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Neuroscience

ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं का अलगाव

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2, 1, 3, 2
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

Summary

मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग मस्तिष्क केशिकाओं शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक नैदानिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यहाँ, हम ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

शारीरिक और pathophysiological स्थितियों के तहत रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह को समझना नई चिकित्सीय रणनीतियों है कि मस्तिष्क की दवा वितरण बढ़ाने के लिए वादा पकड़ के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, मस्तिष्क संरक्षण में सुधार, और मस्तिष्क का इलाज विकारों. हालांकि, मानव रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, वहां उपयुक्त मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । इस संबंध में, मस्तिष्क केशिकाओं मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग करने के लिए एक अनूठा उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के रूप में संभव के रूप में vivo स्थिति में मानव के करीब बाधा समारोह का अध्ययन । यहाँ, हम एक उच्च उपज में और लगातार गुणवत्ता और पवित्रता के साथ मानव मस्तिष्क ऊतक से केशिकाओं को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । केशिकाएं यांत्रिक homogenization, घनत्व ढाल केंद्रापसारक, और निस्पंदन का उपयोग कर ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग कर रहे हैं । अलगाव के बाद, मानव मस्तिष्क केशिकाओं रिसाव परख, लाइव सेल इमेजिंग, और प्रतिरक्षा आधारित परख प्रोटीन अभिव्यक्ति और समारोह, एंजाइम गतिविधि, या intracellular संकेतन अध्ययन सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं मानव रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह के विनियमन स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा मॉडल हैं । यह मॉडल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, जो सीएनएस विकारों के उपचार के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में मदद करेगा ।

Introduction

रक्त मस्तिष्क बाधा रक्त और मस्तिष्क के बीच एक कसकर नियंत्रित इंटरफेस है जो निर्धारित करता है कि क्या में चला जाता है और मस्तिष्क से बाहर आता है । Anatomically, endothelial कोशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा रचना और एक जटिल, सतत केशिका नेटवर्क रूपों. शारीरिक रूप से, इस केशिका नेटवर्क ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के साथ मस्तिष्क की आपूर्ति करते हुए एक साथ कार्बन डाइऑक्साइड और चयापचय अपशिष्ट उत्पादों के निपटान । महत्वपूर्ण बात, सबूत का समर्थन करता है कि बाधा में परिवर्तन अल्जाइमर रोग, मिर्गी सहित कई विकृतियों के लिए योगदान, और स्ट्रोक1,2,3,4,5 , 6 , 7. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं को भी मस्तिष्क में दवा लेने को अवरुद्ध द्वारा उपचार के लिए एक बाधा के रूप में सेवा, जैसे, ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी की कीमोथेरेपी के बाद ट्यूमर की लकीर8,9, 10. इस संबंध में, अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं एक अद्वितीय पूर्व vivo रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल है कि बारीकी से vivo में बाधा संपत्तियों, जो स्वास्थ्य में बाधा समारोह और रोग के अध्ययन के लिए अनुमति देता है जैसा दिखता है प्रतिनिधित्व और रोग । इस लेख में, हम एक लगातार उच्च केशिका गुणवत्ता और रक्त मस्तिष्क बाधा का अध्ययन करने के लिए उपज पर मानव मस्तिष्क से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

१९६९ में, Siakotos एट अल. 11 घनत्व ढाल केंद्रापसारक और कांच मनका कॉलम जुदाई का उपयोग गोजातीय और मानव मस्तिष्क ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं के अलगाव की रिपोर्ट करने के लिए पहले थे । बाद में Goldstein एट अल. 12 ग्लूकोज परिवहन की चयापचय गतिविधि को बनाए रखते हुए, चूहों से पृथक मस्तिष्क केशिकाओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक ऊतक की मात्रा में कमी करने के लिए कई निस्पंदन कदम जोड़कर इस विधि में सुधार हुआ । तब से, शोधकर्ताओं ने केशिका अलगाव प्रक्रिया कई बार अनुकूलित, प्रत्येक पुनरावृत्ति13,14,15के साथ विधि और मस्तिष्क केशिका मॉडल में सुधार । उदाहरण के लिए, Pardridge एट अल. 16 अलग गोजातीय केशिकाओं यांत्रिक homogenization के बजाय एंजाइमी पाचन का उपयोग, और फिर बाद में एक २१० µm मेष फिल्टर और एक गिलास मनका कॉलम के माध्यम से एक केशिका निलंबन पारित कर दिया । इन संशोधनों trypan नीले अपवर्जन पृथक मस्तिष्क केशिकाओं के दाग में सुधार, और इस प्रकार, endothelial कोशिका व्यवहार्यता में वृद्धि हुई । 1990 के दशक में, Dallaire एट अल। 17 अलग गोजातीय और चूहे केशिकाओं कि न्यूरॉन संदूषण और बनाए रखा चयापचय गतिविधि के स्पष्ट थे γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) और क्षारीय फॉस्फेट. २००० में, मिलर एट अल। 18, इस्तेमाल किया अलग चूहे और फोकल माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन में सुअर का मस्तिष्क केशिकाओं केशिकाओं के लुमेन में परिवहन सब्सट्रेट के संचय को दिखाने के लिए । इसके बाद, हमारी प्रयोगशाला मस्तिष्क केशिका अलगाव प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए जारी रखा है और हम पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी)19,20,21, स्तन कैंसर का निर्धारण करने के लिए परिवहन परख की स्थापना की है प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP)22,23, और बहु दवा प्रतिरोध प्रोटीन 2 (Mrp2)24 परिवहन गतिविधि । २००४ में, हम हम विभिन्न सिग्नलिंग रास्ते की जांच करने के लिए अलग चूहे मस्तिष्क केशिकाओं का इस्तेमाल किया, जहां दो रिपोर्ट प्रकाशित. Hartz एट अलमें । 21, हमने पाया है कि पेप्टाइड endothelin-1 तेजी से और reversibly endothelin रिसेप्टर बी (एटबी) रिसेप्टर, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (नग), और प्रोटीन कळेनासे सी (PKC) के माध्यम से अभिनय से मस्तिष्क केशिकाओं में पी जीपी परिवहन समारोह कम । Bauer एट अल में । 19, हम परमाणु रिसेप्टर pregnane एक्स रिसेप्टर (PXR) की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया और मस्तिष्क केशिकाओं में पी जीपी अभिव्यक्ति और परिवहन समारोह के PXR-मॉडुलन दिखाया. ट्रांसजेनिक मानव PXR चूहों के साथ प्रयोग में, हम अनुसंधान की इस लाइन का विस्तार किया और vivo hPXR सक्रियण25के माध्यम से पी-जीपी को विनियमित द्वारा बाधा के कस में दिखाया । २०१० में, Hartz एट अल. 26 इस दृष्टिकोण का उपयोग पी जीपी प्रोटीन अभिव्यक्ति और ट्रांसजेनिक मानव amyloid प्रणेता प्रोटीन (hAPP) चूहों कि hAPP व्यक्त में परिवहन गतिविधि बहाल करने के लिए । इसके अलावा, पी hAPP चूहों में जीपी बहाल काफी amyloid बीटा (Aβ)४०और Aβ४२मस्तिष्क के स्तर को कम कर दिया ।

