Summary
Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.
Abstract
Função de barreira hemato - encefálica compreensão sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que mantêm a promessa para melhorar a entrega de drogas do cérebro, melhorar a proteção do cérebro e tratar o cérebro transtornos. No entanto, estudando a função humana barreira sangue - cérebro é um desafio. Assim, há uma necessidade crítica de modelos adequados. A este respeito, os capilares do cérebro isolados do tecido do cérebro humano representam uma ferramenta única para estudar a função de barreira, como próximo a situação humana no vivo quanto possível. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar os capilares do tecido do cérebro humano em um alto rendimento e com pureza e qualidade consistente. Capilares são isolados do tecido do cérebro humano fresco usando homogeneização mecânica, gradiente de densidade centrifugação e filtração. Após o isolamento, os capilares do cérebro humano podem ser usados para várias aplicações, incluindo ensaios de vazamento, imagem de célula viva e ensaios baseados em imunológico para estudar a expressão da proteína e função, atividade enzimática ou sinalização intracelular. Cérebro humano isolado capilares são um modelo exclusivo para elucidar o Regulamento da função humana barreira hemato - encefálica. Este modelo pode fornecer insights sobre patogênese do sistema nervoso central (SNC), que irá ajudar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC.
Introduction
A barreira sangue - cérebro é uma interface rigidamente controlada entre o sangue e o cérebro que determina o que entra e sai do cérebro. Anatomicamente, células endoteliais compõem a barreira sangue - cérebro e formam uma rede capilar complexa, contínua. Fisiologicamente, essa rede capilar fornece o cérebro com oxigênio e nutrientes ao simultaneamente eliminação de dióxido de carbono e produtos de resíduos metabólicos. Importante, a evidência suporta que as alterações para a barreira contribuam para inúmeras patologias, incluindo a doença de Alzheimer, epilepsia e acidente vascular cerebral1,2,3,4,5 , 6 , 7. cérebro células endoteliais também servem como uma barreira ao tratamento, bloqueando a absorção de drogas no cérebro, por exemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme seguindo tumor ressecção8,9, 10. a este respeito, os capilares do cérebro humano isolado representam um único ex vivo modelo de barreira hemato - encefálica que se assemelha a barreira propriedades in vivo, que permite o estudo da função de barreira e disfunção em saúde e a doença. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para isolar os capilares do cérebro do cérebro humano em um capilar de consistentemente de alta qualidade e rendimento para estudar a barreira sangue - cérebro.
Em 1969, Siakotos et al. 11 foram os primeiros a relatar o isolamento dos capilares do cérebro do tecido cerebral bovina e humana usando densidade gradiente centrifugação e vidro do grânulo coluna separação. Mais tarde, Goldstein et al. 12 melhorado este método adicionando várias etapas de filtração para diminuir a quantidade de tecido necessário para estudar os capilares do cérebro isolados de ratos, mantendo a atividade metabólica de transporte de glicose. Desde então, pesquisadores otimizado o procedimento de isolamento capilar inúmeras vezes, melhorar o modelo capilar método e cérebro com cada iteração13,14,15. Por exemplo, Pardridge et al. 16 isolado bovina capilares usando digestão enzimática, ao invés de homogeneização mecânica e posteriormente passou uma suspensão capilar através de um filtro de malha de 210 µm e uma coluna de vidro do grânulo. Essas modificações melhoraram a mancha de exclusão trypan azul dos capilares do cérebro isolado e assim, aumentaram a viabilidade celular endotelial. No início de 1990, Damasceno et al. 17 isolado bovina e rato capilares que eram claras de contaminação neuronal e mantida a atividade metabólica de γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) e fosfatase alcalina. Em 2000, Miller et al. 18, usado isolado de rato e capilares do cérebro suínos em combinação com microscopia confocal para mostrar o acúmulo de substratos de transporte no lúmen dos capilares. Posteriormente, nosso laboratório tem continuado a otimizar o processo de isolamento capilar do cérebro e nós estabelecemos transporte ensaios para determinar a P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, câncer de mama resistência da proteína (BCRP)22,23e proteína de resistência a múltiplas drogas 2 (Mrp2)24 atividade de transporte. Em 2004, publicou dois relatórios onde costumávamos capilares de cérebro de rato isolado para investigar diversas vias de sinalização. Em Hartz et al. 21, encontramos que o peptídeo endotelina-1 reversível e rapidamente reduzida função de transporte de P-gp em capilares cerebrais, actuando através do receptor (ETB) do receptor B de endotelina, óxido nítrico sintase (NOS) e proteína quinase C (PKC). Em Bauer et al . 19, temos demonstrado que a expressão do receptor nuclear receptor pregnane X (PXR) e mostrou PXR-modulação da função de expressão e transporte de P-gp em capilares do cérebro. Em experimentos com ratos transgénicos de PXR humanizados, nós expandidos nessa linha de pesquisa e mostrou na vivo de aperto da barreira por estrogenos P-gp através da ativação de hPXR25. Em 2010, Hartz et al. 26 usado essa abordagem para restaurar a expressão da proteína de P-gp e transportar a atividade em ratos transgénicos precursora amiloide humano proteína (hAPP) overexpress hAPP. Além disso, restaurando a P-gp no hAPP ratos reduziram significativamente níveis de cérebro de42Aβ e beta amiloide (Aβ)40.
