Summary
Изолированные мозга капилляров из ткани человеческого мозга может использоваться как доклинические модель для изучения барьерную функцию физиологические и патофизиологические условиях. Здесь мы представляем оптимизированный протокол изолировать капилляров мозга от ткани свежий человеческого мозга.
Abstract
Понимание blood - brain барьер функция физиологического и патофизиологические условиях имеет решающее значение для развития новых терапевтических стратегий, которые открывают для улучшения доставки лекарств мозга, улучшить защиту мозга и лечения головного мозга расстройства. Однако изучая человека blood - brain барьер функция является сложной задачей. Таким образом существует острая необходимость соответствующих моделей. В этой связи капилляров мозга, изолированы от человеческого мозга ткани представляют собой уникальный инструмент для изучения барьерную функцию как недалеко от положения человека в естественных условиях максимально. Здесь мы описываем оптимизированный протокол изолировать капилляров из ткани мозга человека в высокий урожай и неизменно высокое качество и чистоту. Капилляры изолированы от свежих человеческий мозг ткани с помощью механической гомогенизации, градиент плотности центрифугирования и фильтрации. После изоляции капилляры человеческий мозг может использоваться для различных приложений, включая утечки анализов, живых клеток и иммунной основе анализов для изучения белков и функции, активности ферментов или внутриклеточная сигнализация. Изолированные человеческий мозг капилляров являются уникальной модели для выяснения регуляции функции человека гематоэнцефалический барьер. Эта модель может обеспечить понимание патогенеза центральной нервной системы (ЦНС), которая будет способствовать развитию терапевтических стратегий для лечения расстройства ЦНС.
Introduction
Blood - brain барьер представляет собой жестко контролируемой интерфейс между кровью и мозга, которая определяет, что попадает в и выходит из мозга. Анатомически эндотелиальные клетки составляют blood - brain барьер и образует комплекс, непрерывной капиллярной сети. Физиологически капиллярная сеть поставляет мозга кислородом и питательными веществами при одновременно утилизации углекислого газа и продуктов обмена веществ. Важно отметить, что доказательства подтверждают, что изменения в барьер вклад многочисленных патологий, в том числе болезни Альцгеймера, эпилепсия и инсульта1,2,3,4,5 , 6 , 7. мозга, эндотелиальные клетки также служат барьером для лечения путем блокирования поглощения наркотиков в мозг, например., химиотерапии глиобластомы мультиформной после опухоль резекции8,9, 10. В этой связи изолированных человеческий мозг капилляры представляют собой уникальный ex vivo гематоэнцефалического барьера модель, напоминающей барьерные свойства в-vivo, который позволяет для изучения барьерной функции и дисфункции в области здравоохранения и болезни. В этой статье мы предоставляем протокол изолировать капилляров мозга от человеческого мозга в неизменно высокое качество капилляров и выход для изучения blood - brain барьер.
В 1969 году Siakotos и др. 11 были первыми сообщить изоляции капилляров мозга от ткани говядину и человеческого мозга, используя плотность градиентного центрифугирования и стекла бисера столбец разделения. Позже, Гольдштейн и др. 12 улучшить этот метод, добавив несколько фильтрации шаги для уменьшения количество ткани, необходимых для изучения капилляров мозга, изолированные от крыс, сохраняя при этом метаболической активности транспорта глюкозы. С тех пор исследователи оптимизированы процедуры капиллярного изоляции много раз, улучшение капиллярного модель метод и мозг с каждой итерации по13,,1415. К примеру, Pardridge и др. 16 изолированные говядину капилляров с помощью ферментативного пищеварения, а не механической гомогенизации, а затем впоследствии передается капиллярного подвеска через сетчатый фильтр 210 мкм и стеклянный шарик столбец. Эти изменения улучшить пятно исключения Трипановый синий изолированных мозга капилляров и таким образом повысить жизнеспособность эндотелиальных клеток. В начале 90-х годов Даллера и др. 17 изолированных говядину и крыса капилляров, которые были ясно нейрональных загрязнения и поддерживается метаболической активности, gamma-глютамил транспептидаза (γ-GTase) и щелочной фосфатазы. В 2000 году Миллер и др. 18, используется изолированных крыса и свиного мозга капилляров в сочетании с confocal микроскопии Показать накопление транспорта субстратов в просвете капилляров. Впоследствии наша лаборатория продолжает оптимизировать процедуры капиллярного изоляции мозга и мы создали транспорта анализов для определения Р-гликопротеина (P-gp)19,20,21, рак молочной железы сопротивление белка (BCRP)22,23и множественной лекарственной устойчивости белка 2 (Mrp2)24 транспортной деятельности. В 2004 году мы опубликовали два доклада, где мы использовали изолированные крыса капилляров мозга для расследования различных сигнальных путей. В Hartz и др. 21, мы обнаружили, что пептид эндотелина-1 быстро и обратимо сократить функции транспорта P-gp в капилляров мозга, действуя через эндотелина рецептор B (BET) рецептор, синтаза оксида азота (NOS) и Протеинкиназа С (PKC). В Бауэр и др. 19, мы продемонстрировали выражение рецептора pregnane X ядерных рецепторов (PXR) и показал PXR-модуляция функции P-gp выражение и транспорта в капилляров мозга. В экспериментах с трансгенных мышей гуманизированные PXR мы расширили эту линию исследований и показал в естественных условиях ужесточения барьера по upregulating P-gp через hPXR активации25. В 2010 году Hartz и др. 26 использовать этот подход для восстановления P-gp белков и перевозочная деятельность трансгенных человеческих амилоида прекурсоров протеина (Хапп) мышей, которые overexpress hAPP. Кроме того восстановление P-gp в hAPP мышей значительно сокращен40бета амилоида (значения) и значения42мозга уровнях.