संकेतन रास्ते का अध्ययन करने के अलावा, अलग मस्तिष्क केशिकाओं केशिका पारगम्यता जो हम केशिका रिसाव के रूप में उल्लेख में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, टेक्सास लाल रिसाव परख समय के साथ केशिका लुमेन से फ्लोरोसेंट डाई टेक्सास लाल के रिसाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और इन आंकड़ों तो रिसाव दरों का विश्लेषण किया जाता है । नियंत्रण केशिकाओं से उन लोगों की तुलना में वृद्धि की केशिका रिसाव दर रक्त मस्तिष्क बाधा2की शारीरिक अखंडता में परिवर्तन का संकेत मिलता है । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वहां कई रोग बाधा व्यवधान के साथ जुड़े राज्यों, जैसे, मिर्गी, एकाधिक स्केलेरोसिस, अल्जाइमर रोग, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट27,28,29, 30. अन्य समूहों को भी अलग केशिकाओं का उपयोग किया है संकेतन रास्ते कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति और प्रोटीन की परिवहन गतिविधि को विनियमित करने के लिए31,३२,३३,३४, ३५,३६,३७. अंत में, हम मानव मस्तिष्क केशिकाओं के अलगाव के लिए इस विधि का अनुकूलन करने के लिए जारी रखा है और, हाल ही में, हम मिर्गी के साथ रोगियों में मानव रक्त-मस्तिष्क बैरियर पर वृद्धि हुई पी जीपी अभिव्यक्ति दिखाया जब्ती-मुक्त नियंत्रण व्यक्तियों की तुलना में३८ . एक साथ लिया, इन घटनाओं का प्रदर्शन है कि अलग मस्तिष्क केशिकाओं बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

vivo में विभिंन, पूर्व vivo, और इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल में इस्तेमाल किया गया है बुनियादी अनुसंधान और औद्योगिक दवा स्क्रीनिंग, मस्तिष्क को दवा वितरण परीक्षण के लक्ष्य के साथ मुख्य रूप से३९,४०,४१ ,४२,४३,४४. अलग पूर्व vivo मस्तिष्क केशिकाओं के अलावा, वर्तमान रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल silico मॉडल में शामिल हैं, इन विट्रो कोशिका संस्कृति अलग मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं या विभिन्न से अमर सेल लाइनों के प्रजातियों में, इन विट्रो संस्कृति में मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) कि मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं में अंतर है, और एक चिप पर microfluidic मॉडल.

silico मॉडल में सबसे अधिक दवा की भविष्यवाणी की अवशोषण, वितरण, चयापचय, और उत्सर्जन (ADME) संपत्तियों के आधार पर उंमीदवारों के चयन के लिए दवा के विकास में प्रयोग किया जाता है । विधियां जैसे मात्रात्मक संरचना-संपत्ति संबंध (QSPR) मॉडल और मात्रात्मक संरचना-गतिविधि संबंध (QSAR) मॉडल लोकप्रिय तरीके पुस्तकालयों के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया दवा उम्मीदवारों के मस्तिष्क पैठ की भविष्यवाणी करने के लिए कर रहे हैं ४५ , ४६. इन मॉडलों बाधा प्रवेश संपत्तियों के लिए अणुओं स्क्रीन करने के लिए उपयोगी होते हैं ।

Betz एट अल. ४७ स्थापित monolayers के रूप में एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बैरियर मॉडल प्रणाली के रूप में प्रसंस्कृत मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं । इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग कर ताजा ऊतक या मानव मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं (hCMECs) के रूप में अमर endothelial सेल लाइनों मस्तिष्क प्रवेश या यंत्रवत अध्ययन के लिए एक और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग उपकरण हो सकता है । हालांकि, मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिका संस्कृति मॉडल केशिका लुमेन के अंदर रक्त के प्रवाह के शारीरिक कतरनी तनाव की कमी, समग्र जीवविज्ञान जटिलता में सीमित हैं, और अभिव्यक्ति और महत्वपूर्ण बाधा घटकों के स्थानीयकरण में परिवर्तन से गुजरना ऐसे तंग जंक्शन प्रोटीन, सतह रिसेप्टर्स, ट्रांसपोर्टरों, एंजाइमों, और आयन चैनलों के रूप में४८,४९,५०. इसके विपरीत, endothelial monolayers hPSCs से व्युत्पंन, hCMEC/D3 संस्कृतियों की तुलना में कम सुक्रोज पारगम्यता है और कुछ रक्त मस्तिष्क बाधा ट्रांसपोर्टरों, आसंजन अणुओं, और तंग जंक्शनों५१ की ध्रुवीकरण अभिव्यक्ति होते हैं, ५२. हालांकि, इन कोशिकाओं को भी संस्कृति में गुण बदलने के अधीन हैं, और प्रणाली के अपने recapitulation के लिए मांय किया जाना चाहिए vivo बैरियर गुण५२ में ।

रक्त में नए रुझान-मस्तिष्क बाधा अनुसंधान 3 डी ऊतक संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करने के लिए कृत्रिम केशिकाओं बनाने के लिए, अंग पर चिप प्रौद्योगिकी microfluidic उपकरणों, या खोखले फाइबर प्रौद्योगिकी का उपयोग५३ उत्पंन करने के लिए, प्रयोग शामिल ५४ , ५५. कृत्रिम केशिकाओं, तथापि, मस्तिष्क केशिकाओं (3-7 µm) की तुलना में काफी बड़ा व्यास (100-200 µm) है । इसलिए, इन विट्रो में कतरनी बलों पूरी तरह से vivo स्थिति में समान नहीं है । इस में संबोधित किया है "रक्त मस्तिष्क-बैरियर पर एक चिप" microfluidic उपकरणों, जहां कृत्रिम झिल्ली फार्म "रक्त" और "मस्तिष्क" डिब्बों और तरल पदार्थ इन microfluidic कतरनी बलों पैदा उपकरणों के माध्यम से पंप कर रहे हैं । इसी प्रकार, endothelial कोशिकाओं की सह संस्कृतियों astrocytes और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के साथ विभिन्न संयोजनों में भी rheological मानकों के तहत वर्तमान बनाने के लिए खोखले फाइबर प्रौद्योगिकी के साथ प्रयोग किया गया है vivo स्थितियों५६ , ५७ , ५८. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कितनी अच्छी तरह इस मॉडल के परिवहन, चयापचय, संकेत, और दूसरों के रूप में रक्त मस्तिष्क बाधा के अंय गुणों को दर्शाता है । इन कृत्रिम केशिका और चिप मॉडल दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन इन मॉडलों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को भी संस्कृति के दौरान परिवर्तन के अधीन हैं ।

जमे हुए और फिक्स्ड ब्रेन स्लाइस या प्राथमिक मस्तिष्क केशिका endothelial सेल संस्कृतियों अतिरिक्त मॉडल है किमानव microvasculature5,५९,६०,६१अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैं । उदाहरण के लिए, स्थिर मस्तिष्क ऊतक के immunohistochemistry रोगग्रस्त ऊतक की तुलना में स्वस्थ में प्रोटीन स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