Além de estudar a sinalização de caminhos, capilares de cérebro isolado podem ser usados para determinar as alterações na permeabilidade capilar que nos referimos como vazamento capilar. Em particular, o ensaio de fugas de Texas Red é usado para avaliar o escapamento do corante fluorescente Vermelho Texas do lúmen capilar ao longo do tempo e estes dados são usados para analisar taxas de fugas. Taxas de vazamento capilar aumentada em comparação com aqueles dos capilares de controle indicam alterações na integridade física da barreira hemato - encefálica2. Isto é valioso porque existem numerosos estados patológicos associados rompimento da barreira, por exemplo., epilepsia, esclerose múltipla, doença de Alzheimer e cerebral traumática lesão27,28,29, 30. Outros grupos também têm utilizado isolados capilares para discernir as vias de sinalização que regulam a expressão de proteínas e atividade de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Finalmente, continuamos a otimizar esse método para o isolamento dos capilares do cérebro humano e, recentemente, mostramos a expressão aumentada de P-gp no humana barreira hemato - encefálica, em pacientes com epilepsia, em comparação com indivíduos de controle livre de apreensão38 . Tomados em conjunto, estes desenvolvimentos demonstram que os capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo versátil para estudar a função de barreira.
Vários in vivo, ex vivoe em vitro barreira hemato - encefálica modelos têm sido utilizados em pesquisa básica e rastreio de drogas industriais, principalmente com o objetivo de testar a entrega da droga para o cérebro39,40,41 ,42,,43,44. Além de isolados ex vivo capilares do cérebro, modelos atuais da barreira hemato - encefálica incluem modelos em silico , em vitro cultura celular de células endoteliais capilares do cérebro isolado ou linhas de células imortalizado de vários espécie, em vitro de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) que se diferenciar em células endoteliais capilares do cérebro e microfluidic modelos em um chip.
In silico modelos são mais usados no desenvolvimento de drogas para a seleção de candidatos a fármacos com base no previsto de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) Propriedades. Métodos como modelos de relacionamento (QSPR) estrutura-Propriedade quantitativa e quantitativa estrutura-atividade relação (QSAR) são métodos populares usados na seleção da elevado-produção de bibliotecas para prever a penetração do cérebro de candidatos da droga 45 , 46. estes modelos são úteis para moléculas de tela para propriedades de penetração da barreira.
Betz et al 47 estabeleceu monocamadas de células endoteliais capilares do cérebro culta como um sistema de modelo em vitro barreira hemato - encefálica. Em vitro celular cultura modelos usando tecido fresco ou linhas de células endoteliais imortalizado como células endoteliais microvessel cerebral humana (hCMECs) podem ser outra ferramenta de seleção da elevado-produção para penetração do cérebro ou estudos mecanicistas. No entanto, modelos de cultura de células endoteliais capilares cerebrais faltam a tensão de cisalhamento fisiológico do fluxo de sangue para dentro do lúmen capilar, estão limitados a complexidade geral biológica e se submetem a mudanças na expressão e localização de componentes importante barreira como proteínas de junção apertada, íon, transportadores, enzimas e receptores de superfície canais48,,49,50. Inversamente, monocamadas endoteliais derivado hPSCs, tem permeabilidade de sacarose baixa em comparação com as culturas hCMEC/D3 e conter expressão polarizada de alguns transportadores barreira hemato - encefálica, moléculas de adesão e junções apertadas51, 52. no entanto, essas células também estão sujeitos a alteração de propriedades na cultura, e o sistema deve ser validado para sua recapitulação na vivo Propriedades barreira52.
Mais recentes tendências em pesquisa da barreira hemato - encefálica incluem utilizando sistemas de cultura de tecido 3D para criar capilares artificiais, usando a tecnologia do órgão-on-chip para gerar dispositivos microfluídicos, ou utilizando a tecnologia de fibra oca53, 54 , 55. capilares artificiais, no entanto, têm significativamente maiores diâmetros (100 – 200 µm) do que o cérebro os capilares (3 – 7 µm). Daí, o cisalhamento forças em vitro não totalmente se assemelham a situação na vivo . Esta mensagem é dirigida em dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", onde os compartimentos de "sangue" e "cérebro" de forma artificial de membranas e fluidos são bombeados através destes dispositivos, gerando forças de cizalhamento microfluidic. Da mesma forma, co culturas de células de músculo liso vascular e células endoteliais em várias combinações com astrócitos também têm sido usadas com a tecnologia de fibra oca para recriar reológicos parâmetros presentes na vivo condições56 , 57 , 58. no entanto, desconhece-se o quanto este modelo reflete outras propriedades da barreira sangue - cérebro, tais como transporte, metabolismo, sinalização e outros. Estes modelos capilar e chip artificiais são adequados para seleção da elevado-produção de drogas, mas as células usadas para gerar esses modelos também estão sujeitos a alterações durante a cultura.
Fatias de cérebro congelado e fixo ou cerebrais primários, culturas de células endoteliais capilares são modelos adicionais que podem ser usados paraestudar a microvasculatura humana5,59,60,61. Por exemplo, imuno-histoquímica do tecido cerebral fixa é usada para determinar a localização da proteína, e a expressão em saudável em relação ao tecido doente.
Além de fatias de tecido e os modelos em vitro capilares do cérebro descrito acima, recentemente isolados podem ser utilizados para estudar a função da barreira hemato - encefálica. As limitações deste modelo capilar isolada incluem a dificuldade para obter o tecido do cérebro humano fresco, ausência de astrócitos e neurônios e um processo de isolamento relativamente demorado. Uma vantagem do modelo capilar cerebral isolado é que este modelo se assemelha a situação na vivo e, portanto, pode ser usado para caracterizar a função de barreira e disfunção. Importante, ele também pode ser usado para discernir os mecanismos de sinalização usando uma infinidade de ensaios e técnicas moleculares3,19,,62,63.
