sind jedoch arbeitsintensiv, da Zellen frisch isoliert werden müssen. Verewigt Gehirn Kapillare endothelial Zelllinien sind Maus, Ratte und Mensch ab und sind weniger aufwendig, weil sie für den längerfristigen Einsatz passagiert werden können. Auch verewigt Zell-Linien haben jedoch eine Beschränkung, wie oft sie vor dem Verlust ihrer endothelialen Eigenschaften passagiert werden können. Primärzellen sowie immortalisierte Zelllinien sind oft kultiviert auf Tellern zu modellieren das Gehirn Kapillaren Endothel und Messen Sie die Barriere Permeabilität und Drogen Transport über der Zelle Monolage, imitiert dabei Blut-Hirn-Transport41 ,81,82. Die Kulturmedien in diesen Modellen kann auch geändert oder ergänzt werden mit Astrozyten, perizyten oder andere physiologisch relevanten Faktoren wie cAMP41,83,84.
Der Vorteil von immortalisierte Zelllinien ist ihre relativ einfachen Zugriff und Verfügbarkeit. Während kultivierte Endothelzellen Zusammenfluss erreichen können, verlieren sie Endothelzellen Eigenschaften, wie sie, Side-by-Side wachsen in einem monomolekularen Film. Beispielsweise anzeigen kultivierten hCMECs reduzierte Expression von Transporter wie P-Gp, tight Junction-Proteine und Display Variable Durchlässigkeit auf XENOBIOTIKA41. Abbildung 4 zeigt ein Western-Blot für P-Gp-Protein-Expression in hCMEC/D3 Zellen im Vergleich zu frisch isolierte menschliche Kapillaren. Trotz 10-divisibel in geringerem Umfang Gesamt-Protein ist das Signal für P-Gp in isolierten menschlichen Kapillaren im Vergleich zu hCMEC/D3 Zellen stärker. Dies bedeutet, dass hCMEC/D3 Zellen eine erhebliche Menge von P-Gp-Protein-Expression in Kultur verloren. Unterschiede in Kultur, Medien, Umwelt und Anlagen beeinflussen darüber hinaus wichtige Maßnahmen der barriereintegrität, d. h., TEER-Messungen in Transwell Platte Assays. Einige dieser Probleme können überwunden werden, durch die Verwendung der isolierten Gehirn Kapillare Modell, das genauer das menschliche Blut - Hirn-Schranke in Vivodarstellt.
Isolierte Gehirn-Kapillaren wurden für eine Vielzahl von Studien, darunter Genomik, Proteomik, funktionelle Proteomik und Cellomics Studien (Abbildung 5) verwendet. Darüber hinaus gibt es viele Techniken und Methoden, um isolierte Gehirn-Kapillaren in jedem dieser Felder zu analysieren. Insbesondere können die experimentellen Techniken, die in Abbildung 5 dargestellten auf Gehirn-Kapillaren aus einer Reihe von Quellen, einschließlich menschliche, bovine, Nagetier und Schweinen Gewebe, die translationalen Forschung erleichtern können isoliert verwendet werden. Z. B. Li Et al. 85 Studium der Genomik der Blut - Hirn-Schranke mit Unterdrückung subtraktiven Hybridisierung von mRNA isoliert von Ratte Gehirn Kapillaren zu reinigen. Darüber hinaus Ott Et al. 86 verwendet RT-PCR und qRT-PCR, um die Regulierung des P-Gp von PXR zu studieren. Viele Proteomic Studien nutzen Western Blot-3, Dot-Blot Analyse87, einfache Western Assays3,38, ELISA88,89, Immunopräzipitation3, und Immunostaining3,90,91. Zu erkennen, Transporter, Handel mit dem Gehirn Endothel, McCaffrey Et al. 92 verwendet subzellulären Fraktionierung der isolierte Gehirn-Kapillaren. Sánchez del Pino Et Al. 93verwendet isoliert boviner Endothelzellen membranvesikel, um Lage und Verkehrsanbindung Richtung Transporter über die Blut - Hirn-Schranke zu erkennen. In anderen Studien der Proteomik verwendeten die Forscher Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie, um Transporter Proteine94,95,96zu quantifizieren. Funktionelle Proteomik-Studien haben Transporter genutzt und Leckage assays2,38. Hartz Et al. 2 zur Zymography Ermittlung der Enzymaktivität in isolierte Gehirn-Kapillaren. Darüber hinaus hat große Cellomic Forschung mit Zellkulturen zahlreiche endotheliale Zell-Linien und Modelle der Blut - Hirn-Schranke82,83,84erzeugt. Mit diesen Modellen gehören gemeinsame Assays verwendet Migration Assays97,98, Rentabilität und Toxizität Assays99und Angiogenese-Assays98.