Помимо изучения сигнальных путей, изолированные мозга капилляров может использоваться для определения изменений в проницаемость капилляров, который мы называем капиллярной утечки. В частности Техас красный утечки пробирного используется для оценки утечки Люминесцентную краску, Техас красный от капиллярного просвета со временем и эти данные затем используются для анализа масштабов утечки. Увеличение капиллярной утечки, по сравнению с теми из капилляров управления указывают изменения в физической неприкосновенности blood - brain барьер2. Это ценно, потому что есть многочисленные государства болезни, связанные с нарушением барьер, например., эпилепсия, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и черепно-мозговой травмы27,28,29, 30. Другие группы также использовали изолированные капилляров различать сигнальных путей, которые регулируют выражение протеина и транспортной деятельности белки31,,3233,34, 35,,3637. Наконец мы продолжаем оптимизировать этот метод для изоляции капилляров мозга человека, и недавно мы показали увеличение выражение P-gp на человека blood - brain барьер у пациентов с эпилепсией, по сравнению с захватом свободных управления лиц38 . Взятые вместе, эти события свидетельствуют, что изолированные мозга капилляров может служить универсальная модель для изучения барьерную функцию.
Различные in vivo, ex vivoи в пробирке blood - brain барьер модели были использованы в фундаментальные исследования и промышленные наркотиков скрининг, главным образом с целью тестирования доставки лекарств в мозг39,40,41 ,42,,4344. В дополнение к изолированной ex vivo капилляров мозга текущие blood - brain барьер модели включают в silico модели, в пробирке клеточной культуры изолированных мозга капиллярных эндотелиальных клеток или увековечен клеточных линий из различных видов, в пробирке культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), которые дифференцируются в капиллярных эндотелиальных клеток мозга и microfluidic модели на чипе.
В silico модели наиболее часто используются в разработке лекарств для отбора кандидатов наркотиков на основе прогнозируемых поглощения, распределение, метаболизм и экскрецию (ADME) свойства. Методы, такие как количественные структура свойства отношения (QSPR) и количественные структура активность отношения (QSAR) модели являются популярные методы, используемые в высокопроизводительного скрининга библиотек для прогнозирования мозга проникновения наркотиков кандидатов 45 , 46. Эти модели являются полезными для экрана молекул барьер проникновения свойств.
Betz и др. 47 создана монослои искусственный мозг капиллярных эндотелиальных клеток как система гематоэнцефалического барьера модель в пробирке . В vitro клетки культуры моделей с использованием свежие ткани или увековечен эндотелиальных клеток линии как эндотелиальные клетки человеческого мозга microvessel (hCMECs) может быть еще одним инструментом высокопроизводительного скрининга для проникновения мозга или механистической исследования. Однако модели культуры капиллярных эндотелиальных клеток мозга не хватает физиологического касательное напряжение внутри просвета капиллярного кровотока, ограничены в целом биологических сложности и претерпевают изменения в выражение и локализация компонентов важный барьер такие жесткие соединения белков поверхности рецепторы, транспортеры, ферменты и ионных каналов48,,4950. И наоборот эндотелиальных монослои, производный от hPSCs, имеют низкий сахарозы проницаемости по сравнению с hCMEC/D3 культур и содержат поляризованные выражение некоторых blood - brain барьер перевозчиков, молекулы адгезии и плотных51, 52. Однако, эти клетки также подлежат изменению свойств в культуре, и системы должны быть проверены для своего резюме в vivo барьерные свойства52.
Новые тенденции в blood - brain барьер исследования включают в себя использование систем 3D культуры ткани для создания искусственных капилляров, используя технологию орган на чипе для создания microfluidic приборы, или используя полые волокна технологии53, 54 , 55. искусственные капилляров, однако, имеют значительно больших диаметров (100 – 200 мкм) чем капилляров мозга (3 – 7 мкм). Следовательно, сдвига силы в vitro не напоминают полностью ситуацию в естественных условиях . Этот вопрос рассматривается в «blood-brain-barrier-on-a-chip» microfluidic приборы, где искусственных оболочек формы «кровь» и «мозг» отсеков и жидкости перекачивается через эти устройства генерации microfluidic сдвига. Аналогичным образом, Сопредседатель культур клеток сосудистой гладкой мускулатуры и эндотелиальных клеток в различных комбинациях с Астроциты также были использованы с технологией полые волокна для воссоздания реологические параметры под в vivo условий56 , 57 , 58. Однако, неясно, насколько хорошо эта модель отражает другие свойства blood - brain барьер, таких, как транспорт, метаболизм, сигнализации и др. Эти искусственные капилляров и чип модели подходят для высокопроизводительного скрининга наркотиков, но и ячейки, используемые для создания этих моделей также могут изменяться во время культуры.
Замороженные и фиксированной мозга ломтиками или первичного мозга, которые культур капиллярных эндотелиальных клеток являются дополнительные модели, которые могут использоваться дляизучения человеческого microvasculature5,59,,6061. Например иммуногистохимия фиксированной мозговой ткани, используется для определения белков локализации и выражение в здоровых по сравнению с пораженной ткани.