Nosso laboratório tem acesso a ambos os tecidos frescos e congelados do cérebro humano através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M)64. Neste contexto, as autópsias seguem um protocolo padrão, cérebros são obtidos em < 4h e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Dado este acesso exclusivo ao tecido do cérebro humano, estabeleceu e otimizado um protocolo para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano que resulta em um alto rendimento dos capilares do cérebro humano intacto, viável. Dois pontos de extremidade comuns de interesse são para determinar a expressão da proteína e atividade. A este respeito, nós e os outros estabeleceram vários ensaios que podem ser usados com os capilares do cérebro isolado para estudar a expressão da proteína e níveis de atividade. Estes ensaios incluem mancha ocidental, ensaio de Western simples, ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), zimografia, ensaios de atividade de transporte, e ensaios de vazamento capilar. Estes ensaios permitem aos pesquisadores estudar alterações na função de barreira em condições patológicas humanas, determinar caminhos que regem a atividade e expressão da proteína e identificar alvos farmacológicos para o tratamento da barreira hemato - encefálica associada doenças.
Tomados juntos, recentemente capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo robusto e reprodutível a barreira sangue - cérebro. Especialmente, este modelo pode ser combinado com muitos ensaios diferentes para determinar uma grande variedade de pontos de extremidade para estudar a função de barreira.
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Protocol
As informações abaixo baseia-se na atual segurança e as normas reguladoras da Universidade de Kentucky, Lexington, KY, EUA. Como uma precaução de segurança, consulte programa de segurança biológica da instituição e as mais atuais regulamentos e recomendações antes de trabalhar com tecido humano.
Atenção: O tecido humano pode ser uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue, incluindo o vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV) e outros. Trabalhar com tecido humano representa o risco de infecção por patógenos transmitidos pelo sangue. Portanto, certas considerações de segurança e regulamentação são imperativas, ao trabalhar com tecido humano para proteger o pessoal de laboratório. Trabalhar com tecido humano nos EUA requer um laboratório de nível 2 de biossegurança, bem como as precauções de segurança e formação de acordo com o NIH seção IV-B-7, OSHA Act de 1970 cláusula 5(a)(1) e programa de institucional de segurança biológica do usuário. Em geral, aprovação do Comitê institucional de biossegurança e/ou Conselho de revisão institucional deve ser obtida antes da realização de qualquer pesquisa envolvendo humanos materiais (tecido, fluidos corporais). O treinamento é necessário para todo o pessoal a trabalhar com materiais humanos e inclui treinamento de segurança do laboratório básico, por exemplo, químicos higiene e segurança do laboratório, bem como formação específica para a segurança biológica, resíduos perigosos e humanos patógenos transmitidos pelo sangue. Todo o pessoal a trabalhar com materiais humanos é altamente recomendado para obter vacinas de hepatite B, antes de trabalhar com materiais humanos. Pessoal é obrigado a usar equipamentos de proteção individual específico enquanto estiver trabalhando com materiais humanos, por exemplo., um jaleco algemado e uma cara de escudo e usando luvas de todos os tempos. Todo trabalho é realizado em uma armário de biossegurança (classe 2). Todos os equipamentos que vem no contato com materiais humanos e qualquer resíduos de materiais humanas é tratado adequadamente para evitar contaminação e/ou infecção do pessoal. Todos os equipamentos e as superfícies são limpas com 10% de etanol água sanitária e 75%, após cada procedimento envolvendo materiais humanos. Um derramamento com materiais humanos deve ser imediatamente limpas. Produtos vidreiros é esterilizado após cada utilização. Resíduos, incluindo os tecidos humanos não fixado, são coletado em um saco de resíduos de risco biológico rotulado e esterilizada. Farelos são coletados em um recipiente de punção e estanques rotulado como de risco biológico. Todos os resíduos de materiais humanos é Descartado de acordo com regulamentos de segurança biológica da instituição.
Nota: Nosso laboratório obtém amostras frescas córtex frontal de indivíduos falecidos, através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M). Critérios de inclusão são: inscrição no estudo de coorte longitudinal autópsia UK-ADC e um intervalo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autópsias sigam um protocolo padrão e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Um PMI curta de menos de 4 h é da maior importância para assegurar a viabilidade capilar depois de isolamento. Tecido fresco e congelado pode ser usado. Se o congelamento for necessário, tecido cerebral humano recentemente obtidos deve ser choque congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C. Tecido fresco ou descongelado deve ser armazenado no buffer de isolamento (veja abaixo) e processado rapidamente. Encontramos esse 10 gramas de tecido humano fresco rende cerca de 100 mg de capilares de cérebro (peso úmido).
1. instalação
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Preparação do amortecedor
Nota: O volume de reserva necessária depende da quantidade de tecido. Todos os volumes de tampão no protocolo a seguir baseiam-se 10 g de tecido do córtex cerebral humano.- L isolamento Buffer: Usar 1,5 L de fosfato salino de Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 milímetros de NaCl, Na2HPO4de 8,1 mM, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completar com 5 mM D-glicose (1,35 g ) e piruvato de sódio 1 mM (0,165 g). Depois de adicionar a glicose e piruvato, ajuste o pH 7,4 com hidróxido de sódio. Esfriar e guarde o buffer de 4 ° C antes de usar.
