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Neuroscience

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2, 1, 3, 2
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

Summary

Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

Abstract

Función de barrera blood - brain de comprensión bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que tienen la promesa de mejorar la entrega de la droga de cerebro, mejorar la protección del cerebro y tratar el cerebro trastornos. Sin embargo, es difícil estudiar la función humana barrera blood - brain. Así, hay una necesidad crítica de modelos apropiados. En este sentido, los capilares del cerebro aislados de tejido cerebral humano representan una herramienta única para estudiar la función de barrera cerca de la situación humana en vivo como sea posible. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar los tubos capilares del tejido de cerebro humano en un alto rendimiento y con pureza y calidad constante. Los capilares están aislados del tejido de cerebro humano fresco mediante homogeneización mecánica, gradiente de densidad centrifugación y filtración. Después del aislamiento, los capilares del cerebro humano pueden utilizarse para diversas aplicaciones, incluyendo ensayos de fugas, imágenes de células vivas y ensayos inmune para estudiar la expresión de la proteína y función de la actividad enzimática y señalización intracelular. Los capilares del cerebro humano aisladas son un modelo único para aclarar la regulación de la función humana barrera blood - brain. Este modelo puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de sistema nervioso central (SNC), que ayudará al desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de trastornos de la CNS.

Introduction

La barrera blood - brain es una interfaz muy controlada entre la sangre y el cerebro que determina lo que entra y sale del cerebro. Anatómicamente, las células endoteliales componen la barrera hemato - encefálica y forman una red continua, compleja. Fisiológicamente, esta red capilar proporciona el cerebro con oxígeno y nutrientes mientras que al mismo tiempo la eliminación de dióxido de carbono y productos metabólicos de desecho. Lo importante, la evidencia apoya que los cambios en la barrera contribuyen a numerosas patologías, como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, accidente cerebrovascular1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerebro células endoteliales también sirven como una barrera al tratamiento mediante el bloqueo de la absorción de drogas en el cerebro, por ejemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme tras tumor resección8,9, 10. en este sentido, los capilares del cerebro humano aisladas representan un modelo único ex vivo barrera blood - brain que se asemeja a la barrera propiedades en vivo, que permite el estudio de la función de barrera y disfunción en la salud y la enfermedad. En este artículo, nos proporcionan un protocolo para aislar los capilares cerebrales del cerebro humano con una alta calidad capilar y rendimiento para el estudio de la barrera blood - brain.

En 1969, Siakotos et al. 11 fueron los primeros en informar el aislamiento de los capilares del cerebro bovino y humano de tejido de cerebro usando densidad gradiente centrifugación y vidrio grano columna separación. Más tarde, Goldstein et al. 12 mejorar este método mediante la adición de varios pasos de filtración para disminuir la cantidad de tejido necesario para el estudio de los capilares del cerebro aislados de ratas, manteniendo la actividad metabólica del transporte de glucosa. Desde entonces, los investigadores optimizan el procedimiento de aislamiento capilar numerosas veces, mejorando el método y el cerebro modelo capilar con cada iteración13,14,15. Por ejemplo, Pardridge et al. 16 aislados bovinos capilares mediante digestión enzimática, en lugar de homogeneización mecánica y posteriormente pasa una suspensión capilar a través de un filtro de malla de 210 μm y una columna de bolas de vidrio. Estas modificaciones mejoraron la mancha de exclusión azul de tripano de capilares del cerebro aislado y así, aumentaron la viabilidad de las células endoteliales. En la década de 1990, Dallaire et al. 17 aislados capilares bovinos y ratas que eran claras de contaminación neuronal y mantener la actividad metabólica de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GTase) y fosfatasa alcalina. En el año 2000, Miller et al. 18, utiliza aislado de rata y los capilares del cerebro porcino en combinación con la microscopía confocal para mostrar la acumulación de sustratos de transporte en el lumen de los capilares. Posteriormente, nuestro laboratorio ha continuado optimizar el procedimiento de aislamiento capilar cerebral y hemos establecido ensayos de transporte para determinar la P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, cáncer de mama resistencia proteína (BCRP)22,23y 2 (Mrp2) de la proteína de resistencia a múltiples drogas actividad de transporte de24 . En 2004, hemos publicado dos informes donde utilizamos los capilares del cerebro aislado de rata para investigar diferentes vías de señalización. En Hartz et al. 21, se encontró que el péptido endotelina-1 rápidamente reversible reduzca la función de transporte de P-gp en capilares del cerebro, actuando a través del receptor de endothelin receptor B (ETB), óxido nítrico sintasa (NOS) y proteína quinasa C (PKC). En Bauer et al. 19, demostramos la expresión del receptor del receptor nuclear pregnano X (PXR) y mostró PXR-modulación de la función de transporte y expresión de P-gp en los capilares del cerebro. En experimentos con ratones transgénicos de PXR humanizados, hemos ampliado esta línea de investigación y mostró en vivo apretando de la barrera por regular P-gp a través de la activación de hPXR25. En 2010, Hartz et al. 26 utiliza este enfoque para restablecer la expresión de la proteína P-gp y transporte actividad en ratones de (hAPP) la proteína precursora del amiloide humanos transgénicos que sobreexpresan hAPP. Además, restauración de P-gp en hAPP ratones redujeron significativamente la amiloide beta (Aβ)40y niveles de Aß42cerebro.