Помимо тканей срезы и модели в пробирке капилляров мозга свежевыделенных, описанные выше могут быть использованы для изучения функции гематоэнцефалического барьера. Ограничения этой изолированной капиллярного модели включают в себя трудности, чтобы получить свежие человеческий мозг ткани, отсутствие астроциты и нейронов и относительно длительной изоляции процесса. Преимущество капилляра модели изолированных мозга состоит в том, что эта модель напоминает ситуацию в естественных условиях и, следовательно, может использоваться для характеристики барьерной функции и дисфункции. Важно отметить, что она может использоваться также различать сигнальных механизмов, с помощью множества анализов и молекулярных методов3,19,,6263.
Наша лаборатория имеет доступ к ткани как свежие и замороженные человеческий мозг через Сандерс-Браун центр по проблемам старения (СИБ #B15-2602-M)64. В этом контексте вскрытия следовать стандартным протоколом, мозги, полученные в < 4 h и все процедуры соответствуют руководящим принципам наилучшей практики NIH биопрепаратов65. Этот уникальный доступ к ткани человеческого мозга, мы создан и оптимизирован протокол изолировать капилляров мозга от ткани человеческого мозга, что приводит к высокой урожайности нетронутыми, жизнеспособных человеческий мозг капилляров. Две общих конечных точек интереса должны определить выражение протеина и деятельности. В этой связи мы и другие создали различные анализы, которые могут использоваться с изолированной черепно-мозговой капилляров для изучения белков и уровень активности. Эти анализы включают в себя Западный blotting, простой Западной пробирного, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР), Зимография, анализов деятельности транспорта, и капиллярной утечки анализов. Эти анализы позволяют исследователям изучить изменения в функции барьера в патологических условиях жизни людей, определить пути, которые регулируют выражение протеина и деятельности и определить фармакологических цели для лечения blood - brain барьер связанные заболевания.
Вместе, в свежей изолированных мозга капилляров может служить в качестве надежных и воспроизводимых моделью blood - brain барьер. Особенно эта модель может сочетаться с много различных анализов для определения широкий спектр конечных точек для изучения барьерную функцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Приводимая ниже информация основана на текущей безопасности и нормативных стандартов в университете Кентукки, Лексингтон, Кентукки, США. Предосторожности обратитесь к программе института биологической безопасности и самые последние правила и рекомендации перед началом работы с тканей человека.
Предупреждение: Человеческие ткани может быть источником патогенов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гепатита в (HBV), вирус гепатита С (HCV) и другие. Работа с тканей человека создает риск инфицирования от патогенов. Поэтому некоторые соображения, регулирования и безопасности необходимы при работе с человеческой ткани для защиты персонала лабораторий. Работа с тканей человека в США требует лаборатории 2-го уровня биобезопасности, а также меры предосторожности и обучение в соответствии с низ раздел IV-B-7, OSHA Закон 1970 года положение 5(a)(1) и программы институциональных биологической безопасности пользователя. В общем институциональные Комитета по биобезопасности и/или институциональных Наблюдательный Совет разрешение должно быть получено до проведения каких-либо исследований с участием человека материалы (ткани, жидкости организма). Обучение является обязательным для всех сотрудников, работающих с материалами, человека и включает в себя основные лаборатории безопасности подготовки, например, химическая гигиены и лаборатории безопасности, а также специальную подготовку по вопросам биологической безопасности, опасными отходами и человека патогенов. Всех сотрудников, работающих с материалами, человека настоятельно рекомендуется получить прививки гепатита B, до работы с материалами, человека. Сотрудники обязаны носить конкретных средств индивидуальной защиты при работе с человека материалы, например., манжетами халате и лицо щит и носить перчатки во все времена. Вся работа выполняется в области биобезопасности кабинета (класс 2). Все оборудование, которое приходит в контакт с материалов человека и любые отходы от человека материалы обрабатываются надлежащим образом для предотвращения загрязнения и/или инфекции персонала. Все оборудование и поверхности очищаются с 10% отбеливателя и 75% этанола после каждой процедуры с участием человека материалы. Разлив с человека материалы должны немедленно очищены. Посуда из автоклавного после каждого использования. Отходы, включая незаписанных тканей человека, собранные в обозначенные биологически опасных отходов мешок и газобетона. Колюще-режущие предметы собраны в прокол и герметичности контейнера, помечены как зараженные. Все отходы из материалов человека утилизировать согласно правил биологической безопасности учреждения.
Примечание: Наша лаборатория получает свежий лобной коры образцы из умерших лиц через Сандерс-Браун центр по проблемам старения (СИБ #B15-2602-M). Критерии включения: зачисление в Великобритании-ADC продольной вскрытие когортное исследование и Post-Mortem интервал (PMI) ≤4 h64. Вскрытия следовать стандартный протокол и все процедуры соответствовали руководящим принципам наилучшей практики NIH биопрепаратов65. Короткий PMI меньше чем 4 h имеет первостепенное значение для обеспечения жизнеспособности капиллярного после изоляции. Свежие и замороженные ткани могут быть использованы. При необходимости замораживание, недавно полученные человеческий мозг ткани должен быть шок замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C. Свежие или талой ткани должны храниться в буфере изоляции (см. ниже) и обрабатываются быстро. Мы находим что 10 г свежих тканей человека урожайность около 100 мг капилляров мозга (живого веса).
1. Установка
-
Подготовка буфера
Примечание: Объем буфера необходимо зависит количество ткани. Все тома буфера в следующий протокол основаны на 10 г ткани коры мозга человека.- L изоляции буфера: Использовать 1,5 Л Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS; 2,7 мм KCl, 1.47 мм х2PO4, 136.9 мм NaCl, 8,1 мм Na2HPO4, 0,9 мм2CaCl, 0.49 мм MgCl2) и дополнить с 5 мм D-глюкоза (1,35 г ) и пируват натрия 1 мм (0,165 g). После добавления глюкозы и пирувата, приспособиться к рН 7,4 с гидроксида натрия. Охладить и хранить буфера до 4 ° C перед использованием.