- Albumina de soro bovino (BSA): Adicione 10 g de pó de BSA a 1 L de tampão de isolamento para uma concentração final de BSA de 1%. Mexa lentamente para evitar bolhas, ajustar o pH 7,4 e armazenar a 4 ° C durante a noite. Imediatamente antes da utilização, misture suavemente; Evite a formação de bolhas para evitar a desnaturação da albumina.
- médio de gradiente de densidade: pesar 18 g de médio gradiente de densidade para um frasco de vidro e adicionar uma barra de agitação magnética. Adicione 60 mL de tampão de isolamento e agitar vigorosamente por 5 min até todo pó é suspenso. Loja durante a noite a 4 ° C, para permitir que o meio de gradiente de densidade dissolver. Mexa por 10 minutos antes do uso.
- Armazenar todos os buffers a 4 ° C; manter todas as ferramentas e buffers no gelo durante o procedimento de isolamento inteira. Misture todos os buffers antes do uso.
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Instalação experimental
- Monte o pilão do moinho Potter-Elvehjem tecido para o misturador eletrônico de sobrecarga. Coloque o moedor de tecido Potter-Elvehjem e o homogenizacao homogenizador com pilão no gelo sob o capô. Preparar uma malha de filtro de 300 µm (5 x 5 cm2), dobre-o para um cone e inserir e anexá-lo a um 50 mL tubo Falcon com fita (figura 1A).
- Coloque anéis conexão e filtros de tensão da pilha (tamanho de poros: 30 µm) em tubos Falcon de 50ml. Prepare os sacos de resíduos de risco biológico. Coloque equipamentos necessários na biossegurança do armário (ver Tabela de materiais).
2. preparação da amostra cérebro
Nota: A figura 1A mostra o gráfico de fluxo de trabalho do processo de isolamento todo descrito abaixo. Tecido cerebral humano pode originar-se de qualquer parte do córtex e pode ser usado fresco ou congelado. Tecido de cérebro congelado pode ser descongelado à temperatura ambiente (nenhum buffer; ~ 30 min para 10 g). Para obter resultados comparáveis, o tecido cerebral deve ser obtido com a mesma região do cérebro para cada experimento. Este protocolo é otimizado para fresco (PMI < 4h) córtex cerebral humano que não tenha sido congelado.
- Preparação do tecido do cérebro humano: documentar o peso do tecido cerebral. Todos os números do protocolo a seguir são apropriados para 10 g de tecido cerebral humano fresco. Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100mm. Cuidadosamente, remova todas as meninges com fórceps. Use um bisturi para cortar a massa branca.
- Picagem de tecido do cérebro humano: corte o tecido do cérebro com cuidado e piquem-o com um bisturi. Carne moída por cerca de 5 min (pedaços de 2 a 3 mm). Transferi o tecido cerebral para o Potter-Elvehjem moedor de tecido. Adicione 30 mL de tampão de isolamento.
Nota: As peças de tecido picada são difíceis de ver, desde que o tecido cerebral se transforma em mingau através do processo de picagem.
3. a homogeneização
- Moedor de tecido Potter-Elvehjem (autorização: 150 – 230 µm): homogeneizar cada amostra com 100 golpes à velocidade de 50 rpm homogenizador. Documente o tempo cada 25 traços e o tempo total necessário para 100 traçados. Consulte a tabela 1 para um protocolo proposto homogeneização; o tempo total para homogeneização de 10 g de córtex frontal humano é cerca de 22 min. Não mexa no ar para evitar bolhas.
- Homogenizador homogenizacao (autorização: 80-130 µm): transferir o homogeneizado para um homogenizador homogenizacao no gelo. Homogeneizar a suspensão com 20 golpes (~ 6 s/curso, total de ~ 2 min). Evite bolhas.
4. centrifugação
- Distribua o cérebro homogenate igualmente em quatro tubos de centrifugação de 50 mL e o volume total do homogenate de documento. Distribua 50 mL de tampão de gradiente de densidade para os tubos de centrifugação (12,5 mL por tubo). Use 10 mL de tampão de isolamento para enxaguar o pilão e homogenizador e distribuir para os quatro tubos de centrifugação (~2.5 mL por tubo).
- Feche os tubos de centrífuga com tampas. Misture o homogeneizado, médio gradiente de densidade e tampão agitando vigorosamente os tubos. Centrifugar a 5.800 x g durante 15 min a 4 ° C (rotor de ângulo fixo); Seleccione uma velocidade de desaceleração média para manter o sedimento ligado ao tubo. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada em 2 mL de 1% de BSA.
5. filtração
Nota: Para separar os capilares de glóbulos vermelhos e outros detritos celulares, são necessárias várias etapas de filtração.
- 300 µm de malha: após a re-suspensão a pelota, filtrar a suspensão através da malha de 300 µm. Os capilares são filtrados através da malha, que navios maiores e restos de cérebro maiores continuam na malha. Lave cuidadosamente a malha com até 50 mL de 1% de BSA. Descarte a malha.
Nota: Esta etapa de filtração limpa a suspensão capilar de qualquer maiores navios ou pedaços de detritos de cérebro. -
Filtro de tensão de célula 30 µM
Nota: Esta etapa de filtração separa capilares de glóbulos vermelhos e outros restos de cérebro.- Distribua o filtrado capilar da etapa 6.1 sobre os filtros de tensão de célula de cinco 30 µm (cerca de 10 mL do filtrado capilar por filtro de tensão de célula). Os capilares estão retidos por este filtro, Considerando que as células vermelhas do sangue, outras células únicas e restos de cérebro pequeno passam através do filtro e são recolhidos no filtrado.