Además de estudiar vías de señalización, los capilares del cerebro aislado pueden utilizarse para determinar los cambios en la permeabilidad capilar que denominamos fuga capilar. En particular, el análisis de fuga de Texas Red se utiliza para evaluar la fuga de colorante fluorescente rojo de Texas desde el lumen capilar con el tiempo y estos datos entonces se utilizan para analizar las tasas de salida. Tasas de fuga capilar aumento en comparación con las de los capilares de control indican cambios en la integridad física de la barrera blood - brain2. Esto es valioso porque hay numerosos Estados de enfermedad asociados con la interrupción de la barrera, por ej., epilepsia, esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y cerebral traumática lesión27,28,29, 30. Otros grupos también han utilizado los capilares aislados para discernir las vías de señalización que regulan la expresión de la proteína y la actividad de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Por último, hemos seguido optimizar este método para el aislamiento de los capilares del cerebro humano y, recientemente, nos mostraron mayor expresión de P-gp en el humana barrera hemato - encefálica en pacientes con epilepsia en comparación con los individuos del control de asimiento-libre38 . Tomados juntos, estos desarrollos demuestran que los capilares del cerebro aislado pueden servir como modelo para estudiar la función de barrera.

Varios en vivo, ex vivoy en vitro barrera blood - brain los modelos se han utilizado en investigación básica y la detección de drogas industriales, principalmente con el objetivo de la prueba de entrega de la droga al cerebro39,40,41 ,42,43,44. Además aisladas ex vivo capilares del cerebro, modelos actuales de la barrera hemato - encefálica incluyen en silico modelos, en vitro cultura de célula de las células endoteliales capilares cerebrales aislados o líneas de células inmortalizadas de varios especie, en vitro cultura de células de madre pluripotenciales humanas (hPSC) que se diferencian en células endoteliales capilares del cerebro y modelos de microfluidos en un chip.

Modelos in silico se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos de selección de candidatos de la droga basados en predicha de la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) propiedades. Métodos tales como modelos de relación (QSPR) propiedad de la estructura cuantitativa y cuantitativa estructura-actividad relación (QSAR) son métodos populares utilizados en el cribado de alto rendimiento de las bibliotecas predecir penetración cerebral de fármacos candidatos 45 , 46. estos modelos son útiles para las moléculas de la pantalla de propiedades de penetración de barrera.

Betz et al. 47 estableció monocapas de células endoteliales capilares cerebrales cultivadas como un sistema de modelo en vitro barrera blood - brain. In vitro de la célula cultura modelos tejido fresco o líneas celulares endoteliales inmortalizado como las células endoteliales del microvessel cerebral humano (hCMECs) pueden ser otra herramienta de proyección de alto rendimiento para la penetración del cerebro o estudios mecanísticos. Sin embargo, modelos de cultura de célula endotelial capilar cerebral falta el estrés fisiológico del esquileo del flujo de sangre dentro del lumen capilar están limitados en su complejidad biológica en general y experimentan cambios en la expresión y localización de los componentes importantes de la barrera como las proteínas de Unión estrecha, iones, transportadores, enzimas y receptores de la superficie de canales48,49,50. Por el contrario, monocapas endoteliales derivan de hPSCs, tienen sacarosa baja permeabilidad en comparación con las culturas hCMEC/D3 y contener expresión polarizada de algunos transportadores de la barrera blood - brain, moléculas de adhesión y uniones estrechas51, 52. sin embargo, estas células también están sujetos a cambio de las propiedades en la cultura y el sistema debe ser validado para su recapitulación en vivo barrera propiedades52.

Nuevas tendencias en la investigación de la barrera hemato - encefálica incluyen utilizando sistemas de cultivo de tejidos 3D para crear capilares artificiales, utilizando la tecnología del órgano-on-chip para generar dispositivos microfluídicos, o utilizando la tecnología de fibra hueca53, 54 , 55. los capilares artificiales, sin embargo, tienen significativamente mayores diámetros (100 – 200 μm) que los capilares cerebrales (3 – 7 μm). Por lo tanto, el esquileo las fuerzas en vitro no completamente se asemejan a la situación en vivo . Esto se aborda en los dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", donde compartimientos de "sangre" y "cerebro" de forma artificial de las membranas y líquidos son bombeados a través de estos dispositivos microfluídicos fuerzas de esquileo. Del mismo modo, co-cultivos de células endoteliales en varias combinaciones con astrocitos y células musculares lisas vasculares también han sido utilizados con la tecnología de fibra hueca para recrear parámetros reológicos presentes en vivo las condiciones56 , 57 , 58. sin embargo, no está claro cómo este modelo refleja otras propiedades de la barrera hemato - encefálica como transporte, metabolismo, señalización y otros. Estos modelos artificiales capilar y chip son adecuados para la detección de alto rendimiento de drogas, pero las células utilizadas para generar estos modelos también están sujetos a cambio en la cultura.

Rebanadas de cerebro congelado y fijo o cerebro primario, cultivos de células endoteliales capilares son modelos adicionales que pueden utilizarse paraestudiar la microcirculación humana5,59,60,61. Por ejemplo, inmunohistoquímica del tejido de cerebro fija se utiliza para determinar la localización de proteínas y expresión en sana en comparación con el tejido enfermo.