- Бычьим сывороточным альбумином (БСА): Добавьте 10 г порошка BSA в 1 Л изоляции буфера для окончательного БСА концентрации 1%. Движение медленно, чтобы избежать пузырей, приспособиться к рН 7,4 и хранить при 4 ° C на ночь. Непосредственно перед использованием аккуратно перемешать; Избегайте, образуя пузыри, чтобы избежать денатурации альбумина.
- Средний градиент плотности: весят 18 g средний градиент плотности в стеклянной бутылке и добавить панель магнитные перемешать. Добавьте 60 мл буфера изоляции и shake энергично за 5 мин до тех пор, пока все порошок приостановлены. Магазин на ночь при 4 ° C, чтобы позволить градиент средней плотности распустить. Мешайте в течение 10 мин прямо перед использованием.
- Хранить все буферы при температуре 4 ° C; Держите все инструменты и буферы на льду во время процедуры всей изоляции. Перемешайте все буферы перед использованием.
-
Экспериментальные установки
- Смонтируйте пестик Поттер-Elvehjem ткани точильщика на электронных накладных мешалкой. Точильщик ткани место Поттер-Elvehjem и Dounce гомогенизатор с пестиком на льду под капотом. Подготовить сетку фильтра 300 мкм (5 x 5 см2), сложить его на конус и вставить и прикрепить его к 50 мл трубки сокола с лентой (рис. 1A).
- Место соединения кольца и клеточной штамм фильтры (размер пор: 30 мкм) на 50 мл пробирок Falcon. Подготовьте зараженные отходы сумки. Поместите все необходимое оборудование в области биобезопасности кабинета (см. Таблицу материалы).
2. мозг пробоподготовки
Примечание: На рисунке 1A показана диаграмма рабочего процесса изоляции всей процедуры, описанной ниже. Ткани человеческого мозга может вытекать из любой части коры и могут быть использованы свежие или замороженные. Замороженные мозговой ткани можно разморозить при комнатной температуре (не буфера; ~ 30 мин 10 g). Для достижения сопоставимых результатов, мозговой ткани должны быть получены из того же региона мозга для каждого эксперимента. Этот протокол оптимизирован для свежих (PMI < 4 h) человеческого головного мозга, что не были заморожены.
- Подготовка ткани человеческого мозга: документ вес ткани мозга. Все номера в следующий протокол являются подходящими для 10 г свежих человеческий мозг ткани. Место ткани мозга в 100 мм Петри. Осторожно удалите все мозговых оболочек с щипцами. Используйте скальпель отрезать белого вещества.
- Измельчения ткани человеческого мозга: тщательно резать ткани мозга и фарш с помощью скальпеля. Фарш для около 5 мин (2-3 мм шт). Передать точильщика Поттер-Elvehjem ткани ткани мозга. Добавьте 30 мл буфера изоляции.
Примечание: Кусочки рубленого ткани трудно понять, поскольку ткани мозга превращается в месиво через процесс размола.
3. гомогенизации
- Поттер-Elvehjem ткани мясорубку (распродажа: 150-230 мкм): однородный каждого образца с 100 ударов на скорости гомогенизатора 50 об/мин. Документ время каждые 25 штрихов и общее время, необходимое для 100 ударов. Приведены в таблице 1 для гомогенизации предлагаемого протокола; Общее время для гомогенизации 10 g человека лобной коры составляет около 22 мин. Не перемешивать в воздухе для предотвращения пузырей.
- Dounce гомогенизатора (распродажа: 80-130 мкм): передать Dounce гомогенизатор огневки на льду. Однородный подвеска с 20 ударов (~ 6 s/инсульт, всего ~ 2 мин). Избегайте пузырей.
4. центрифугирования
- Равномерно огневки мозга в четыре 50 мл трубки центрифугирования и документа общий объем огневки. Распространите 50 мл буфера градиента плотности в центрифугирования трубы (12,5 мл на трубу). Использование 10 мл буфера изоляции прополощите толкателем и гомогенизатор, и распространять в четырех труб центрифугирования (~2.5 мл на трубу).
- Плотно закройте пробирок с крышками. Смешайте огневки, средний градиент плотности и буфера, энергично встряхивать трубы. Центрифуга на 5800 x g 15 мин при температуре 4 ° C (фиксированный угол ротора); Выберите среднего замедления скорости держать Пелле, прилагается к трубе. Отменить супернатант и Ресуспензируйте каждой гранулы в 2 мл 1% BSA.
5. Фильтрация
Примечание: Чтобы отделить капилляры от красных кровяных клеток и других клеток мусора, несколько этапов фильтрации являются необходимыми.
- 300 мкм сетки: после повторного приостановления гранулы, фильтр подвеска через сетку 300 мкм. Капилляры фильтруются через сетку, тогда как более крупные суда и больше мозга мусора остаются на сетку. Тщательно промойте сетку с до 50 мл 1% BSA. Отказаться от сетки.