- Lave cada filtro com 25 mL de 1% de BSA. Depois, despeje todos os filtrados sobre o sexto filtro para aumentar o rendimento. Lavar cada filtro com 50 mL de 1% de BSA; manter a célula estirpe filtros com contendo os capilares e descartar o filtrado.
6. coleção capilar
- Vire os filtros e lave os capilares com 50 mL de 1% de BSA para cada filtro em tubos de 50 mL. Levemente aplique pressão com a ponta da pipeta de uma pipeta de 5 mL e movê-lo do outro lado do filtro para lavar os capilares do cérebro.
- Certifique-se de lavar todos os capilares do cérebro, especialmente a partir da borda do filtro. Evite bolhas, pois isto dificulta o processo de filtração e aumenta a chance de perda capilar.
7. lavar roupa
- Depois de coletar os capilares, centrifugue todas as amostras a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C (balançando o balde do rotor). Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em aproximadamente 3 mL de tampão de isolamento. Combine todos os chumbos ressuspensão de uma amostra em um tubo cônico de 15 mL e preenchê-lo com o tampão de isolamento. Centrifugar novamente a 1.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C e lavar duas vezes mais.
- Documente a pureza capilar com um microscópio (ampliação de 100 X) e câmera (figura 1B).
Nota: O rendimento de cérebro capilar de 10 g de tecido do cérebro humano é geralmente de cerca de 100 mg. Os capilares do cérebro isolado agora podem ser usados para experiências, processadas (ex., lisado, isolamento de membrana), ou ser congelado e armazenado a-80 ° C em cryotubes por um período mínimo de 6-12 meses (evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento).
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Representative Results
Os isolamentos de tecido cerebral humano rendem uma suspensão enriquecida nos capilares do cérebro humano (figura 1B) com pequenas quantidades de vasos maiores, glóbulos vermelhos, outras células únicas e alguns detritos de células. Alguns capilares são ramificados, e, em alguns, os glóbulos vermelhos são aprisionados nos lúmens capilares. O capilar típico tem uma 3 – 7 µm de diâmetro e é aproximadamente 100-200 µm comprimento com lúmens abertos; a maioria das extremidades capilares são recolhidas. Utilizando microscopia confocal, capilares do cérebro humano isolado revelam uma estrutura tubular, intacta e morfologia. Figura 2A mostra que um representante transmitida uma imagem clara de um cérebro humano capilar com um Pericito anexado e um glóbulo vermelho no lúmen. Todas as conclusões a respeito de diâmetro, o tamanho e morfologia estão de acordo com relatórios anteriores sobre a estrutura do cérebro isolado capilares12,17,18. O cérebro humano isolado capilar na Figura 2B foi immunostained para P-gp (verde) usando C219 como o anticorpo primário (1 µ g/mL); núcleos eram counterstained com DAPI (1 µ g/mL).
Figura 1: fluxograma para isolamento capilar. (A), o pictograma ilustra etapas principais do processo de isolar os capilares do cérebro de tecido humano fresco. (B) a imagem mostra os capilares do cérebro humano isolado sob um microscópio de luz diretamente após o isolamento (ampliação de 100 X). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cérebro humano isolado capilar. (A), A luz transmitida a imagem de um cérebro humano isolado capilar. (B), o microscópio confocal imagem mostra um immunostained capilar do cérebro humano isolado de P-gp (verde; C219 1 µ g/mL); núcleos eram counterstained com DAPI (azul; 1 µ g/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Solucionando problemas de centrifugação densidade. O pictograma mostra a preparação após a centrifugação gradiente de densidade. Ele destaca os efeitos dos demais e muito pouco médio gradiente de densidade e como isso afeta a separação e a pelota capilar resultante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: P-gp expressão de proteínas nos capilares do cérebro humano isolado. Western blot mostra bandas fortes de P-gp (1 µ g/mL) em isolado capilares humanos em comparação com células hCMEC\D3. Β-actina foi usado como um controle de carregamento (1 µ g / µ l). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: aplicações para os capilares do cérebro humano isolado. Uma visão geral das aplicações mais comuns para os capilares do cérebro isolado publicados na literatura. Capilares isolados têm sido utilizados para: 1) genômica85,86, 2) Proteomics3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) proteômica funcional2,38e 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Traços | Tempo [min] |
| 1 – 25 | 7 – 7,5 |
| 26-50 | 5 – 5,5 |
| 51 – 75 | 5 – 5,5 |
| 76-100 | 5 – 5,5 |
| Tempo total: | 22 – 24 min |
Tabela 1: protocolo de homogeneização. O protocolo de homogeneização para o moedor de tecido Potter-Elvehjem para homogeneizar 10g de córtex frontal humano a uma velocidade de homogeneização de 50 rpm. Note que o primeiros vários traços requerem tempo adicional para homogeneizar o tecido picado. Após a homogeneização desta inicial, cada traço é 12 s de duração (6 s de movimento descendente, 6 s para movimento ascendente). Assim, após a homogeneização inicial, 5 cursos podem ser realizados em 1 min, ou 25 cursos em 5 min.