ऊतक स्लाइस के अलावा और इन विट्रो मॉडल ऊपर वर्णित में, हौसले से अलग मस्तिष्क केशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस अलग केशिका मॉडल की सीमाएं ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक, astrocytes और ंयूरॉंस की अनुपस्थिति, और एक अपेक्षाकृत समय लेने वाली अलगाव प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए कठिनाई शामिल हैं । अलग मस्तिष्क केशिका मॉडल का एक लाभ यह है कि इस मॉडल को बारीकी से विवो स्थिति में मिलता है और इसलिए, बाधा समारोह और शिथिलता को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात यह भी परख और आणविक तकनीक3,19,६२,६३की एक भीड़ का उपयोग कर संकेतन तंत्र विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हमारी प्रयोगशाला सैंडर्स-एजिंग पर ब्राउन सेंटर के माध्यम से ताजा और जमे हुए मानव मस्तिष्क ऊतक दोनों के लिए उपयोग किया है (आईआरबी #B15-२६०२-M)६४। इस संदर्भ में, autopsies एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करें, दिमाग < 4 ज में प्राप्त कर रहे हैं, और सभी प्रक्रियाओं NIH के अनुरूप सबसे अच्छा अभ्यास दिशानिर्देश६५। मानव मस्तिष्क ऊतक के लिए इस अनूठी पहुँच को देखते हुए, हम स्थापित किया है और मानव मस्तिष्क ऊतक कि बरकरार, व्यवहार्य मानव मस्तिष्क केशिकाओं की एक उच्च उपज में परिणाम से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित । ब्याज की दो आम समापन प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि का निर्धारण कर रहे हैं । इस संबंध में, हम और दूसरों को विभिंन परख कि अलग मस्तिष्क केशिकाओं के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि के स्तर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित किया है । इन परख पश्चिमी सोख्ता, सरल पश्चिमी परख, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर), मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR), zymography, परिवहन गतिविधि परख शामिल हैं, और केशिका रिसाव परख । इन परख मानव रोग की स्थिति में बाधा समारोह में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति, मार्ग है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि को नियंत्रित निर्धारित करते हैं, और रक्त मस्तिष्क बाधा जुड़े उपचार के लिए औषधीय लक्ष्यों की पहचान रोगों.

एक साथ लिया, हौसले से पृथक मस्तिष्क केशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा के एक मजबूत और reproducible मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं । विशेष रूप से, इस मॉडल के कई विभिंन परख के साथ संयुक्त किया जा सकता है अंतिमबिंदु की एक विस्तृत सरणी के लिए बाधा समारोह का अध्ययन निर्धारित करते हैं ।

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Protocol

नीचे दी गई जानकारी केंटुकी, Lexington, KY, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय में वर्तमान सुरक्षा और विनियामक मानकों पर आधारित है । सुरक्षा एहतियात के रूप में, मानव ऊतक के साथ काम करने से पहले संस्था के जैविक सुरक्षा कार्यक्रम और सबसे वर्तमान नियमों और सिफारिशों को देखें ।

चेतावनी: मानव ऊतक मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी), हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (HCV), और दूसरों सहित रक्त जनित रोगजनकों का एक स्रोत हो सकता है । मानव ऊतक के साथ काम करने से रक्त जनित रोगजनकों से संक्रमण का खतरा बन गया है । इसलिए, कुछ विनियामक और सुरक्षा विचार आवश्यक है जब मानव ऊतक के साथ काम करने के लिए प्रयोगशाला कर्मियों की रक्षा । अमेरिका में मानव ऊतक के साथ कार्य करने के लिए एक जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला के साथ ही सुरक्षा सावधानियों और प्रशिक्षण के अनुसार NIH खंड के चतुर्थ-बी-7, OSHA अधिनियम के १९७० खंड 5 (क) (1) और उपयोगकर्ता के संस्थागत जैविक सुरक्षा कार्यक्रम की आवश्यकता है. सामांय में, संस्थागत सुरक्षा समिति और/या संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी किसी भी मानव सामग्री (ऊतक, शरीर के तरल पदार्थ) को शामिल अनुसंधान आयोजित करने से पहले प्राप्त किया जाना चाहिए । प्रशिक्षण सभी मानव सामग्री के साथ काम कर रहे कर्मियों के लिए आवश्यक है और बुनियादी प्रयोगशाला सुरक्षा प्रशिक्षण शामिल हैं, जैसे, रासायनिक स्वच्छता और प्रयोगशाला सुरक्षा, साथ ही जैविक सुरक्षा पर विशिष्ट प्रशिक्षण, खतरनाक अपशिष्ट, और मानव रक्त जनित रोगजनकों । मानव सामग्री के साथ काम कर रहे सभी कर्मियों, मानव सामग्री के साथ काम करने से पहले हेपेटाइटिस बी टीकाकरण प्राप्त करने के लिए अत्यधिक सिफारिश कर रहे हैं । कर्मियों को विशिष्ट व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए आवश्यक हैं, जबकि मानव सामग्री के साथ काम करना, जैसे, एक कफ लैब कोट और एक चेहरा ढाल, और हर समय दस्ताने पहनते हैं । सभी काम एक सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा 2) में किया जाता है । सभी उपकरण है कि मानव सामग्री और मानव सामग्री से किसी भी अपशिष्ट के साथ संपर्क में आता है उचित रूप से नियंत्रित किया जाता है और दूषित संक्रमण को रोकने के/ सभी उपकरणों और सतहों के साथ साफ कर रहे है 10% ब्लीच और ७५% प्रत्येक मानव सामग्री को शामिल प्रक्रिया के बाद इथेनॉल । मानव सामग्री के साथ एक फैल तुरंत साफ होना चाहिए । कांच के एक प्रयोग के बाद autoclaved है । व्यर्थ मानव ऊतक सहित अपशिष्ट, एक लेबल में एकत्र किया गया है जोखिम अपशिष्ट बैग और autoclaved । Sharps एक पंचर-और रिसाव प्रूफ कंटेनर में एकत्र कर रहे है के रूप में खतरनाक लेबल । मानव सामग्री से सभी अपशिष्ट का निपटारा संस्था के जैविक सुरक्षा नियमों के अनुसार होता है.

नोट: हमारी प्रयोगशाला उम्र बढ़ने पर सैंडर्स-ब्राउन सेंटर के माध्यम से मृतक व्यक्तियों से ताजा ललाट प्रांतस्था नमूने प्राप्त करता है (आईआरबी #B15-२६०२-M). शामिल करने के मानदंड हैं: ब्रिटेन में नामांकन-एडीसी अनुदैर्ध्य शव पलटन अध्ययन और एक पोस्टमार्टम अंतराल (पीएमआई) ≤ 4 एच६४। Autopsies एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करें और सभी प्रक्रियाओं NIH के अनुरूप सबसे अच्छा अभ्यास दिशानिर्देश६५। 4 h से कम पीएमआई के अलगाव के बाद केशिका व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए उच्चतम महत्व का है । दोनों ताजा और जमे हुए ऊतक इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि ठंड आवश्यक है, हौसले से प्राप्त मानव मस्तिष्क ऊतक सदमे-तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । ताजा या गल ऊतक अलगाव बफर में संग्रहित किया जाना चाहिए (नीचे देखें) और जल्दी से संसाधित । हम पाते है कि 10 जी ताजा मानव ऊतक पैदावार के बारे में १०० मिलीग्राम मस्तिष्क केशिकाओं (गीला वजन) ।