Примечание: Этот шаг фильтрации очищает капиллярного подвеска от любых крупных судов или куски мусора мозга. -
30 мкм клеток штамма фильтр
Примечание: Этот шаг фильтрация отделяет капилляры от красных кровяных клеток и другого мусора мозга.- Распространите капиллярной фильтрата из шага 6.1 течение пяти 30 мкм клеток штамма фильтры (около 10 мл капиллярного фильтрата в ячейке штамм фильтр). Капилляры сдерживается этот фильтр, в то время как красные кровяные клетки, другие единичных клеток и небольших мозга мусора проходят через фильтр и собраны в фильтрат.
- Мыть каждый фильтр с 25 мл 1% BSA. Впоследствии Залейте все фильтратами шестой фильтр для повышения урожайности. Мыть каждый фильтр с 50 мл 1% BSA; Держите клетки штамм фильтры с содержащие капилляров и отбросить фильтрата.
6. Капиллярная коллекции
- Переверните фильтры и мыть капилляров с 50 мл 1% BSA для каждого фильтра в 50 мл трубки. Осторожно применять давление кончиком пипетки 5 мл дозаторов и переместить его через фильтр, чтобы смыть капилляров мозга.
- Убедитесь в том смыть все капилляров мозга, особенно от ОПРАВЫ фильтра. Избегайте пузыри, так как это затрудняет процесс фильтрации и увеличивает вероятность капиллярного потери.
7. мытье
- После сбора капилляров, центрифуга все образцы на 1500 x g 3 мин при температуре 4 ° C (размахивая ведро ротора). Удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в приблизительно 3 мл буфера изоляции. Объединить все ресуспензированы гранулы от одного образца в 15 мл Конические трубки и заполнить его с буфером изоляции. Центрифуга снова на 1500 x g 3 мин при температуре 4 ° C и промыть еще два раза.
- Документ капиллярного чистоты с Микроскоп (100 крат) и камеры (рис. 1B).
Примечание: Мозг капиллярного доходность от 10 г ткани человеческого мозга обычно около 100 мг. Изолированные мозга капилляров теперь может использоваться для экспериментов, обрабатываются (например., lysate, изоляция мембраны), или быть флэш замороженные и хранятся при температуре-80 ° C в cryotubes как минимум 6-12 месяцев (избежать несколько циклов замораживания оттаивания).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляции от ткани человеческого мозга выход подвеска, обогащенный капилляров мозга человека (рис. 1B) с небольшим количеством более крупных судов, красных кровяных клеток, другие отдельные ячейки и некоторые ячейки мусора. Разветвленных некоторые капилляров, и, в некоторых, красные кровяные клетки захваченного в капиллярной люмен. Типичный капилляров диаметром 3 – 7 мкм и составляет около 100-200 мкм длиной с открытым люмен; Большинство капиллярного концы свернуты. С помощью конфокальной микроскопии, изолированные человеческий мозг капилляров показывают, трубчатые, нетронутыми структуры и морфологии. Рисунок 2A показывает, что представитель передал свете изображение человеческого мозга с прилагаемой перицит и красных кровяных клеток в просвет капилляра. В соответствии с предыдущими докладами по структуре изолированных мозга капилляров12,17,18выводов относительно диаметра, размер и морфология все. Изолированные капилляров в Рисунок 2B человеческий мозг был immunostained для P-gp (зеленый) с помощью C219 как основное антитело (1 мкг/мл); ядра были counterstained с DAPI (1 мкг/мл).
Рисунок 1: схема для капиллярной изоляции. (A) пиктограмма иллюстрирует основные шаги процедуры, чтобы изолировать капилляров мозга от свежей человеческой ткани. (B) картина показывает изолированных человеческий мозг капилляров под микроскопом света непосредственно после изоляции (100 крат). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: изолированные человеческий мозг капилляра. (A) A, свет передается изображение изолированных капилляров мозга человека. (B) Конфокальный микроскоп изображение показывает капиллярного immunostained изолированные человеческого мозга для P-gp (зеленый; C219 1 мкг/мл); ядра были counterstained с DAPI (синий; 1 мкг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Устранение неполадок плотность центрифугирования. Пиктограмма показывает подготовку после плотность градиентного центрифугирования. В нем освещаются последствия слишком много и слишком мало градиент средней плотности и как это влияет на разделение и результате капиллярного Пелле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: P-gp белков в изолированных человеческий мозг капилляров. Западная помарка показывает сильный полос для P-gp (1 мкг/мл) в изолированных человека капилляры, по сравнению с hCMEC\D3 клеток. Β-актина был использован как контроль погрузки (1 мкг/мкл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: приложения для изолированных человеческий мозг капилляров. В литературе опубликован обзор наиболее распространенных приложений для изолированных мозга капилляров. Изолированные капилляров были использованы для: 1) геномики85,86, 2) протеомики3,38,,8788,,8990, 91,,9294,,9596, 3) функциональной протеомики2,38и 4) целломике82, 83,-84,-97,-98,-99. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Штрихи | Время [мин] |
| 1 – 25 | 7-7,5 |
| 26-50 | 5 – 5,5 |
| 51-75 | 5 – 5,5 |
| 76-100 | 5 – 5,5 |
| Общее время: | 22-24 мин |
Таблица 1: протокол гомогенизации. Гомогенизация протокол для Поттер-Elvehjem ткани мельницы для гомогенизации 10 g человека лобной коры со скоростью гомогенизации 50 об/мин. Обратите внимание, что первые несколько ударов требуют дополнительного времени для гомогенизации фарша ткани. После этого первоначального гомогенизации, каждый stroke является 12 s в продолжительности (6 s для нисходящего движения, 6 s для восходящего движения). Таким образом после первоначального гомогенизации, может осуществляться 5 ударов в 1 мин, или 25 штрихов в 5 мин.