| Problema | Causa possível | Solução |
| Nenhuma pelota capilar | 1) concentração de Ficoll incorreta | 1) ajustar a concentração de Ficoll |
| 2) velocidade de centrifugação incorreto | 2) ajustar a velocidade de centrifugação | |
| 3) velocidade de aceleração ou desaceleração incorreta | 3) ajustar a velocidade de aceleração ou desaceleração | |
| Baixo rendimento capilar | 1) meninges bloqueando as etapas de filtração | 1) remover todas as meninges antes da filtração |
| 2) também muitos capilares perdidos durante o procedimento de isolamento | 2) calcular corretamente a concentração do tampão, enxágue a pontas de pipetas | |
| 3) capilares fora PluriStrainer filtros de lavagem foi insuficiente | 3) vire filtros e inspeccione cuidadosamente para capilares (microscópio de uso) | |
| 4) excessiva bolhas durante resuspensions | 4) pipeta lentamente para evitar bolhas | |
| Capilares não viáveis | 1) intervalo post-mortem estendida | 1) reduzir o intervalo se possível ou usar cérebros snap-congelado |
| 2) usando congelado o tecido para o isolamento | 2) o uso de tecido fresco | |
| 3) tempo de procedimento de isolamento há muito tempo | 3) otimizar o fluxo de trabalho | |
| 4) equipamento/buffers de não foram mantidos no gelo durante o procedimento de isolamento | 4) manter o equipamento e buffers no gelo durante o isolamento |
Tabela 2: solução de problemas comuns problemas. Uma lista dos erros mais comuns e problemas que ocorrem durante o processo de isolamento e como eles podem ser resolvidos.
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Discussion
O presente protocolo descreve o isolamento dos capilares do cérebro humano intacto e viável de tecido fresco. Nesta seção, discutiremos em detalhes a seguir: 1) modificações para o protocolo 2) solução de problemas de erros comuns, 3) as limitações da técnica, 4) o significado do modelo em relação ao existente e modelos alternativos barreira hemato - encefálica, e 5). potenciais aplicações para capilares do cérebro humano isolado.
O protocolo descrito aqui é otimizado para 10 g de tecido do córtex frontal humano fresco. No entanto, é relativamente simples de modificar este procedimento para: 1) mais ou menos do que 10 g de tecido, tecido cerebral 2) congelados ou tecido de cérebro 3) de uma região do cérebro que não seja o córtex frontal. Em primeiro lugar, com mais ou menos de 10 g de tecido cerebral, o volume necessário de buffers pode simplesmente ser escalado acima ou para baixo para a quantidade disponível de tecido. Assim, se apenas 5g de tecido cerebral está disponível, o volume dos buffers deve ser reduzido pela metade. Em segundo lugar, descrevemos um isolamento capilar que utilizado tecido de cérebro fresco, mas tecido congelado pode ser utilizado se o tecido fresco é indisponível38. Em terceiro lugar, usamos tecido de cérebro fresco retirado o córtex frontal, mas capilares podem ser isolados de outras regiões do cérebro cortical se há tecido suficiente disponível. Também é possível isolar os capilares de regiões do cérebro não-cortical (EG., matéria branca), mas essas regiões têm uma célula diferente composição e capilar densidade 66,67,68. Assim, usar o tecido de uma região diferente do cérebro provavelmente exigiria o protocolo para ser ajustado (por exemplo, volume de tampão, gradiente de densidade média, velocidade de centrifugação e/ou número de etapas de filtração).
O procedimento de isolamento capilar, enquanto não complexo propriamente dita, é sensível a pequenas perturbações ou alterações no protocolo. Modificações podem resultar em uma diminuição de rendimento capilar ou viabilidade capilar reduzida. Tabela 2 descreve os erros mais comuns e problemas encontrados durante o isolamento e listas de dicas para evitar esses erros e soluções para resolução de problemas se eles ocorrerem. O problema mais comum associado com o procedimento é um baixo rendimento capilar. A perda de capilares é muitas vezes a soma cumulativa de pequenas perdas em cada etapa e é devido a pequenos desvios em todo o procedimento. Uma etapa crítica em que uma grande quantidade de capilares pode ser perdida é a centrifugação de densidade. Uma concentração incorreta no buffer resulta em uma densidade incorreta para separar os capilares de restos celulares, o que reduz o volume de sedimento do capilar. A Figura 3 mostra as consequências de muito pouco ou demais médio gradiente de densidade na etapa de centrifugação, em relação ao cérebro homogeneizado. A concentração de ajuste para a correta pode resolver este problema. Note que a velocidade de aceleração e desaceleração do centrifugador também pode afetar a formação da pelota capilar cerebral. Capilares também podem ser perdidos durante as etapas 6 a 7 se parte do material capilar varas para as pontas de pipeta. Esse problema pode ser resolvido completamente enxaguando cada ponta da pipeta antes de alterá-la. Durante a etapa 7, lavando os capilares do filtro de tensão da célula pode ser incompleta e/ou capilares podem aderir à borda do filtro. Isto pode ser evitado, verificando o filtro no microscópio, seguido por etapas de lavagem adicionais. Perda de capilares durante cada etapa do processo de isolamento pode resultar em uma pelota capilar insignificante ou não suficiente material capilar para posterior processamento e experimentação.