1. सेटअप

  1. बफर वडा
    नोट: आवश्यक बफ़र की मात्रा ऊतक की मात्रा पर निर्भर करता है । निंनलिखित प्रोटोकॉल में सभी बफर संस्करणों मानव मस्तिष्क प्रांतस्था ऊतक के 10 ग्राम पर आधारित हैं ।
    1. एल अलगाव बफर: का प्रयोग करें १.५ Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS; २.७ मिमी KCl, १.४७ मिमी KH2पीओ4, १३६.९ मिमी NaCl, ८.१ मिमी न2HPO4, ०.९ मिमी CaCl2, ०.४९ मिमी MgCl2) और पूरक के साथ 5 मिमी D-ग्लूकोज (१.३५ जी ) और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट (०.१६५ ग्राम) । ग्लूकोज और पाइरूवेट जोड़ने के बाद, सोडियम हीड्राकसीड के साथ पीएच ७.४ को समायोजित करें । कूल और उपयोग करने से पहले 4 ° c करने के लिए बफर स्टोर ।
    2. गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA): 1% की एक अंतिम BSA एकाग्रता के लिए अलगाव बफर के 1 एल के लिए BSA पाउडर के 10 ग्राम जोड़ें । हलचल धीरे बुलबुले से बचने के लिए, ७.४ पीएच को समायोजित, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान । तुरंत उपयोग करने से पहले, धीरे हलचल; एल्ब्युमिन विकार से बचने के लिए बुलबुले बनाने से बचें ।
    3. घनत्व ढाल मध्यम: एक गिलास बोतल में घनत्व ढाल माध्यम के 18 जी वजन और एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें । अलगाव बफर के ६० मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए जोरदार हिला जब तक सभी पाउडर निलंबित कर दिया है । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करने के लिए घनत्व ढाल माध्यम को भंग करने की अनुमति । उपयोग करने से पहले 10 मिनट सही के लिए हिलाओ ।
    4. 4 ° c पर सभी बफ़र्स संग्रहीत; संपूर्ण आइसोलेशन प्रक्रिया के दौरान सभी उपकरण और बफ़र्स को बर्फ पर रखें । उपयोग करने से पहले सभी बफ़र्स हिलाओ ।
  2. प्रायोगिक सेटअप
    1. इलेक्ट्रॉनिक ओवरहेड सरगर्मी पर कुम्हार के मूसल-Elvehjem ऊतक चक्की माउंट । कुम्हार-Elvehjem ऊतक चक्की और डाकू के नीचे बर्फ पर मूसल से Dounce homogenizer रखें. एक ३०० µm फिल्टर मेष तैयार (5 x 5 cm2), यह एक शंकु करने के लिए गुना, और डालने और टेप के साथ एक ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूब करने के लिए देते हैं (आंकड़ा 1a).
    2. जगह जोड़ने के छल्ले और सेल तनाव फिल्टर (ताकना आकार: 30 µm) पर ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूबों । खतरनाक अपशिष्ट बैग तैयार करें । सभी आवश्यक उपकरण को सुरक्षा कैबिनेट में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

2. ब्रेन सैंपल तैयार करना

नोट: चित्र 1a नीचे वर्णित संपूर्ण आइसोलेशन प्रक्रिया का वर्कफ़्लो चार्ट दिखाता है. मानव मस्तिष्क ऊतक प्रांतस्था के किसी भी हिस्से से स्टेम कर सकते हैं और ताजा या जमे हुए इस्तेमाल किया जा सकता है । जमे हुए मस्तिष्क ऊतक कमरे के तापमान पर गल सकता है (कोई बफर नहीं; ~ 10 g के लिए 30 मिनट) । तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, मस्तिष्क ऊतक प्रत्येक प्रयोग के लिए एक ही मस्तिष्क क्षेत्र से प्राप्त किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल को ताज़ा करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है (पीएमआई < 4 h) मानव सेरेब्रल प्रांतस्था जो जमी हुई नहीं है ।

  1. मानव मस्तिष्क ऊतक की तैयारी: मस्तिष्क ऊतक के वजन दस्तावेज़ । निंनलिखित प्रोटोकॉल में सभी नंबरों ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक के 10 ग्राम के लिए उपयुक्त हैं । मस्तिष्क के ऊतकों को १०० mm पेट्री डिश में रखें । संदंश के साथ सभी मेनिन्जेस को सावधानीपूर्वक निकालें । एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए सफेद मामले में कटौती ।
  2. मानव मस्तिष्क ऊतक के नख़रेबाज़: ध्यान से मस्तिष्क के ऊतकों को काट और यह एक स्केलपेल के साथ कीमा । के बारे में 5 मिनट के लिए कीमा (2-3 मिमी टुकड़े) । ब्रेन टिशू को कुम्हार-Elvehjem टिशू ग्राइंडर में ट्रांसफर करें । आइसोलेशन बफ़र के 30 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: कीमा बनाया हुआ ऊतक टुकड़े के बाद से मस्तिष्क ऊतक नख़रेबाज़ प्रक्रिया के माध्यम से गूदा में बदल जाता है देखने के लिए मुश्किल हैं ।

3. Homogenization

  1. कुम्हार-Elvehjem ऊतक चक्की (क्लीयरेंस: 150 – 230 µm): Homogenize ५० आरपीएम के एक homogenizer गति से १०० स्ट्रोक के साथ प्रत्येक नमूने । दस्तावेज़ समय हर 25 स्ट्रोक और कुल १०० स्ट्रोक के लिए समय की जरूरत है । एक प्रस्तावित homogenization प्रोटोकॉल के लिए तालिका 1 देखें; मानव ललाट प्रांतस्था के अनुमन्य 10 ग्राम के लिए कुल समय लगभग 22 मिनट है । बुलबुले को रोकने के लिए हवा में हलचल मत करो ।
  2. Dounce homogenizer (क्लीयरेंस: 80 – 130 µm): homogenate को बर्फ पर एक Dounce homogenizer में ट्रांसफर कर दीजिये । Homogenize 20 स्ट्रोक के साथ निलंबन (~ 6 एस स्ट्रोक, ~ 2 मिनट की कुल) । बुलबुले से बचें ।

4. केंद्रापसारक

  1. ४ ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में समान रूप से मस्तिष्क homogenate वितरित और homogenate की कुल मात्रा दस्तावेज़ । इस केंद्रापसारक ट्यूबों में घनत्व ढाल बफर के ५० मिलीलीटर (ट्यूब प्रति १२.५ मिलीलीटर) वितरित । अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए मूसल और homogenizer कुल्ला, और चार केंद्रापसारक ट्यूबों में वितरित (~ २.५ मिलीलीटर ट्यूब प्रति) ।
  2. कसकर टोपियां के साथ केंद्रापसारक ट्यूबों बंद करो । मिश्रण homogenate, घनत्व ढाल माध्यम, और बफर तेजी से ट्यूबों मिलाते हुए । 4 डिग्री सेल्सियस (निश्चित कोण रोटर) में 15 मिनट के लिए ५,८०० x g पर केंद्रापसारक; गोली ट्यूब से जुड़ी रखने के लिए एक मध्यम मंदी गति का चयन करें । supernatant त्यागें और प्रत्येक गोली 1% BSA के 2 मिलीलीटर में resuspend ।

5. निस्पंदन

नोट: लाल रक्त कोशिकाओं और अन्य सेल मलबे से केशिकाओं को अलग करने के लिए, कई निस्पंदन कदम आवश्यक हैं ।