| Проблема | Возможная причина | Решение |
| Не капиллярный Пелле | 1) неправильно Ficoll концентрация | 1) регулировать концентрацию Ficoll |
| 2) скорость неверно центрифугирования | 2) отрегулируйте скорость центрифугирования | |
| 3) неправильное ускорение или замедление скорости | 3) отрегулируйте ускорение или замедление скорости | |
| Низкая урожайность капилляров | 1) мозговых оболочек, преграждать шаги фильтрации | 1) удалите все мозговые оболочки до фильтрации |
| 2) слишком много капилляров потерял во время процедуры изоляции | 2) правильно рассчитать концентрацию буфера, промыть пипетку советы | |
| 3) промывки капилляров с PluriStrainer фильтры недостаточно | 3) Переверните фильтры и внимательно осмотрите для капилляров (использование микроскопа) | |
| 4) избыток пузырьков во время resuspensions | 4) пипетки медленно, чтобы избежать пузырей | |
| Нежизнеспособных капилляров | 1) Расширенная посмертные интервал | 1) если возможно уменьшить интервал или использовать оснастки замороженные мозги |
| 2) использование замороженных ткани для изоляции | 2) использовать свежие ткани | |
| 3) время изоляции процедуры слишком долго | 3) оптимизировать рабочий процесс | |
| 4) оборудование/буферы не хранились на льду во время процедуры изоляции | 4) Держите оборудование и буферы на льду во время изоляции |
Таблица 2: Устранение неполадок общих проблем. Список наиболее распространенных ошибок и проблем, которые возникают во время процедуры изоляции и как они могут быть решены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий Протокол описывает изоляции нетронутыми и жизнеспособной человеческий мозг капилляров из свежих ткани. В этом разделе мы подробно обсудить следующее: 1) изменения к протоколу, 2) устранение общих ошибок, 3) ограничения техники, 4) значение модели в отношении существующих и альтернативных blood - brain барьер модели, и 5). потенциальные приложения для изолированных человеческий мозг капилляров.
Протокол, описанные здесь оптимизирован для 10 г свежих человека лобной коры ткани. Однако, это довольно просто изменить этот порядок: 1) более или менее чем 10 г ткани, 2) замороженные мозговой ткани или ткани 3) мозга от мозга регионе помимо лобной коры. Во-первых с более или менее, чем 10 г ткани головного мозга, необходимый объем буферов может просто масштабироваться вверх или вниз имеющиеся количество ткани. Таким образом если только 5 g ткани головного мозга, наполовину следует сократить объем буферов. Во-вторых мы описываем капиллярного изоляции, которые используются свежие мозговой ткани, но замороженные ткани могут быть использованы, если свежие ткани является недоступным38. В-третьих мы использовали свежие мозговой ткани, взяты из лобной коры, но капилляры могут быть изолированы от других областей коры головного мозга, если есть достаточно доступные ткани. Это также можно изолировать капилляры от не коры мозга (например., белого вещества), но эти регионы имеют различные клетки композиции и капиллярной плотность 66,67,68. Таким образом, используя ткани из области различных мозга скорее всего потребует протокол быть скорректирована (например, объем буфера, градиент средней плотности, скорость центрифугирования, или количество шагов фильтрации).
Капиллярные изоляции процедура, хотя не сложные таковой, чувствителен к малых возмущений или изменения в протоколе. Изменения может привести к снижению капиллярного урожайности или снижение жизнеспособности капилляров. Таблица 2 описываются наиболее распространенные ошибки и проблемы, которые возникают во время изоляции и перечислены советы, чтобы избежать этих ошибок и решения для устранения неполадок, если они происходят. Наиболее распространенные проблемы, связанные с процедурой является низкая доходность капилляров. Потеря капилляров часто нарастающая сумма малых потерь на каждом шагу и это из-за незначительных отклонений по всей процедуры. Важным шагом в это большое количество капилляров могут быть потеряны плотность центрифугирования. Неправильные концентрация в буфере приводит к неправильной плотности отделить капилляры от сотовой мусора, что уменьшает объем капиллярного Пелле. Рисунок 3 показывает последствия слишком мало или слишком много градиент средней плотности в центрифугирования шаг по отношению к мозг огневки. Адаптация к правильной концентрации может решить эту проблему. Обратите внимание, что ускорение и замедление скорости центрифуги может также повлиять на формирование гранул капилляров мозга. Капилляров также могут быть потеряны во время шаги 6 – 7 Если частью капиллярный Материал прилипает к наконечники. Этот вопрос тщательно ополоснуть каждый наконечник пипетки перед его изменением. Во время шага 7 смыть капилляров из клеток штамма фильтра может быть неполным или капилляров может придерживаться края фильтра. Этого можно избежать, установив фильтр под микроскопом, следуют шаги дополнительной стирки. Теряя капилляры во время каждого шага процедуры изоляции может привести к незначительным капиллярного гранул или недостаточно капиллярный материал для дальнейшей обработки и экспериментов.