Isolar os capilares do cérebro de tecido humano fresco representa um modelo exclusivo barreira hemato - encefálica que se assemelha a situação na vivo . No entanto, existem várias limitações da técnica. Um desafio é a disponibilidade de tecido humano fresco. Como o PMI ideal é h ≤ 4, tecido cerebral, coletado em um PMI significativamente mais longo não será fresco o suficiente para algumas aplicações a jusante. Em alguns casos, pode ser difícil obter quantidades de tecido que são grandes o suficiente para vários grupos experimentais, restringindo assim, aplicações a jusante. Assim, isolar frescos capilares de roedores19, canino69, bovinos42ou tecido cerebral de suínos70 pode ser mais adequado para modelar a barreira sangue - cérebro. Fatores que determinam a variabilidade do cérebro humano, tais como idade, sexo, etnia, estado de doença, história de medicação, região do cérebro de amostra e PMI deve ser tida em conta quando a publicação dos dados e interpretação. A nível experimental é importante observar que capilares isolados incluem ainda pericitos, mas endfeet hamartomas são removidos através do procedimento de44. Ele precisa ser tomado em consideração que o modelo apresentado aqui serve como um modelo ex vivo da barreira hemato - encefálica (ou seja, as células endoteliais capilares), mas não como um modelo da unidade neurovascular.
Trabalhar com qualquer tecido humano sempre apresenta um risco de segurança inerente e pesquisadores devem tomar as devidas precauções durante o procedimento de isolamento para evitar a infecção. Especificamente, nos EUA, trabalho com tecido humano requer espaço designado laboratório BSL 2-certificada e inclui um gabinete de segurança biológica (classe A2). Além disso, a equipe deve usar equipamentos de proteção individual (i. e., jaleco, luvas e protetor de cara) e designado o equipamento para o trabalho com o tecido humano e implementar manipulação de resíduos biológicos perigosos. Estas medidas de segurança de execução é demorado, custo elevado e aumenta a dificuldade do processo, especialmente para o pessoal de laboratório inexperiente.
A barreira sangue - cérebro é altamente conservada entre os organismos com um bem definido de CNS71. Modelando a barreira sangue - cérebro humana é difícil porque há complexos neurovasculares acoplamento entre as células da unidade neurovascular. Um cérebro humano adulto estimou-se que em médios aproximadamente 86 bilhões de neurônios e acredita-se que quase cada neurônio tem seu próprio capilar na proximidade para garantir alimentação adequada com oxigênio e nutrientes de72,73. As células endoteliais capilares constituem a maior área de superfície da interface do sangue-cérebro (12 – 18 m2 para um ser humano adulto saudável). Junções apertadas representam um obstáculo para uma grande variedade de pharmacotherapeutics, bloqueando paracellular difusão de solutos. Além disso, numerosos estudos descrevem a disfunção da barreira em doenças neurodegenerativas, ex., doença de Alzheimer74curso75, epilepsia38,76, esclerose múltipla,77, e 28,de lesão cerebral traumática78. Assim, é imperativo estabelecer modelos que intimamente representam a barreira sangue - cérebro humana e permitam uma melhor compreensão da função de barreira na saúde e na doença.
Numerosas em vitro celular cultura da barreira sangue - cérebro existem modelos; especialista em avaliações sobre o assunto ver 41,,49,,51,69,79,80. Brevemente, ambos recentemente isolaram de células endoteliais capilares do cérebro para cultura primária e linhas de célula endotelial capilar imortalizado cérebro estão disponíveis. Culturas primárias de células endoteliais microvessel cerebral são utilizadas, principalmente, de rato, rato, porco e vaca. No entanto, culturas de células primárias são trabalhosas desde que as células devem ser isoladas recentemente. Linhas de célula endotelial capilar imortalizado cérebro estão disponíveis a partir do rato, rato e humanos e são menos trabalhosas, porque eles podem ser passados para o uso de longo prazo. No entanto, linhas celulares mesmo imortalizado têm um limite de quantas vezes eles podem ser passados antes de perder suas características endoteliais. Tanto as células primárias, bem como linhas de células imortalizado geralmente são cultivadas em placas para modelar o endotélio capilar cerebral e medir o transporte barreira de permeabilidade e drogas em toda a monocamada celular, imitando, assim, transporte de sangue-cérebro41 ,81,82. Os meios de cultura nesses modelos também pode ser modificado ou suplementado com astrócitos, pericitos ou outros fatores relevantes fisiologicamente como acampamento41,83,84.
A vantagem das linhas celulares imortalizado é sua relativamente fácil acesso e disponibilidade. Enquanto culturas de células endoteliais podem chegar até a confluência, perdem Propriedades da célula endotelial, como eles crescem lado a lado em uma monocamada. Por exemplo, culturas hCMECs exibir reduzida expressão de transportadores como P-gp, proteínas de junção apertada e exibição de permeabilidade variável de xenobióticos41. A Figura 4 mostra um Western blot P-gp na expressão de proteínas nas células de hCMEC/D3, em comparação aos capilares humanos recém isolados. Apesar de uma 10 vezes menor quantidade de proteína total, o sinal para a P-gp é mais forte em isolado capilares humanos em comparação com células hCMEC/D3. Isto indica que as células hCMEC/D3 perderam uma quantidade significativa de expressão de proteínas P-gp em cultura. Além disso, as diferenças em meios de cultura, meio ambiente e equipamento afetam medidas-chave de integridade de barreira, ou seja, medições de TEER em ensaios de placa Transwell. Alguns desses problemas podem ser superados utilizando o modelo de cérebro isolado capilar que representa mais de perto o humano barreira hemato - encefálica na vivo.