Además de los modelos en vitro y rebanadas de tejido capilares descrita, recientemente aisladas del cerebro pueden ser utilizados para estudiar la función de la barrera blood - brain. Limitaciones de este modelo capilar aislada incluyen la dificultad para obtener tejido cerebral humano fresco, ausencia de astrocitos y neuronas y un proceso relativamente largo de aislamiento. Una ventaja del modelo capilar cerebral aislado es que este modelo se parece a la situación en vivo y, por lo tanto, se puede utilizar para caracterizar la disfunción y la función de barrera. Lo importante, también puede ser utilizado para discernir mecanismos de señalización mediante multitud de ensayos y técnicas moleculares3,19,62,63.

Nuestro laboratorio tiene acceso a ambos tejidos frescos y congelados de cerebro humano a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M)64. En este contexto, las autopsias siguen un protocolo estándar, se obtienen cerebros en < 4 h y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Dado este acceso único para el tejido cerebral humano, establecimos y optimizado un protocolo para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano que se traduce en un alto rendimiento de tubos capilares del cerebro humano intacto y viable. Dos extremos comunes de interés son para determinar la expresión de la proteína y la actividad. En este sentido, nosotros y otros hemos establecido varios ensayos que pueden utilizarse para estudiar la expresión de la proteína y niveles de actividad con los capilares del cerebro aislado. Estos ensayos incluyen el Western Blot, Western Simple ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), zymography, ensayos de actividad de transporte, y ensayos de fuga capilar. Estos ensayos permiten a los investigadores a estudiar los cambios en la función de barrera en condiciones patológicas humanas, determinar las vías que regulan la actividad y expresión de la proteína e identificar dianas farmacológicas para el tratamiento de la barrera hemato - encefálica asociada enfermedades.

Tomados juntos, recién los capilares del cerebro aislado pueden servir como un modelo robusto y reproducible de la barrera blood - brain. Sobre todo, este modelo puede combinarse con muchos diferentes ensayos para determinar una amplia gama de puntos finales para el estudio de la función barrera.

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Protocol

La siguiente información se basa en la seguridad actual y normas reglamentarias de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY, Estados Unidos. Como precaución de seguridad, consulte programa de seguridad biológica de la institución y los reglamentos y recomendaciones más actuales antes de trabajar con tejido humano.

PRECAUCIÓN: Tejido humano puede ser una fuente de patógenos transmitidos por la sangre, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (HCV) y otros. Trabajo con tejido humano plantea el riesgo de infección de patógenos de la sangre. Por lo tanto, ciertas consideraciones reglamentarias y de seguridad son imprescindibles cuando se trabaja con tejido humano para proteger al personal de laboratorio. Trabajo con tejidos humanos en los Estados Unidos requiere de un laboratorio de bioseguridad nivel 2, así como las precauciones de seguridad y formación de acuerdo con el NIH sección IV-B-7, Ley de OSHA de 1970 cláusula 5(a)(1) y el programa de seguridad institucional. En general, se debe obtener aprobación del Comité de bioseguridad institucional o junta de revisión institucional antes de realizar cualquier investigación con materiales humanos (tejido, fluidos corporales). La formación es necesaria para todo el personal trabajando con materiales humanos e incluye entrenamiento de seguridad de laboratorio básico, e.g., químicos de higiene y seguridad en el laboratorio, así como formación específica sobre seguridad biológica, residuos peligrosos y ser humano patógenos de la sangre. Todo el personal trabajando con materiales humanos es muy recomendables para obtener vacunas de Hepatitis B, antes de trabajar con materiales humanos. Personal se requiere usar equipo de protección personal específico al trabajar con materiales humanos, por ejemplo., una bata de laboratorio con manguito y un rostro protector y guantes en todo momento. Todo el trabajo se realiza en un gabinete de bioseguridad (clase 2). Todo el equipo que viene en contacto con materiales humanos y cualquier desecho de materiales humanos es manejado adecuadamente para evitar contaminación o infección del personal. Todos los equipos y las superficies se limpian con etanol del 10% cloro y 75% después de cada procedimiento con materiales humanos. Un derrame con materiales humanos debe limpiarse inmediatamente para arriba. La cristalería es esterilizada después de cada uso. Residuos, incluyendo el tejido humano no fijado, es recogido en una bolsa para residuos biológicos marcados y esterilizado. Objetos punzantes se recogen en un recipiente imperforable y fuga etiquetado como riesgo biológico. Todos los residuos de materiales humanos está dispuesto según las normas de seguridad biológica de la institución.

Nota: Nuestro laboratorio obtiene muestras frescas de corteza frontal de personas fallecidas a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M). Criterios de inclusión son: inscripción en el estudio de cohorte longitudinal autopsia de UK-ADC y un intervalo Post Mortem (PMI) ≤4 h64. Las autopsias siguen un protocolo estándar y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Un PMI corto de menos de 4 h es de máxima importancia para asegurar viabilidad capilar después de aislamiento. Puede utilizarse tejido fresco y congelado. Si la congelación es necesaria, tejido cerebral humano recién obtenida debe ser choque congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C. Tejido fresco o descongelado debe ser almacenado en búfer de aislamiento (véase abajo) y procesado rápidamente. Encontramos que 10 g de tejido fresco de humano rendimientos alrededor de 100 mg de capilares del cerebro (peso húmedo).