  1. ३०० µm मेष: गोली के बाद पुनः सस्पैंड, ३०० µm मेष के माध्यम से निलंबन फिल्टर । केशिकाओं जाल के माध्यम से फ़िल्टर कर रहे हैं, जबकि बड़ा जहाजों और बड़ा मस्तिष्क मलबे जाल पर रहते हैं । ध्यान से मेष 1% BSA के ५० मिलीलीटर के साथ धो लो । मेष त्यागें ।
    नोट: यह निस्पंदन कदम किसी भी बड़े जहाजों या मस्तिष्क मलबे का हिस्सा से केशिका निलंबन साफ करता है ।
  2. 30 µ एम सेल तनाव फ़िल्टर
    नोट: इस निस्पंदन कदम लाल रक्त कोशिकाओं और अन्य मस्तिष्क मलबे से केशिकाओं अलग करती है ।
    1. ५ ३० µm सेल तनाव फिल्टर पर ६.१ कदम से केशिका निस्पंदन वितरित (के बारे में 10 मिलीलीटर निस्पंदन के प्रति सेल तनाव फिल्टर) । केशिकाओं वापस इस फिल्टर द्वारा आयोजित कर रहे हैं, जबकि लाल रक्त कोशिकाओं, अन्य एकल कोशिकाओं, और छोटे मस्तिष्क मलबे फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं और छानने का में एकत्र कर रहे हैं ।
    2. 1% BSA के 25 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक फिल्टर को धो लें । बाद में, उपज बढ़ाने के लिए छठे फिल्टर पर सभी छानने का समय डालना । प्रत्येक फ़िल्टर को 1% BSA के ५० मिलीलीटर से धोएं; सेल तनाव फिल्टर केशिकाओं युक्त के साथ रखें और छानने का त्याग ।

6. केशिका संग्रह

  1. फिल्टर उल्टा बारी और ५० मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक फिल्टर के लिए 1% BSA की ५० मिलीलीटर के साथ केशिकाओं धोने । धीरे से एक 5 मिलीलीटर pipettor के प्लास्टिक टिप के साथ दबाव लागू करते हैं और यह फिल्टर भर में ले जाने के लिए मस्तिष्क केशिकाओं से धो ।
  2. विशेष रूप से फिल्टर के रिम से, सभी मस्तिष्क केशिकाओं से धोने के लिए सुनिश्चित करें । इस निस्पंदन प्रक्रिया को और अधिक कठिन बनाता है और केशिका नुकसान की संभावना बढ़ जाती है के बाद से बुलबुले से बचें ।

7. धुलाई

  1. केशिकाओं का संग्रह करने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस (झूलते बाल्टी रोटर) पर 3 मिनट के लिए १,५०० x g पर सभी नमूनों के केंद्रापसारक । supernatant निकालें और फिर से लगभग में गोली सस्पेंड 3 अलगाव बफर के एमएल । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक नमूना से सभी resuspend छर्रों गठबंधन और यह अलगाव बफर के साथ भरें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १,५०० x g पर फिर से केंद्रापसारक और दो बार धोने ।
  2. एक खुर्दबीन (100X इज़ाफ़ा) और कैमरा (आंकड़ा 1b) के साथ केशिका शुद्धता दस्तावेज़ ।
    नोट: मानव मस्तिष्क ऊतक के 10 ग्राम से मस्तिष्क केशिका उपज आमतौर पर के बारे में १०० मिलीग्राम है । अलग मस्तिष्क केशिकाओं अब प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, संसाधित (जैसे, lysate, झिल्ली अलगाव), या फ्लैश-जमे हुए और 6-12 महीने की एक ंयूनतम के लिए cryotubes में-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत (कई फ्रीज-गल चक्र से बचें) ।

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Representative Results

मानव मस्तिष्क ऊतक से अलगाव एक निलंबन मानव मस्तिष्क केशिकाओं में समृद्ध है (आंकड़ा 1b) बड़ा जहाजों की छोटी मात्रा के साथ, लाल रक्त कोशिकाओं, अन्य एकल कोशिकाओं, और कुछ सेल मलबे. कुछ केशिकाएं बंटी हुई होती हैं, और कुछ में, लाल रक्त कोशिकाएं केशिका लुमेन में फंस होती हैं । ठेठ केशिका एक 3-7 µm व्यास है और लगभग 100-200 µm खुले लुमेन के साथ लंबे समय है; सबसे केशिका समाप्त होता है ढह जाती हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी, पृथक मानव मस्तिष्क केशिकाओं का उपयोग एक ट्यूबलर, बरकरार संरचना और आकृति विज्ञान प्रकट करते हैं । चित्रा 2a एक संलग्न pericyte और लुमेन में एक लाल रक्त कोशिका के साथ एक मानव मस्तिष्क केशिका की प्रकाश छवि संचारित एक प्रतिनिधि से पता चलता है । व्यास, आकार, और आकृति विज्ञान के बारे में निष्कर्षों के सभी अलग मस्तिष्क केशिकाओं12,17,18की संरचना पर पिछले रिपोर्ट के अनुसार कर रहे हैं । चित्रा 2 बी में अलग मानव मस्तिष्क केशिका पी जीपी (हरे) प्राथमिक एंटीबॉडी (1 µ जी/एमएल) के रूप में C219 का उपयोग कर के लिए immunostained था; नाभिक DAPI (1 µ g/एमएल) के साथ counterstained थे ।

Figure 1
चित्रा 1: केशिका अलगाव के लिए फ़्लोचार्ट । (क) pictogram ताजा मानव ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए प्रक्रिया के प्रमुख कदम दिखाता है । (ख) चित्र अलगाव (100X आवर्धन) के बाद सीधे एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अलग मानव मस्तिष्क केशिका । (क) एक अलग मानव मस्तिष्क केशिका की एक संचारित प्रकाश छवि । (ख) फोकल माइक्रोस्कोप छवि पी जीपी के लिए एक अलग मानव मस्तिष्क केशिका immunostained से पता चलता है (हरा; C219 1 µ g/mL); नाभिक DAPI (नीला; 1 µ g/एमएल) के साथ counterstained थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: समस्या निवारण घनत्व केंद्रापसारक । pictogram घनत्व ढाल केंद्रापसारक के बाद तैयारी से पता चलता है । यह बहुत ज्यादा है और बहुत कम घनत्व ढाल माध्यम के प्रभाव पर प्रकाश डाला गया और यह कैसे जुदाई और जिसके परिणामस्वरूप केशिका गोली प्रभावित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पी-जीपी अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति । पश्चिमी दाग hCMEC\D3 कोशिकाओं की तुलना में अलग मानव केशिकाओं में पी-जीपी (1 µ g/एमएल) के लिए मजबूत बैंड दिखाता है । β-Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था (1 µ g/µ l). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पृथक मानव मस्तिष्क केशिकाओं के लिए आवेदन । साहित्य में प्रकाशित पृथक मस्तिष्क केशिकाओं के लिए सबसे आम अनुप्रयोगों का अवलोकन । पृथक केशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है: 1) जीनोमिक्स८५,८६, 2) प्रोटियोमिक्3,३८,८७,८८,८९,९०, ९१,९२,९४,९५,९६, 3) कार्यात्मक प्रोटियोमिक्2,३८, और 4) Cellomics८२, ८३,८४,९७,९८,९९. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्ट्रोक समय [min]
१ – २५ ७ – ७.५
२६ – ५० 5 – 5.5
५१ – ७५ 5 – 5.5
76 – 100 5 – 5.5
कुल समय: 22 – 24 min

तालिका 1: Homogenization प्रोटोकॉल । कुम्हार-Elvehjem ऊतक चक्की के लिए homogenization प्रोटोकॉल ५० आरपीएम की एक homogenization गति से मानव ललाट प्रांतस्था के 10 ग्राम homogenize करने के लिए । ध्यान दें कि पहले कई स्ट्रोक कीमा बनाया हुआ ऊतक homogenize करने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता है । इस प्रारंभिक homogenization के बाद, प्रत्येक स्ट्रोक की अवधि में 12 एस है (नीचे आंदोलन के लिए 6 एस, ऊपर आंदोलन के लिए 6 एस) । इस प्रकार, के बाद प्रारंभिक homogenization, 5 स्ट्रोक में पूरा किया जा सकता 1 मिनट, या 25 स्ट्रोक में 5 मिनट.