Изоляция капилляров мозга от свежей человеческой ткани представляет уникальный гематоэнцефалического барьера модель, которая очень напоминает ситуацию в естественных условиях . Однако существуют некоторые ограничения техники. Одной из проблем является наличие свежей человеческой ткани. Как оптимальный PMI ≤4 h, мозговой ткани, собранных на значительно дольше PMI не будет достаточно свежий, для некоторых приложений, вниз по течению. В некоторых случаях это может быть трудно получить ткани сумм, которые являются достаточно большими для нескольких экспериментальных групп, тем самым ограничивая нисходящие приложения. Таким образом изолируя свежие капилляры от грызунов19, собак69, говядину42или свинину70 мозговой ткани может быть более подходящим для моделирования blood - brain барьер. Факторы, которые определяют изменчивость человеческого мозга ткани, такие как возраст, пол, этническая принадлежность, болезненное состояние, лечение истории, область мозга образца, и PMI должны учитываться при толковании и публикации данных. На экспериментальном уровне важно отметить, что изолированные капилляров по-прежнему включают в себя pericytes, но Астроцитарная endfeet удаляются путем процедуры44. Необходимо принимать во внимание, что модель, представленная здесь служит как модель ex vivo blood - brain барьер (то есть, капиллярных эндотелиальных клеток), но не как модель блока нервно-сосудистых.
Работа с любых тканей человека всегда представляет присущие опасности и исследователи должны принять соответствующие меры предосторожности во время процедуры изоляции, чтобы избежать инфекции. В частности в США, работа с тканей человека требует пространства назначенной лаборатории BSL 2 сертифицированных и включает в себя шкаф биобезопасности (класс A2). Кроме того, сотрудники должны использовать средства индивидуальной защиты (т.е., лаборатории пальто, перчатки и щит) и оборудования для работы с человеческой ткани и реализации биологически обращения с отходами. Реализация этих мер безопасности является длительным, дорогостоящими и увеличивает сложность процедуры, особенно для неопытных лабораторного персонала.
Blood - brain барьер высоко сохраняется среди организмов с четко определенными ЦНС71. Моделирование человека blood - brain барьер трудно, потому что есть комплекс нервно-сосудистого муфты среди клеток блок нервно-сосудистых. Подсчитано, что мозг взрослого человека в среднем около 86 миллиардов нейронов и считается, что почти каждый нейрон имеет свой собственный капилляров в близости для обеспечения надлежащего снабжения кислородом и питательными веществами72,73. Капиллярных эндотелиальных клеток являются крупнейшей площади поверхности гематоэнцефалический интерфейса (12 – 18 m2 для здорового взрослого человека). Плотных представляют собой препятствия для широкого круга pharmacotherapeutics, блокируя параклеточный диффузии растворенных веществ. Кроме того, многочисленные исследования описывают дисфункции барьер в нейродегенеративных расстройств, например., болезнь Альцгеймера74, ход75, эпилепсии38,76,77рассеянный склероз, и черепно-мозговой травмы28,78. Таким образом крайне важно разработать модели, которые тесно представляют человека blood - brain барьер и позволяют лучше понять барьерной функции в здоровье и болезни.
Существуют многочисленные в vitro клетки культуры модели blood - brain барьер; обзоры экспертов по этому вопросу см. 41,49,,5169,,7980. Кратко как свеже изолированные капиллярных эндотелиальных клеток мозга для первичной культуре и увековечен мозга капиллярных эндотелиальных клеток линии доступны. Основных культур эндотелиальных клеток головного мозга microvessel в основном используются от мыши, крысы, свиньи и коровы. Однако культуры главной ячейки являются трудоемкими, поскольку клетки должны быть свежевыделенных. Увековечен мозга капиллярных эндотелиальных клеток линии доступны от мыши, крыс и человека и менее трудоемким, потому что они могут быть пассированной для долгосрочного использования. Однако даже увековечен клеточных линиях имеют ограничение на как часто они могут быть пассированной проиграл их эндотелиальных характеристики. Главные ячейки, а также увековечен клеточных линий часто выращиваются на пластины для моделирования эндотелия капилляров мозга и измерить барьер проницаемость и наркотиков транспорта через монослое клеток, тем самым имитируя крови к мозгу транспорта41 ,,8182. Культуры средств массовой информации в этих моделях также могут быть изменены или дополнены астроциты, pericytes или других физиологически соответствующие факторы, как лагерь41,,8384.
Преимуществом увековечен клеточных линий является их относительно легкий доступ и доступность. В то время как искусственный эндотелиальных клеток можно достичь слияния, они теряют свойства эндотелиальных клеток, как они растут бок о бок в монослое. Например искусственный hCMECs отображения снижение выражение перевозчиков как P-gp, туго Джанкшен белков и отображения переменной проницаемости ксенобиотиков41. На рисунке 4 показана западную помарку для P-gp белков в клетках hCMEC/D3, по сравнению с свежевыделенных человека капилляров. Несмотря на десятикратного меньшее количество общего белка сигнал для P-gp сильнее в изолированных человека капилляры, по сравнению с hCMEC/D3 клеток. Это означает, что hCMEC/D3 клетки потеряли значительное количество P-gp выражения протеина в культуре. Кроме того различия в культуре средств массовой информации, окружающей среды и оборудования влияют на ключевые меры барьер целостности, то есть, ТЕЕР измерения в Transwell пластина анализов. Некоторые из этих вопросов могут быть преодолены путем использования изолированной черепно-мозговой капиллярного модель, которая более тесно представляет человека гематоэнцефалический барьер в естественных условиях.