1. configuración

  1. Preparación de buffer
    Nota: El volumen de amortiguamiento necesitada depende de la cantidad de tejido. Todos los volúmenes de buffer en el siguiente protocolo se basan en 10 g de tejido de la corteza del cerebro humano.
    1. L de tampón de aislamiento: Uso 1,5 L de salino tamponado con fosfato de Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, Na2HPO4de 8,1 mM, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) y suplemento con D-glucosa (1,35 g de 5 mm. ) y piruvato de sodio 1 mM (0,165 g). Después de agregar la glucosa y del piruvato, ajustar a pH 7,4 con hidróxido de sodio. Enfriar y almacenar la solución a 4 ° C antes de usar.
    2. Albúmina de suero bovino (BSA): Añadir 10 g de polvo de BSA a 1 L de tampón de aislamiento a una concentración final de BSA 1%. Revolver lentamente para evitar burbujas, ajustar a pH 7,4 y almacenar a 4 ° C durante la noche. Inmediatamente antes de su uso, Revuelva suavemente; evitar la formación de burbujas para evitar la desnaturalización de la albúmina.
    3. medio de gradiente de densidad: pesar 18 g de medio de gradiente de densidad en un frasco de vidrio y agregar una barra de agitación magnética. Añadir 60 mL de tampón de aislamiento y agite vigorosamente por 5 minutos hasta que todo el polvo se suspende. Tienda durante la noche a 4 ° C para permitir que el medio de gradiente de densidad disolver. Agitar durante 10 minutos antes de usar.
    4. Almacenar todos los búferes a 4 ° C; Mantenga todas las herramientas y buffers en el hielo durante el procedimiento de aislamiento completo. Revolver todos los búferes antes de su uso.
  2. Disposición experimental
    1. Montar la mano del mortero de la amoladora de Potter-Elvehjem tejido sobre el agitador electrónico de arriba. Coloque el molinillo de tejido de Potter-Elvehjem y los homogeneizadores Dounce con mortero en el hielo bajo el capó. Preparar una malla de filtro de 300 μm (5 x 5 cm2), doblar a un cono e insertar y adjuntar a una 50 mL tubo Falcon con cinta adhesiva (figura 1A).
    2. Aros de conexión y filtros de la tensión de la célula (tamaño de poro: 30 μm) en tubos Falcon de 50 mL. Preparar bolsas de residuos biosanitarios hospitalarios. Colocar los equipos en la seguridad de la biotecnología gabinete (véase Tabla de materiales).

2. preparación de muestras de cerebro

Nota: La figura 1A muestra la tabla de flujo del procedimiento de aislamiento completo que se describe a continuación. Tejido cerebral humano puede provenir de cualquier parte de la corteza y puede utilizarse fresco o congelado. Tejido cerebral congelado puede ser descongelado a temperatura ambiente (sin buffer; ~ 30 min para 10 g). Para obtener resultados comparables, el tejido cerebral se debe obtener de la misma región del cerebro para cada experimento. Este protocolo está optimizado para fresco (PMI < 4 h) corteza cerebral humana que no ha sido congelada.

  1. Preparación del tejido de cerebro humano: documentar el peso de los tejidos del cerebro. Todos los números en el siguiente protocolo están apropiados para 10 g de tejido cerebral humano fresco. Coloque el tejido de cerebro en un plato de Petri de 100 mm. Remueva cuidadosamente las meninges con fórceps. Utilice un bisturí para cortar la materia blanca.
  2. Picado del tejido de cerebro humano: cuidadosamente corte el tejido de cerebro y picar con un bisturí. Carne picada durante unos 5 minutos (piezas de 2 – 3 mm). Transferir el tejido cerebral a la amoladora de tejido de Potter-Elvehjem. Añadir 30 mL de tampón de aislamiento.
    Nota: Las piezas de tejido picada son difíciles de ver ya que el tejido cerebral se convierte en ruido de fondo durante el proceso de picado.

3. homogeneización

  1. Amoladora de tejido Potter-Elvehjem (distancia: 150 – 230 μm): homogeneizar cada muestra con 100 golpes a una velocidad de homogeneizador de 50 rpm. Documentar el tiempo cada 25 golpes y el tiempo total necesario para 100 golpes. Vea la tabla 1 para un protocolo propuesto homogeneización; el tiempo total para homogeneizar 10 g de corteza frontal humana es alrededor de 22 minutos. No agregue el aire para evitar burbujas.
  2. Homogeneizadores Dounce (distancia: 80 a 130 μm): transferir el homogeneizado a un homogeneizador Dounce en hielo. Homogeneizar la suspensión con 20 golpes (~ 6 s/movimiento, total de ~ 2 minutos). Evitar las burbujas.

4. centrifugación

  1. Distribuir el homogeneizado de cerebro igualmente en cuatro tubos de centrifugación de 50 mL y documento el volumen total del homogeneizado. Distribuir 50 mL de tampón de gradiente de densidad en los tubos de centrifugación (12,5 mL por tubo). Utilizar 10 mL de tampón de aislamiento enjuagar el mortero y homogeneizador, y distribuir en los cuatro tubos de centrifugación (~2.5 mL por tubo).
  2. Cierre firmemente los tubos de centrifugadora con tapas. Mezclar el homogeneizado, medio de gradiente de densidad y amortiguación agitando vigorosamente los tubos. Centrifugue a 5.800 x g durante 15 min a 4 ° C (rotor de ángulo fijo); Seleccione una velocidad de deceleración media para mantener el sedimento al tubo. Deseche el sobrenadante y resuspender cada precipitado en 2 mL de 1% de BSA.