समस्या संभावित कारण समाधान
कोई केशिका गोली १) गलत Ficoll एकाग्रता 1) Ficoll एकाग्रता समायोजित करें
2) गलत केंद्रापसारक गति 2) को समायोजित करें केंद्रापसारक गति
3) गलत त्वरण और/या मंदी गति 3) त्वरण और/या मंदी गति समायोजित करें
कम केशिका उपज 1) मेनिन्जेस अवरुद्ध निस्पंदन कदम 1) निस्पंदन करने से पहले सभी मेनिन्जेस निकालें
2) भी कई केशिकाओं अलगाव प्रक्रिया के दौरान खो दिया 2) बफर एकाग्रता सही ढंग से गणना, कुल्ला पिपेट युक्तियां
3) PluriStrainer फिल्टर बंद वॉशिंग केशिकाओं अपर्याप्त था 3) पर फिल्टर बारी और ध्यान से केशिकाओं के लिए निरीक्षण (माइक्रोस्कोप का उपयोग करें)
4) निलंबन के दौरान अतिरिक्त बुलबुले 4) पिपेट धीरे बुलबुले से बचने के लिए
गैर व्यवहार्य केशिकाएं 1) विस्तारित पोस्ट-मार्टम अंतराल 1) यदि संभव हो तो अंतराल को कम या स्नैप-जमे हुए दिमाग का उपयोग
2) अलगाव के लिए जमे हुए ऊतक का उपयोग 2) ताजा ऊतक का प्रयोग करें
3) अलगाव प्रक्रिया का समय बहुत लंबा 3) ऑप्टिमाइज़ करें कार्यप्रवाह
4) उपकरण/बफ़र्स आइसोलेशन प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर नहीं रखा गया था 4) अलगाव के दौरान बर्फ पर उपकरण और बफ़र्स रखें

तालिका 2: सामांय समस्याओं का निवारण । सबसे सामांय त्रुटियों और आइसोलेशन प्रक्रिया के दौरान होने वाली समस्याओं की एक सूची और कैसे वे हल किया जा सकता है ।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल ताजा ऊतक से बरकरार है और व्यवहार्य मानव मस्तिष्क केशिकाओं के अलगाव का वर्णन । इस खंड में, हम विस्तार से निंनलिखित पर चर्चा: 1) प्रोटोकॉल में संशोधन, 2) सामांय त्रुटियों के निवारण, 3) तकनीक की सीमाएं, 4) मौजूदा और वैकल्पिक रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल के संबंध में मॉडल का महत्व है, और 5) अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं के लिए संभावित अनुप्रयोगों ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित ताजा मानव ललाट प्रांतस्था ऊतक के 10 ग्राम के लिए अनुकूलित है । हालांकि, यह अपेक्षाकृत के लिए इस प्रक्रिया को संशोधित करने के लिए सरल है: 1) अधिक या कम से 10 ऊतक के जी, 2) जमे हुए मस्तिष्क ऊतक, या 3) मस्तिष्क के एक मस्तिष्क के अलावा अंय क्षेत्र से ऊतक ललाट प्रांतस्था । सबसे पहले, मस्तिष्क ऊतक के अधिक या कम से 10 जी के साथ, बफ़र्स की आवश्यक मात्रा बस ऊपर या नीचे ऊतक की उपलब्ध राशि के लिए बढ़ाया जा सकता है । इस प्रकार, मस्तिष्क ऊतक के केवल 5 जी उपलब्ध है, बफ़र्स की मात्रा आधे से कम किया जाना चाहिए. दूसरा, हम ताजा मस्तिष्क के ऊतकों का इस्तेमाल किया है कि एक केशिका अलगाव का वर्णन है, लेकिन ताजा ऊतक३८अनुपलब्ध है, तो जमे हुए ऊतक इस्तेमाल किया जा सकता है । तीसरा, हम ललाट प्रांतस्था से लिया ताजा मस्तिष्क ऊतक इस्तेमाल किया, लेकिन केशिकाओं अन्य cortical मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग किया जा सकता है अगर वहाँ पर्याप्त उपलब्ध ऊतक है । यह भी गैर cortical मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे, सफेद पदार्थ) से केशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है, लेकिन इन क्षेत्रों में एक अलग सेल संरचना और केशिका घनत्व ६६,६७,६८है । इस प्रकार, एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र से ऊतक का उपयोग होने की संभावना प्रोटोकॉल (जैसे, बफर मात्रा, ढाल मध्यम घनत्व, केंद्रापसारक गति, और/या निस्पंदन कदम की संख्या) समायोजित करने की आवश्यकता होगी ।

केशिका अलगाव प्रक्रिया है, जबकि नहीं जटिल प्रति एसई, छोटे perturbations या प्रोटोकॉल में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है । संशोधन एक कम केशिका उपज या कम केशिका व्यवहार्यता में परिणाम हो सकता है । सारणी 2 सबसे सामांय त्रुटियां और समस्या है जो अलगाव के दौरान आई है और इन त्रुटियों से बचने के लिए युक्तियां सूचीबद्ध करता है और समस्या निवारण के लिए समाधान यदि वे होती हैं । प्रक्रिया के साथ जुड़े सबसे आम समस्या एक कम केशिका उपज है । केशिकाओं की हानि अक्सर प्रत्येक चरण में छोटे नुकसान की संचई राशि है और प्रक्रिया में छोटे विचलन के कारण है । एक महत्वपूर्ण कदम है जिसमें केशिकाओं की एक बड़ी राशि खो दिया जा सकता है घनत्व केंद्रापसारक है । एक गलत घनत्व में बफर परिणामों में एक गलत एकाग्रता केशिका गोली की मात्रा कम कर देता है कि सेलुलर मलबे से केशिकाओं अलग करने के लिए । चित्रा 3 मस्तिष्क homogenate के लिए रिश्तेदार कदम में बहुत कम या बहुत अधिक घनत्व ढाल माध्यम के परिणाम से पता चलता है । सही एकाग्रता को समायोजित करने से इस समस्या का समाधान हो सकता है । ध्यान दें कि त्वरण और मंदी गति के केंद्रापसारक भी मस्तिष्क केशिका गोली के गठन को प्रभावित कर सकते हैं । अगर केशिका सामग्री का हिस्सा पिपेट युक्तियों के लिए चिपक जाती है केशिकाओं भी कदम 6-7 के दौरान खो सकता है । इस समस्या को अच्छी तरह से इसे बदलने से पहले प्रत्येक प्लास्टिक टिप धोने द्वारा संबोधित किया जा सकता है । चरण 7 के दौरान, सेल तनाव फिल्टर से केशिकाओं धोने अधूरा हो सकता है और/या केशिकाओं फिल्टर के रिम के लिए छड़ी हो सकता है । इस माइक्रोस्कोप के तहत फिल्टर की जाँच द्वारा अतिरिक्त धुलाई कदम के बाद से बचा जा सकता है. अलगाव की प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के दौरान केशिकाओं खोने एक नगण्य केशिका गोली या नहीं आगे प्रसंस्करण और प्रयोग के लिए पर्याप्त केशिका सामग्री में परिणाम कर सकते हैं ।