Isolierte Gehirn-Kapillaren ermöglichen genaue Charakterisierung von Protein-Expression und Aktivität und Beschreibung der Signalwege bei der Blut - Hirn-Schranke. Dies liegt teilweise an der Kapillare Inhalt des Gehirns, die nur etwa 1 % (V/V). So, mit Gesamt-Hirn Homogenat oder Hirnschnitten als Ersatz für gereinigte Kapillare endothelial Zellen wahrscheinlich ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis24führt. Darüber hinaus sind nach Isolierung, Gehirn-Kapillaren für mindestens 6 h (unveröffentlichte Daten von Maus und Ratte), die Studien zu erkennen, bestimmte Signalwege ermöglicht. Es wird empfohlen, eine Kontrollgruppe von der gleichen Vorbereitung gehören.
Repräsentative und Translationale Modelle von der Blut - Hirn-Schranke, wie z.B. das isolierte Kapillare Modell diskutiert in diesem Bericht sind erforderlich, um die Barrierefunktion in Gesundheit und Krankheit zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu isolierten menschlichen Gehirns Kapillaren auf eine gute Rendite und hohe Qualität, der als ein ex-Vivo -Modell der Blut - Hirn-Schranke dienen kann. Isolierte Kapillaren behalten ihre ursprüngliche Struktur und Funktion, wodurch mit ihnen für eine Reihe von Post-Isolierung molekularen, biochemischen und physiologischen Assays. Vorsicht beim Umgang mit menschlichem Gewebe, vorzugsweise in eine höhere Einstellung oder BSL 2 Proben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken und Dr. Peter Nelson und Sonya Anderson in der UK-ADC Brain Tissue Bank für die Bereitstellung aller menschlichen Gehirns Gewebeproben anerkennen (NIH grant Nummer: P30 AG028383 vom National Institute on Aging). Wir danken Matt Hazzard und Tom Dolan, Universität von Kentucky, Information Technology Services, akademischen Technologie und Fakultät Engagement für grafische Unterstützung. Dieses Projekt wurde von Grant Nummer 1R01NS079507 vom National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (um b.b.) und Nummer 1R01AG039621 Zuschuss aus dem National Institute on Aging (zu A.M.S.H.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall oder das National Institute on Aging. Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Personal Protective Equipment (PPE) | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| Disposable Protective Labcoats | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended |
| Face Shield, disposable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended |
| Safety Materials | |||
| Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | to cover working areas |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | for used scalpels |
| Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 °C Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH Meter | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Dissecting Microscope | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | used to remove meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogenizer | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | used to freeze the tissue? |
| Voyager Pro Analytical Balance | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | used to check isolated capillaries | |
| Tools and Glassware | |||
| Finnpipette II Pipette 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | wash capillaries off filter |
| Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | resuspend pellet in BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | to mince brain tissue |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | to cover beaker and volumetric flask |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | to wash capillaries off filter |
| 60 mL syringe with Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | used with connector ring to filter capillaries |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | used for mincing |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | used to remove meninges |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 mL volume, clearance: 150-230 μm |
| Dounce Homogenizer | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volume, clearance: 80-130 μm |
| Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left |
| pluriStrainers (pore size: 30 µm) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| Connector Ring | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | reuse multiple time |
| 1 L Volumetric Flask | for preparation of Isolation Buffer | ||
| 1 L Beaker | for preparation of 1% BSA | ||
| Stir Bar | for preparation of 1% BSA and Ficoll® | ||
| Schott Bottle (60 mL) | for preparation of Ficoll® | ||
| Ice Bucket | to keep everything cold | ||
| 100 mm Petri dish | for mincing of brain tissue | ||
| Tissue Culture Cell Scraper | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | to remove supernatant after centrifugation |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use. |
| DPBS with Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - part of the Isolation Buffer |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use. |
| Glucose (D-(+) Dextrose) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM |
| Sodium Hydroxide Standard Solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | to adjust pH of the DPBS |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentration: 1 mM |
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