5. filtración

Nota: Para separar los tubos capilares de células de sangre rojas y otros restos celulares, son necesarios varios pasos de filtración.

  1. malla de 300 μm: después de volver a suspender el precipitado, filtrar la suspensión a través de la malla de 300 μm. Los capilares se filtran a través de la malla, mientras que los buques más grandes y más grandes desechos de cerebro permanecen en la malla. Lavar cuidadosamente la malla con hasta 50 mL de 1% de BSA. Deseche la malla.
    Nota: Este paso de filtración elimina la suspensión capilar de vasos o trozos de restos de cerebro más grande.
  2. Filtro de tensión de celda 30 μm
    Nota: Este paso de filtración separa los capilares de células de sangre rojas y otros desechos del cerebro.
    1. Distribuir el filtrado capilar en el paso 6.1 sobre los filtros de cinco 30 μm células cepa (aproximadamente 10 mL del filtrado capilar por filtro de tensión de la célula). Los capilares son retenidos por este filtro, mientras que los glóbulos rojos, células y desechos pequeños del cerebro pasan por el filtro y se recogen en el filtrado.
    2. Lavar cada filtro con 25 mL de 1% de BSA. Luego, vierta todos filtrados sobre el sexto filtro para aumentar el rendimiento. Lavar cada filtro con 50 mL de 1% de BSA; mantener la célula cepa filtros que contienen los capilares y descartar el filtrado.

6. colección capilar

  1. Invierta los filtros y lavar los tubos capilares con 50 mL de 1% de BSA para cada filtro en tubos de 50 mL. Suavemente aplique presión con la punta de la pipeta de una pipeta de 5 mL y moverse a través del filtro para lavar los tubos capilares del cerebro.
  2. Asegúrese de lavar todos los capilares del cerebro, especialmente desde el borde del filtro. Evitar las burbujas ya que esto dificulta el proceso de filtración y aumenta la probabilidad de pérdida capilar.

7. lavado

  1. Después de recoger los tubos capilares, centrifugar las muestras a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C (cubo rotor oscilante). Quite el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en aproximadamente 3 mL de tampón de aislamiento. Combinar todos los pellets resuspendidos de una muestra en un tubo cónico de 15 mL y llenarlo con tampón de aislamiento. Centrifugar nuevamente a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C y lave dos veces más.
  2. Documentar la pureza capilar con un microscopio (100 aumentos) y cámara (figura 1B).
    Nota: El rendimiento capilar del cerebro de 10 g de tejido cerebral humano es generalmente alrededor de 100 mg. Los capilares del cerebro aislado ahora pueden ser utilizados para experimentos, procesados (e.g., Lisado, aislamiento de membrana), o ser flash-congeladas y almacenadas a-80 ° C en criotubos por un mínimo de 6 – 12 meses (evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo).

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Representative Results

Los aislamientos de tejido de cerebro humano producen una suspensión enriquecida en capilares del cerebro humano (figura 1B) con pequeñas cantidades de recipientes más grandes, células de sangre rojas, otras células y algunos restos de células. Algunos capilares se ramifican, y, en algunos, las células de sangre rojas son atrapadas en los lúmenes capilares. El capilar típico tiene un diámetro de 3 – 7 μm y es aproximadamente de 100-200 μm largo con lúmenes abiertos; más extremos capilares se contraen. Usando microscopia confocal, los capilares del cerebro humano aislado revelan una estructura tubular, intacta y morfología. Figura 2A muestra que un representante transmite luz imagen de un cerebro humano con un pericyte adjunto y un glóbulo rojo en el lumen capilar. Todos los resultados en cuanto a diámetro, tamaño y morfología están de acuerdo con informes anteriores sobre la estructura del cerebro aislado capilares12,17,18. El cerebro humano aislado capilar en la figura 2B fue immunostained para la P-gp (verde) utilizando C219 como el anticuerpo primario (1 μg/mL); los núcleos fueron contratinción con DAPI (1 μg/mL).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo para el aislamiento capilar. (A) el pictograma ilustra los principales pasos del procedimiento para aislar a los capilares del cerebro de tejido fresco de humano. (B) el cuadro muestra los capilares del cerebro humano aislado bajo un microscopio de luz directamente después de aislamiento (100 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: cerebro humano aislado capilar. Imagen de (A) A luz transmitida de un cerebro humano aislado capilar. (B) el microscopio confocal imagen muestra un cerebro humano aislado capilar immunostained para la P-gp (verde; C219 1 μg/mL); los núcleos fueron contratinción con DAPI (azul; 1 μg/mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: solución de problemas de centrifugación de densidad. El pictograma indica la preparación después de la centrifugación del gradiente de densidad. Pone de relieve los efectos de demasiado y demasiado poco medio de gradiente de densidad y cómo esto afecta a la separación y la pelotilla capilar resultante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: expresión de proteínas P-gp en los capilares del cerebro humano aisladas. El Western blot muestra bandas fuertes de P-gp (1 μg/mL) en tubos capilares humanos aislados en comparación con las células hCMEC\D3. Fue utilizado β-actina como control de carga (1 μg/μl). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: aplicaciones de los capilares del cerebro humano aislado. Un resumen de las aplicaciones más comunes de los capilares cerebrales aislados publicados en la literatura. Tubos capilares aislados se han utilizado para: 1) genómica85,86, 2) proteómica3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) proteómica funcional2,38y 4) Celómica82, 8384,de,97,98,99. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Accidentes cerebrovasculares Tiempo [min]
1 – 25 7 – 7.5
26-50 5 – 5.5
51 – 75 5 – 5.5
76-100 5 – 5.5
Tiempo total: 22 – 24 min