Изолированные мозга капилляров были использованы для широкого круга исследований, в том числе геномики, протеомики, функциональной протеомики и целломике исследования (рис. 5). Кроме того многие методы и методы существуют для анализировать капилляры изолированных мозга в рамках каждой из этих областей. В частности экспериментальные методы, показанный на рисунке 5 может использоваться на капилляров мозга, изолированных от ряда источников, включая человека, говядину, грызунов и свинину ткани, которая может облегчить трансляционного исследования. Например, Li et al. 85 учился геномики blood - brain барьер с помощью подавления субтрактивный гибридизации, очищающая мРНК, изолированных от капилляров мозга крысы. Кроме того, Отт и др. 86 используется для изучения регуляции P-gp, PXR RT-PCR и qRT-PCR. Многие протеомических исследований использовать западной blotting3, Dot блот анализ87, простой Западной анализов3,38, ELISA88,89, иммунопреципитация3, и иммуноокрашивания3,,9091. Различать транспортер, торговля в мозг эндотелия, Маккефри et al. 92 используется субцеллюлярные фракционирование изолированных мозга капилляров. Санчес-дель-Пино и др. 93используется изолированных говядину эндотелиальной мембраны везикулы различать транспортер расположение и транспорт направление через гематоэнцефалический барьер. В других протеомических исследований исследователи использовали жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии тандем для количественного определения транспортер белки94,,9596. Функциональные протеомических исследований использовали транспортер и утечки assays2,38. Олень и др. 2 используется Зимография для определения активности ферментов в изолированных мозга капилляров. Кроме того обширные cellomic исследования с помощью клеточной культуры вызвало многочисленные линии эндотелиальных клеток и модели blood - brain барьер82,,8384. С этими моделями используются общие анализы включают миграции анализов97,98, жизнеспособность и токсичности анализов99и ангиогенез анализов98.
Капилляры изолированные мозга позволяют Точная характеристика белков и деятельности и описание сигнальные пути на blood - brain барьер. Это объясняется, в частности, содержание капилляров мозга, который является только около 1% (v/v). Таким образом используя весь мозг огневки или срезы мозга в качестве заменителя для очищенного капиллярных эндотелиальных клеток скорее приведет к плохой сигнал шум коэффициент24. Кроме того после изоляции, капилляров мозга являются жизнеспособными для по крайней мере 6 h (неопубликованные данные от крыс и мышей), которая позволяет исследования для выявления конкретных сигнальных путей. Рекомендуется включить контрольную группу от же подготовки.
Представительный и трансляционная модели blood - brain барьер, например изолированных капиллярного модель, обсуждаемые в настоящем докладе, необходимы для изучения барьерную функцию в здоровье и болезни. Здесь мы представляем протокол для получения изолированных человеческий мозг капилляров на хороший урожай и высокого качества, который может служить в качестве модели ex vivo blood - brain барьер. Изолированные капилляров сохраняют свою первоначальную структуру и функция, которая позволяет использовать их для целого ряда после изоляции, молекулярные, биохимические и физиологические анализов. Следует позаботиться при обработке тканей человека образцы, предпочтительно в BSL 2 или выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим и признать д-р Питер Нельсон и Соня Андерсон на берегу ткани мозга Великобритании-ADC для предоставления всех человеческий мозг образцы тканей (номер гранта NIH: P30 AG028383 из Национального института по проблемам старения). Мы благодарим Matt Hazzard и Tom Долан, информационные технологии, научные технологии и участия факультет, Университет Кентукки графический помощи. Этот проект получил поддержку номер 1R01NS079507 грант от национального института неврологических нарушений и инсульта (чтобы B.B.) и номер 1R01AG039621 грант от национального института по проблемам старения (до A.M.S.H.). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национальный институт неврологических расстройств и инсульта или Национальный институт по проблемам старения. Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Personal Protective Equipment (PPE) | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| Disposable Protective Labcoats | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended |
| Face Shield, disposable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended |
| Safety Materials | |||
| Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | to cover working areas |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | for used scalpels |
| Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 °C Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH Meter | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Dissecting Microscope | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | used to remove meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogenizer | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | used to freeze the tissue? |
| Voyager Pro Analytical Balance | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | used to check isolated capillaries | |
| Tools and Glassware | |||
| Finnpipette II Pipette 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | wash capillaries off filter |
| Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | resuspend pellet in BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | to mince brain tissue |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | to cover beaker and volumetric flask |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | to wash capillaries off filter |
| 60 mL syringe with Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | used with connector ring to filter capillaries |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | used for mincing |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | used to remove meninges |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 mL volume, clearance: 150-230 μm |
| Dounce Homogenizer | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volume, clearance: 80-130 μm |
| Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left |
| pluriStrainers (pore size: 30 µm) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| Connector Ring | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | reuse multiple time |
| 1 L Volumetric Flask | for preparation of Isolation Buffer | ||
| 1 L Beaker | for preparation of 1% BSA | ||
| Stir Bar | for preparation of 1% BSA and Ficoll® | ||
| Schott Bottle (60 mL) | for preparation of Ficoll® | ||
| Ice Bucket | to keep everything cold | ||
| 100 mm Petri dish | for mincing of brain tissue | ||
| Tissue Culture Cell Scraper | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | to remove supernatant after centrifugation |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use. |
| DPBS with Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - part of the Isolation Buffer |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use. |
| Glucose (D-(+) Dextrose) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM |
| Sodium Hydroxide Standard Solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | to adjust pH of the DPBS |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentration: 1 mM |
References
- Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
- Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
- Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
- Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
- van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
- Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
- Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
- Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
- Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
- Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
- Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
- Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
- Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
- Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
- Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
- Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
- Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
- Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
- Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
- Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
- Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
- Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
- Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
- Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
- van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
- Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
- Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
- Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
- Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
- Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
- Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
- Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
- Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
- Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
- Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
- Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
- Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
- Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
- Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
- Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
- Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
- Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
- Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
- Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
- Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
- Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
- Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
- Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
- Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
- Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
- Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
- Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
- Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
- Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
- Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
- Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
- Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
- Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
- Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
- McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
- Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
- Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
- Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
- Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
- Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
- Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).