ताजा मानव ऊतक से अलग मस्तिष्क केशिकाओं एक अद्वितीय रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल है कि करीब vivo स्थिति में जैसा दिखता है का प्रतिनिधित्व करता है । हालांकि, तकनीक की कई सीमाएं मौजूद हैं । एक चुनौती ताजा मानव ऊतक की उपलब्धता है । के रूप में इष्टतम पीएमआई ≤ 4 एच है, मस्तिष्क ऊतक एक महत्वपूर्ण अब पीएमआई पर एकत्र कुछ बहाव अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त ताजा नहीं होगा । कुछ मामलों में, यह ऊतक राशि है कि कई प्रयोगात्मक समूहों के लिए काफी बड़े हैं प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है, जिससे बहाव अनुप्रयोगों सीमित. इस प्रकार, कुतर19, कुत्ते६९, गोजातीय४२, या सुअर का७० मस्तिष्क ऊतक से ताजा केशिकाओं अलग रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल के लिए और अधिक उपयुक्त हो सकता है । कारकों है कि उंर, लिंग, जातीयता, रोग राज्य, दवा इतिहास, नमूना के मस्तिष्क क्षेत्र के रूप में मानव मस्तिष्क ऊतक की परिवर्तनशीलता का निर्धारण, और पीएमआई ध्यान में रखा जाना चाहिए जब व्याख्या और प्रकाशन डेटा । एक प्रयोगात्मक स्तर पर यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि पृथक केशिकाओं अभी भी pericytes शामिल हैं, लेकिन astrocytic endfeet प्रक्रिया४४द्वारा निकाल दिए जाते हैं । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि यहां प्रस्तुत मॉडल रक्त मस्तिष्क बाधा के एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में कार्य करता है (यानी, केशिका endothelial कोशिकाओं) नहीं बल्कि neurovascular इकाई के एक मॉडल के रूप में ।

किसी भी मानव ऊतक के साथ कार्य करना हमेशा एक अंतर्निहित सुरक्षा जोखिम प्रस्तुत करता है और शोधकर्ताओं को संक्रमण से बचने के लिए अलगाव प्रक्रिया के दौरान उचित एहतियात बरतने चाहिए । विशेष रूप से, अमेरिका में, मानव ऊतक के साथ काम प्रयोगशाला अंतरिक्ष निर्दिष्ट है कि 2 बीएसएल है प्रमाणित और एक सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा A2) भी शामिल है की आवश्यकता है । इसके अलावा, कर्मचारियों को व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी, लैब कोट, दस्ताने, और चेहरा ढाल) और मानव ऊतक के साथ काम करने के लिए और निर्दिष्ट उपकरण का उपयोग करें और खतरनाक अपशिष्ट हैंडलिंग को लागू करना चाहिए । इन सुरक्षा उपायों को लागू करने के समय लेने वाली है, लागत गहन, और प्रक्रिया की कठिनाई बढ़ जाती है, विशेष रूप से अनुभवहीन प्रयोगशाला कर्मियों के लिए.

रक्त मस्तिष्क बाधा अत्यधिक एक अच्छी तरह से परिभाषित७१सीएनएस के साथ जीवों के बीच संरक्षित है । मानव रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडलिंग मुश्किल है क्योंकि neurovascular इकाई की कोशिकाओं के बीच जटिल neurovascular युग्मन है । एक वयस्क मानव मस्तिष्क के बारे में औसत में है अनुमानित किया गया है ८६,०००,०००,००० न्यूरॉन्स और यह सोचा है कि लगभग हर न्यूरॉन के आसपास में अपनी केशिका है ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के साथ उचित आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए७२,७३. केशिका endothelial कोशिकाओं रक्त मस्तिष्क इंटरफ़ेस (एक स्वस्थ वयस्क मानव के लिए 12-18 एम2 ) की सबसे बड़ी सतह क्षेत्र का गठन । तंग जंक्शनों solutes के paracellular प्रसार अवरुद्ध द्वारा pharmacotherapeutics की एक विस्तृत सरणी के लिए एक बाधा प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके अलावा, कई अध्ययनों neurodegenerative विकारों में बाधा रोग का वर्णन, जैसे, अल्जाइमर रोग७४, स्ट्रोक७५, मिर्गी३८,७६, एकाधिक स्केलेरोसिस७७, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट28,७८। इस प्रकार, यह है कि बारीकी से मानव रक्त मस्तिष्क बाधा प्रतिनिधित्व करते है और स्वास्थ्य और रोग में बाधा समारोह की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति मॉडल स्थापित करने के लिए आवश्यक है ।

कई इन विट्रो कोशिका संस्कृति के मॉडल रक्त मस्तिष्क बाधा मौजूद; विषय पर विशेषज्ञ की समीक्षा के लिए ४१,४९,५१,६९,७९,८०देखें । संक्षेप में, प्राथमिक संस्कृति और अमर मस्तिष्क केशिका endothelial सेल लाइनों के लिए दोनों हौसले से अलग मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं उपलब्ध हैं । सेरेब्रल microvessel endothelial कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों ज्यादातर माउस से उपयोग किया जाता है, चूहा, सुअर, और गाय. हालांकि, प्राथमिक सेल संस्कृतियों के बाद से कोशिकाओं को ताजा अलग किया जाना चाहिए श्रम गहन हैं । अमर मस्तिष्क केशिका endothelial सेल लाइनों माउस, चूहा, और मानव से उपलब्ध है और कम श्रम गहन हैं, क्योंकि वे लंबे समय तक इस्तेमाल के लिए पारित किया जा सकता है । हालांकि, यहां तक कि अमर सेल लाइनों कितनी बार वे अपने endothelial विशेषताओं को खोने से पहले पारित किया जा सकता है पर एक सीमा है । दोनों प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अमर कोशिकाओं लाइनों अक्सर प्लेटों पर संस्कृति के लिए मस्तिष्क केशिका endothelium मॉडल और बाधा पारगम्यता और सेल monolayer भर में दवा परिवहन उपाय कर रहे हैं, जिससे रक्त के लिए मस्तिष्क परिवहन नकल उतारा४१ ,८१,८२. इन मॉडलों में संस्कृति मीडिया भी संशोधित या astrocytes, pericytes, या शिविर४१,८३,८४जैसे अंय शारीरिक रूप से प्रासंगिक कारकों के साथ पूरक हो सकता है ।