Tabla 1: Protocolo de homogeneización. El protocolo de homogeneización para la amoladora de tejido de Potter-Elvehjem a homogeneizar 10 g de corteza frontal humana a una velocidad de homogeneización de 50 rpm. Tenga en cuenta que los primeros trazos varios requieren tiempo adicional para homogeneizar el tejido picadito. Después de esta homogeneización inicial, cada trazo es de 12 s de duración (6 s para movimiento hacia abajo, 6 s para el movimiento hacia arriba). Así, después de la homogenización inicial, 5 movimientos es posible en 1 min o 25 movimientos en 5 minutos.

Problema Causa potencial Solución
Ningún Pellet capilar 1) concentración de Ficoll incorrecto 1) ajustar la concentración de Ficoll
2) velocidad de centrifugación incorrecto 2) ajuste la velocidad de centrifugación
3) velocidad de aceleración o desaceleración incorrecta 3) ajustar la velocidad de aceleración o desaceleración
Bajo rendimiento capilar 1) meninges bloqueando pasos de filtración 1) quitar meninges todas antes de la filtración
2) muchos capilares durante el procedimiento de aislamiento 2) calcular la concentración de tampón correctamente, aclare las puntas de pipeta
3) lavado de capilares de filtros PluriStrainer no fue suficiente 3) vuelta filtros e inspeccione cuidadosamente para tubos capilares (microscopio de uso)
4) exceso de burbujas en resuspensions 4) pipeta lentamente para evitar burbujas
Capilares no viables 1) intervalo post-mortem extendida 1) reduce el intervalo si es posible o utilizar cerebro congelado rápido
Usando 2) congeladas del tejido para aislamiento 2) tejido fresco uso
3) hora de aislamiento procedimiento demasiado largo 3) optimizar el flujo de trabajo
4) equipo/buffers no se mantuvieron en hielo durante el procedimiento de aislamiento 4) mantener el equipo y buffers en el hielo durante el aislamiento

Tabla 2: solución de problemas comunes. Una lista de los más comunes errores y problemas que ocurren durante el procedimiento de aislamiento y cómo ellos pueden ser resueltos.

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Discussion

El presente Protocolo describe el aislamiento de los capilares del cerebro humano intacto y viable de tejido fresco. En esta sección, discutimos en detalle lo siguiente: 1) modificaciones en el protocolo 2) solución de problemas de errores comunes, 3) limitaciones de la técnica, 4) la importancia del modelo con respecto a los existentes y modelos alternativos barrera blood - brain, y 5). aplicaciones potenciales de los capilares del cerebro humano aislado.

El protocolo descrito aquí está optimizado para 10 g de tejido fresco corteza frontal humana. Sin embargo, es relativamente sencillo modificar este procedimiento para: 1) más o menos que 10 g de tejido, tejido cerebral 2) congelados o de tejido de 3) el cerebro de una región del cerebro que no sea de la corteza frontal. En primer lugar, con más o menos de 10 g de tejido cerebral, el volumen necesario de los buffers se puede simplemente escalar hacia arriba o hacia abajo para la cantidad de tejido disponible. Así, si sólo hay 5 g de tejido cerebral, el volumen de los amortiguadores debe reducirse a la mitad. En segundo lugar, describimos un aislamiento capilar que utiliza tejido cerebral fresco pero tejido congelado puede usarse tejido fresco de carácter38. En tercer lugar, utilizamos el tejido de cerebro fresco tomado de la corteza frontal, pero los capilares pueden ser aislados de otras regiones corticales cerebrales si hay suficiente tejido disponible. También es posible aislar los tubos capilares de regiones cerebrales no corticales (e.g., la materia blanca), pero estas regiones tienen una célula diferente composición y capilar densidad 66,67,68. Así, utilizando tejido de una región diferente del cerebro probablemente requeriría el protocolo para ser ajustado (p. ej., volumen de buffer, gradiente de densidad media, velocidad de centrifugación o número de pasos de filtración).