Capilares do cérebro isolados têm sido utilizados para uma ampla gama de estudos, incluindo genômica, proteômica, proteômica funcional e estudos de cellomics (Figura 5). Além disso, muitas técnicas e métodos existem para analisar o cérebro isolado capilares dentro de cada um desses campos. Notavelmente, as técnicas experimentais, mostradas na Figura 5 podem ser usadas em capilares de cérebro isolados de um número de fontes, incluindo o tecido humano, bovino, roedor e suíno, que possam facilitar a investigação de translação. Por exemplo, Li et al. 85 estudou a genoma da barreira sangue - cérebro usando hibridização subtrativa de supressão por purificar o mRNA isolado dos capilares do cérebro de rato. Além disso, Ott et al. 86 usado RT-PCR e qRT-PCR para estudar a regulamentação da P-gp por PXR. Muitos estudos proteômicos utilizam mancha3Dot Blot análise87, Western simples ensaios3,38, ELISA88,89, imunoprecipitação3, ocidental e immunostaining3,90,91. Discernir o transporte tráfico no endotélio cerebral, McCaffrey et al 92 usado fraccionamento subcelular dos capilares do cérebro isolado. Sánchez del Pino et al. 93usado vesículas de membrana endotelial bovina isolada para discernir a direção de localização e transporte de transporte através da barreira hemato - encefálica. Em outros estudos de proteômica, pesquisadores usaram cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem para quantificar proteínas de transporte94,95,96. Proteómica funcional estudos utilizaram transporte e ensaios de escapamento2,38. Et al . Hartz 2 usado zimografia para determinar a atividade da enzima em capilares de cérebro isolado. Além disso, o cellomic vasta pesquisa usando cultura de células tem gerado inúmeras linhas de células endoteliais e modelos da barreira hemato - encefálica82,83,84. Com estes modelos, ensaios comuns usados incluem ensaios de migração97,98, ensaios de toxicidade e viabilidade99e angiogênese ensaios98.
Capilares do cérebro isolado permitem a exata caracterização da expressão da proteína e atividade e descrição da sinalização de caminhos para a barreira hemato - encefálica. Isto é devido, em parte, ao conteúdo capilar do cérebro, que é apenas cerca de 1% (v/v). Assim, usar o cérebro inteiro homogeneizado ou fatias do cérebro como um substituto para células endoteliais capilares purificadas provavelmente resultará em uma pobre relação sinal-ruído,24. Além disso, após o isolamento, capilares do cérebro são viáveis pelo menos 6 h (dados não publicados do rato e do rato), que permite estudos discernir as vias de sinalização específicas. É aconselhável incluir um grupo de controle da mesma preparação.
Modelos representativos e de translação da barreira sangue - cérebro, tais como o modelo capilar isolado discutido neste relatório, são necessários para estudar a função de barreira na saúde e na doença. Aqui nós apresentamos um protocolo para obter os capilares do cérebro humano isolado em um bom rendimento e alta qualidade que pode servir como um modelo ex vivo da barreira sangue - cérebro. Capilares isolados conservam a sua estrutura original e função, que permite usá-los para um número de borne-isolamento molecular, bioquímica e ensaios fisiológicos. Deve ter cuidado ao manipular o tecido humano amostras, de preferência em um BSL 2 ou maior definição.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Queremos agradecer e reconhecer o Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson no banco de tecidos do cérebro de UK-ADC para fornecer o cérebro humano todas as amostras de tecido (número de concessão de NIH: P30 AG028383 do Instituto Nacional do envelhecimento). Agradecemos a Matt Hazzard e Tom Dolan, serviços de tecnologia da informação, tecnologia acadêmica e engajamento de professores, Universidade de Kentucky para assistência gráfica. Este projecto foi apoiado pelo 1R01NS079507 número da concessão do Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso (para B.B.) e 1R01AG039621 número de concessão do Instituto Nacional sobre o envelhecimento (para A.M.S.H).. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e derrame ou do Instituto Nacional sobre envelhecimento. Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Personal Protective Equipment (PPE) | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| Disposable Protective Labcoats | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended |
| Face Shield, disposable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended |
| Safety Materials | |||
| Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | to cover working areas |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | for used scalpels |
| Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 °C Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH Meter | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Dissecting Microscope | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | used to remove meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogenizer | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | used to freeze the tissue? |
| Voyager Pro Analytical Balance | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | used to check isolated capillaries | |
| Tools and Glassware | |||
| Finnpipette II Pipette 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | wash capillaries off filter |
| Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | resuspend pellet in BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | to mince brain tissue |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | to cover beaker and volumetric flask |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | to wash capillaries off filter |
| 60 mL syringe with Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | used with connector ring to filter capillaries |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | used for mincing |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | used to remove meninges |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 mL volume, clearance: 150-230 μm |
| Dounce Homogenizer | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volume, clearance: 80-130 μm |
| Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left |
| pluriStrainers (pore size: 30 µm) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| Connector Ring | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | reuse multiple time |
| 1 L Volumetric Flask | for preparation of Isolation Buffer | ||
| 1 L Beaker | for preparation of 1% BSA | ||
| Stir Bar | for preparation of 1% BSA and Ficoll® | ||
| Schott Bottle (60 mL) | for preparation of Ficoll® | ||
| Ice Bucket | to keep everything cold | ||
| 100 mm Petri dish | for mincing of brain tissue | ||
| Tissue Culture Cell Scraper | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | to remove supernatant after centrifugation |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use. |
| DPBS with Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - part of the Isolation Buffer |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use. |
| Glucose (D-(+) Dextrose) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM |
| Sodium Hydroxide Standard Solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | to adjust pH of the DPBS |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentration: 1 mM |
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