अमर सेल लाइनों का लाभ उनके अपेक्षाकृत आसान पहुंच और उपलब्धता है । जबकि प्रसंस्कृत endothelial कोशिकाओं संगम तक पहुंच सकते हैं, वे endothelial कोशिका गुण खो के रूप में वे एक monolayer में साथ-साथ बढ़ता है । उदाहरण के लिए, कल्चरल hCMECs प्रदर्शन पी जीपी जैसे ट्रांसपोर्टरों की कम अभिव्यक्ति, तंग जंक्शन प्रोटीन, और प्रदर्शन चर पारगम्यता xenobiotics करने के लिए४१. चित्रा 4 ताजा अलग मानव केशिकाओं की तुलना में hCMEC/D3 कोशिकाओं में पी जीपी प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक पश्चिमी दाग से पता चलता है । कुल प्रोटीन की एक 10 गुना कम मात्रा के बावजूद, पी जीपी के लिए संकेत hCMEC/D3 कोशिकाओं की तुलना में अलग मानव केशिकाओं में मजबूत है । यह इंगित करता है कि hCMEC/D3 कक्षों ने P-gp प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक महत्वपूर्ण राशि संस्कृति में खो दिया है । इसके अलावा, संस्कृति मीडिया, पर्यावरण, और उपकरणों में अंतर बाधा अखंडता, यानी, Transwell प्लेट परख में तीळ माप के प्रमुख उपायों को प्रभावित करते हैं । इन मुद्दों में से कुछ अलग मस्तिष्क केशिका मॉडल है कि अधिक निकटता vivo मेंमानव रक्त मस्तिष्क बाधा का प्रतिनिधित्व करता है का उपयोग करके दूर किया जा सकता है ।

पृथक मस्तिष्क केशिकाओं जीनोमिक्स, प्रोटियोमिक्, कार्यात्मक प्रोटियोमिक्, और cellomics अध्ययन (चित्रा 5) सहित अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, इन क्षेत्रों में से प्रत्येक के भीतर अलग मस्तिष्क केशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकों और तरीकों मौजूद हैं । विशेष रूप से, चित्रा 5 में दिखाया प्रयोगात्मक तकनीक स्रोतों की एक संख्या से पृथक मस्तिष्क केशिकाओं पर इस्तेमाल किया जा सकता, मानव सहित, गोजातीय, मूषक, और सुअर का ऊतक, जो शोधों अनुसंधान की सुविधा हो सकती है. उदाहरण के लिए, ली एट अल । ८५ के जीनोमिक्स का अध्ययन किया रक्त मस्तिष्क बाधा mRNA शुद्ध द्वारा दमन उपतंत्र संकरण का उपयोग कर चूहे मस्तिष्क केशिकाओं से पृथक । साथ ही, ऑट एट अल. ८६ आरटी-पीसीआर और qRT-पीसीआर PXR द्वारा पी जीपी के विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया । कई proteomic अध्ययन पश्चिमी सोख्ता3का उपयोग, डॉट दाग विश्लेषण८७, सरल पश्चिमी परख3,३८, एलिसा८८,८९, immunoprecipitation3, और immunostaining3,९०,९१. ब्रेन endothelium, McCaffrey एट अल में ट्रांसपोर्टर तस्करी का विचार । ९२ अलग मस्तिष्क केशिकाओं के उपसेलुलर अंश का इस्तेमाल किया । sánchez डेल Pino एट अल. ९३रक्त मस्तिष्क बाधा भर में ट्रांसपोर्टर स्थान और परिवहन दिशा विचार करने के लिए पृथक गोजातीय endothelial झिल्ली बुलबुले का इस्तेमाल किया । अंय proteomic अध्ययन में, शोधकर्ताओं ने तरल क्रोमैटोग्राफी और मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए ट्रांसपोर्टर प्रोटीन९४,९५,९६यों तो इस्तेमाल किया । कार्यात्मक proteomic अध्ययन ट्रांसपोर्टर और रिसाव परख2,३८का उपयोग किया है । Hartz एट अल. 2 इस्तेमाल zymography अलग मस्तिष्क केशिकाओं में एंजाइम गतिविधि का निर्धारण करने के लिए । इसके अलावा, विशाल cellomic सेल संस्कृति का उपयोग कर अनुसंधान कई endothelial सेल लाइनों और रक्त मस्तिष्क बाधा८२,८३,८४के मॉडल उत्पंन किया है । इन मॉडलों के साथ, आम परख का इस्तेमाल किया प्रवास परख९७,९८, व्यवहार्यता और विषाक्तता परख९९शामिल हैं, और angiogenesis परख९८।

अलग मस्तिष्क केशिकाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि और रक्त मस्तिष्क बाधा पर संकेत रास्ते का विवरण के सटीक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं । यह कारण है, भाग में, मस्तिष्क की केशिका सामग्री के लिए, जो केवल लगभग 1% (v/ इस प्रकार, पूरे मस्तिष्क homogenate या शुद्ध केशिका endothelial कोशिकाओं के लिए एक विकल्प के रूप में मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग सबसे अधिक संभावना एक गरीब संकेत करने के लिए शोर अनुपात24में परिणाम होगा । इसके अलावा, अलगाव के बाद, मस्तिष्क केशिकाओं (माउस और चूहे से अप्रकाशित डेटा), जो विशिष्ट संकेत रास्ते विचार करने के लिए अध्ययन की अनुमति देता है कम से 6 एच के लिए व्यवहार्य हैं । यह एक ही तैयारी से एक नियंत्रण समूह को शामिल करने के लिए सिफारिश की है ।

इस रिपोर्ट में चर्चा की अलग केशिका मॉडल के रूप में रक्त मस्तिष्क बाधा के प्रतिनिधि और शोधों मॉडल, स्वास्थ्य और रोग में बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए की जरूरत है । यहाँ हम एक अच्छी उपज और उच्च गुणवत्ता है कि रक्त मस्तिष्क बाधा के एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं पर अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. पृथक केशिकाओं उनके मूल संरचना और समारोह है, जो उनके बाद अलगाव आणविक, जैव रासायनिक, और शारीरिक परख की एक संख्या के लिए उपयोग की अनुमति देता है बनाए रखने । देखभाल जब मानव ऊतक नमूनों से निपटने, अधिमानतः एक बीएसएल 2 या उच्च सेटिंग में लिया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सभी मानव मस्तिष्क ऊतक के नमूनों (NIH अनुदान संख्या: P30 AG028383 को एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान से) प्रदान करने के लिए यूके-एडीसी ब्रेन टिशू बैंक में डॉ पीटर नेल्सन और सोन्या एंडरसन को धन्यवाद और स्वीकार करते हैं । हम मैट Hazzard और टॉम डोलन, सूचना प्रौद्योगिकी सेवाओं, अकादमिक प्रौद्योगिकी और संकाय सगाई, केंटुकी के चित्रमय सहायता के लिए विश्वविद्यालय धंयवाद । इस परियोजना के राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के नेशनल इंस्टीट्यूट से अनुदान संख्या 1R01NS079507 द्वारा समर्थित किया गया था (बीएसफ के लिए) और राष्ट्रीय एजिंग पर संस्थान से अनुदान संख्या 1R01AG039621 द्वारा (A.M.S.H.) । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और यह जरूरी है कि उंर बढ़ने पर मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक या राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है । लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

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Hartz, A. M. S., Schulz, J. A.,… More

Hartz, A. M. S., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

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