El procedimiento de aislamiento capilar, aunque no complejo por se, es sensible a pequeñas perturbaciones o alteraciones en el protocolo. Modificaciones pueden resultar en un rendimiento capilar disminuida o reducida viabilidad capilar. Tabla 2 describe los errores más comunes y problemas que se encuentran durante el aislamiento y listas de consejos para evitar estos errores y soluciones para la resolución de problemas si ocurren. El problema más común asociado con el procedimiento es un bajo rendimiento capilar. La pérdida de los capilares es a menudo la suma acumulativa de pérdidas pequeñas en cada paso y es debido a pequeñas desviaciones en el procedimiento. Un paso crítico en que puede perderse una gran cantidad de capilares es la centrifugación de densidad. Una concentración incorrecta en el búfer de resultados en una densidad incorrecta para separar los tubos capilares de detritos celulares que reducen el volumen de la pelotilla capilar. La figura 3 muestra las consecuencias de demasiado o muy poco medio de gradiente de densidad en el paso de centrifugación relativa homogeneizado de cerebro. Ajuste a la correcta la concentración puede solucionar este problema. Tenga en cuenta que la velocidad de aceleración y deceleración de la centrifugadora también puede afectar la formación de la pelotilla capilares del cerebro. Los capilares también se pueden perder durante los pasos 6 y 7 si parte del material capilar se adhiere a las puntas de pipetas. Este problema puede ser abordado aclarando minuciosamente cada punta de la pipeta antes de cambiarlo. Durante el paso 7, lavado de los tubos capilares del filtro de tensión de la célula puede estar incompleto o capilares pueden pegarse al borde del filtro. Esto se puede evitar activando el filtro bajo el microscopio seguido de pasos de lavado adicional. Pérdida de los capilares durante cada paso del procedimiento de aislamiento puede resultar en una pelotilla capilares insignificante o no hay suficiente material capilar para procesarla y la experimentación.

Aislar tubos capilares del cerebro de tejido fresco de humano representa un modelo de la única barrera blood - brain que se asemeja la situación en vivo . Sin embargo, existen varias limitaciones de la técnica. Uno de los desafíos es la disponibilidad de tejido fresco de humano. Como el PMI óptimo es ≤4 h, tejido cerebral en un PMI significativamente mayor no será lo suficientemente fresco para algunos usos aguas abajo. En algunos casos, puede ser difícil de obtener cantidades de tejido que son lo suficientemente grandes como para varios grupos experimentales, de tal modo restringiendo aplicaciones posteriores. Así, aislar tubos capilares frescos de roedores19, canino69, bovina42o tejido fino del cerebro porcino70 puede ser más conveniente modelar la barrera blood - brain. Factores que determinan la variabilidad del tejido de cerebro humano tales como edad, sexo, origen étnico, estado de la enfermedad, historia de medicación, región del cerebro de muestra y PMI debe tomarse en consideración cuando se publican datos e interpretación. A nivel experimental es importante tener en cuenta que los capilares aislados todavía incluyen pericitos, pero endfeet astrocítico son eliminados mediante el procedimiento44. Debe tenerse en cuenta que el modelo presentado aquí sirve como un modelo ex vivo de la barrera hematoencefálica (es decir, las células endoteliales capilares) pero no como un modelo de la unidad neurovascular.

Trabajo, con cualquier tejido humano siempre presenta un riesgo de seguridad inherente y los investigadores deben tomar las precauciones apropiadas durante el procedimiento de aislamiento para evitar la infección. Específicamente, en los Estados Unidos, trabajo con tejido humano requiere espacio de laboratorio señalada que certificación de BSL 2 e incluye un gabinete de seguridad biológica (Clase A2). Además, el personal debe utilizar equipo de protección personal (es decir., bata, guantes y careta) y equipo de trabajo con el tejido humano y manipulación de residuos biopeligrosos de implementar. Implementar estas medidas de seguridad es desperdiciador de tiempo, costosa y aumenta la dificultad del procedimiento, especialmente para el personal de laboratorio sin experiencia.

La barrera blood - brain se conserva altamente entre los organismos con un bien definido de CNS71. Modelado de la barrera hematoencefálica humana es difícil porque hay complejos neurovasculares de acoplamiento entre las células de la unidad neurovascular. Un cerebro humano adulto se ha estimado que en promedio unos 86 billones neuronas y se piensa que cada neurona tiene su propio tubo capilar en las cercanías para asegurar un suministro adecuado de oxígeno y nutrientes de72,73. Las células endoteliales capilares constituyen la mayor superficie de la interfaz de sangre-cerebro (12-18 m2 para un humano adulto sano). Uniones estrechas representan un impedimento para una amplia gama de farmacoterapéutica bloqueando la difusión paracelular de solutos. Además, numerosos estudios describen la disfunción de la barrera en enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo., la enfermedad de Alzheimer74, carrera75, epilepsia38,76,77de la esclerosis múltiple, y cerebral traumática lesión28,78. Por lo tanto, es imprescindible establecer modelos que representan la barrera cerebro humana de cerca y permiten una mejor comprensión de la función de barrera en la salud y la enfermedad.

Existen numerosos en vitro modelos celulares de cultura de la barrera blood - brain; comentarios expertos sobre el tema consulte 41,49,51,69,79,80. Brevemente, ambos recién aislaron de las células endoteliales capilares del cerebro para cultivo primario y cerebro inmortalizado células endoteliales capilares líneas están disponibles. Sobre todo se utilizan cultivos primarios de células endoteliales de los microvasos cerebrales de ratón, rata, cerdo y vaca. Sin embargo, culturas de célula primaria son necesitandos mucho trabajo puesto que las células deben estar recién aisladas. Líneas de célula endotelial capilar cerebral inmortalizado en ratón, rata y humano y son menos intensivas porque pueden ser pasados para el uso a largo plazo. Sin embargo, las líneas celulares inmortalizadas incluso tienen un límite en cuánto puede ser pasados antes de perder sus características endoteliales. Células primarias, así como líneas de células inmortalizadas a menudo se cultivan en placas de modelo el endotelio capilar cerebral y medir el transporte barrera de la permeabilidad y de la droga a través de la monocapa celular, tal modo mímico transporte de sangre al cerebro41 ,81,82. Los medios de cultivo en estos modelos también pueden modificarse o complementado con astrocitos, pericitos u otros factores fisiológicamente relevantes como campo41,83,84.

La ventaja de líneas celulares inmortalizadas es su relativamente fácil acceso y disponibilidad. Mientras que las células endoteliales cultivadas pueden llegar a confluencia, pierden propiedades de la célula endotelial como crecen lado a lado en una monocapa. Por ejemplo, cultivadas hCMECs Mostrar la expresión reducida de transportadores P-gp, proteínas de Unión estrecha y permeabilidad variable pantalla a xenobióticos41. La figura 4 muestra un Western blot para la expresión de la proteína P-gp en las células hCMEC/D3 comparadas con capilares humanos recién aislados. A pesar de una 10 veces menor cantidad de proteína total, la señal de P-gp es más fuerte en los capilares humanos aislados en comparación con las células hCMEC/D3. Esto indica que las células hCMEC/D3 perdieron una cantidad significativa de expresión de proteínas P-gp en cultura. Por otra parte, las diferencias en los medios de cultivo, ambiente y equipo afectan medidas clave de la integridad de la barrera, es decir, las mediciones de TEER en Transwell ensayos de placa. Algunos de estos problemas pueden superarse utilizando el modelo capilar del cerebro aislado que representa más de cerca el humano barrera blood - brain en vivo.

Capilares cerebrales aisladas se han utilizado para una amplia gama de estudios, incluyendo la genómica, proteómica, proteómica funcional y estudios Celómica (figura 5). Además, muchas técnicas y métodos existen para analizar los capilares cerebrales aisladas dentro de cada uno de estos campos. En particular, las técnicas experimentales que se muestra en la figura 5 se pueden utilizar sobre los capilares del cerebro aislados de un número de fuentes, incluyendo tejidos humanos, bovinos, roedores y porcino, que pueden facilitar la investigación traslacional. Por ejemplo, Li et al. 85 estudios de genómica de la barrera hematoencefálica mediante hibridación sustractiva supresión por purificar mRNA aislado de capilares del cerebro de rata. Además, Ott et al. 86 utilizó RT-PCR y qRT-PCR para estudiar la regulación de la P-gp por PXR. Muchos estudios proteómicos utilizan Western Blot3Dot Blot análisis87, Western Simple ensayos3,38, ELISA88,89, inmunoprecipitación3, y immunostaining3,90,91. Discernir el transportador de la trata de personas en el endotelio cerebral, McCaffrey et al. 92 había usado fraccionamiento subcelular de los capilares del cerebro aislado. Sánchez del Pino et al. 93utilizan vesículas de membrana endotelial bovina aislados para discernir ubicación y transporte dirección de transporte a través de la barrera blood - brain. En otros estudios proteómicos, investigadores utilizaron cromatografía líquida y espectrometría de masas tándem para cuantificar transportador proteínas94,95,96. Estudios de proteómica funcional han utilizado transportador y ensayos de fugas2,38. Hartz et al. 2 utiliza zymography para determinar la actividad enzimática en los capilares del cerebro aislado. Además, cellomic vasta investigación mediante cultivo celular ha generado numerosas líneas celulares endoteliales y modelos de la barrera blood - brain82,83,84. Con estos modelos, ensayos comunes utilizados incluyen migración ensayos97,98, análisis de viabilidad y toxicidad99y de ensayos de angiogénesis98.

Capilares cerebrales aisladas permiten una caracterización precisa de la actividad y expresión de la proteína y descripción de la señalización de vías en la barrera blood - brain. Esto es debido, en parte, al contenido capilar del cerebro, que es sólo aproximadamente el 1% (v/v). Así, usando todo el cerebro homogeneizado o rebanadas de cerebro como sustituto de las células endoteliales capilares purificadas probablemente resultará en una pobre relación señal a ruido24. Además, después de aislamiento, los capilares cerebrales son viables durante al menos 6 h (datos no publicados de ratón y rata), que permite estudios discernir las vías de señalización específicas. Se recomienda incluir un grupo control de la misma preparación.

Modelos representativos y traslacionales de la barrera sangre - cerebro, como el modelo capilar aislado en este informe, se necesitan para estudiar la función de la barrera en salud y enfermedad. Aquí presentamos un protocolo para obtener tubos capilares del cerebro humano aislado en un buen rendimiento y alta calidad que puede servir como un modelo ex vivo de la barrera blood - brain. Capilares aislados conservan su estructura original y función, que permite utilizarlos para un número de post aislamiento molecular, bioquímica y pruebas fisiológicas. Debe tenerse cuidado al manipular tejido humano muestras, preferiblemente en un BSL 2 o superior.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos y reconocemos el Dr. Peter Nelson y Sonya Anderson en el Banco de tejido cerebral de UK-ADC para proporcionar cerebro humano todas las muestras de tejido (NIH número de concesión: P30 AG028383 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento). Agradecemos a Matt Hazzard y Tom Dolan, servicios de tecnología de información, tecnología académica y compromiso de la Facultad, Universidad de Kentucky para asistencia gráfica. Este proyecto fue apoyado por 1R01NS079507 número de subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular (por B.B.) y grant número 1R01AG039621 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento (a A.M.S.H.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular o el Instituto Nacional sobre envejecimiento. Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

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