एक जुदा Cas9 ribonucleoprotein परिसर (RNP) का उपयोग सटीक, कुशल जीनोम संपादन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । यहां, हम प्राथमिक मानव कोशिकाओं और दोनों क्लासिक और उभरते मॉडल जीवों सहित कोशिकाओं और जीवों की एक विस्तृत रेंज भर में इसकी उपयोगिता पर प्रकाश डाला ।
साइट-CRISPR के साथ विशिष्ट eukaryotic जीनोम संपादन (नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता संकुल)-कैस (CRISPR-संबद्ध) सिस्टम जल्दी से जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता का पीछा शोधकर्ताओं के बीच एक आम हो गया है । उपयोगकर्ता सबसे अधिक बार आसानी से reCas9ed गाइड आरएनए (gRNA) के साथ एक जटिल में स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes से व्युत्पंन प्रोटीन को रोजगार । इन घटकों को कोशिकाओं में पेश कर रहे हैं, और डबल फंसे डीएनए (dsDNA) जीनोम के एक पूरक क्षेत्र के साथ बाँधना आधार के माध्यम से, एंजाइम दोनों किस्में एक डबल-किनारा तोड़ (DSB) उत्पन्न करने के लिए सट. बाद में सुधार या तो यादृच्छिक सम्मिलन या हटाने की घटनाओं (indels) या प्रयोगकर्ता के शामिल करने की ओर जाता है-तोड़ने की साइट पर डीएनए प्रदान की ।
एक शुद्ध एकल गाइड आरएनए और Cas9 प्रोटीन, एक RNP फार्म और कोशिकाओं को सीधे दिया करने के लिए इकट्ठे के उपयोग, अत्यधिक कुशल जीन संपादन को प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है । RNP संपादन विशेष रूप से जीन प्रविष्टि, एक परिणाम है कि अक्सर प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है की दर को बढ़ाता है । एक प्लाज्मिड के माध्यम से वितरण की तुलना में, सेल के भीतर Cas9 RNP के छोटे हठ कम बंद लक्ष्य घटनाओं की ओर जाता है ।
अपने फायदे के बावजूद, CRISPR जीन संपादन के कई आकस्मिक उपयोगकर्ताओं को इस तकनीक से कम परिचित हैं । प्रवेश के लिए बाधा कम करने के लिए, हम संदर्भों की एक श्रेणी में RNP रणनीति को लागू करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल रूपरेखा, अपने अलग लाभ और विविध अनुप्रयोगों पर प्रकाश डाला । हम दो प्रकार के प्राथमिक मानव कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और टेम स्टेम/जनक कोशिकाओं (HSPCs) में संपादन को कवर । हम यह भी बताते है कि कैसे Cas9 RNP संपादन पूरे जीवों की सतही आनुवंशिक हेरफेर सक्षम बनाता है, क्लासिक मॉडल roundworm Caenorhabditis एलिगेंस और अधिक हाल ही में पेश मॉडल जलीय, Parhyale hawaiensisसहित ।
fThe CRISPR-Cas9 प्रणाली वैज्ञानिकों के किसी भी जीनोम1के लक्षित क्षेत्रों को बदलने के लिए अनुमति देता है । इस त्वरित और सस्ती प्रौद्योगिकी बुनियादी अनुसंधान में क्रांति ला दिया है और व्यक्तिगत रोग चिकित्सा, परिशुद्धता कृषि के विकास पर गहरा प्रभाव बनाने का वादा किया है, और2से परे । CRISPR संपादन एक democratizing उपकरण है और एक नई प्रयोगशाला में प्रणाली को लागू करने के जीनोम इंजीनियरिंग में कोई विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता है, सिर्फ बुनियादी आणविक जीवविज्ञान कौशल । शोधकर्ताओं अब आनुवंशिक हेरफेर के लिए कुछ वैकल्पिक साधन के साथ पहले से असभ्य जीवों का अध्ययन कर सकते हैं3,4. पिछले पांच वर्षों में अकेले, CRISPR जीनोम संपादन २०० विभिंन रीढ़, invertebrate, संयंत्र, और माइक्रोबियल प्रजातियों पर इंजीनियर के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
CRISPR prokaryotic रक्षा मार्ग से अनुकूलित, कोर साइट विशेष जीनोम संपादन के लिए आवश्यक तत्वों Cas9 प्रोटीन हैं, आमतौर पर एस. pyogenes और codon से-एक जोड़ा परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) के साथ अनुकूलित, और उसके विशेष आरएनए गाइड5,6. हालांकि यहां पर चर्चा नहीं की गई, अन्य Cas9 orthologues या CRISPR endonucleases का भी इस्तेमाल हो सकता है । स्वाभाविक रूप से होने वाली gRNA दो अलग से लिखित टुकड़ों से बना है, CRISPR आरएनए (crRNA) और ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA)7। इन RNAs एक प्रतिलिपि, एकल गाइड आरएनए (sgRNA)8के रूप में जाना जाता है में इनकार किया जा सकता है । सबसे जीनोम संपादकों सुव्यवस्थित sgRNA9चुनते हैं, हालांकि दोहरे गाइड भी नियमित रूप से इस्तेमाल किया जाता है10,11। experimenters एक 20-न्यूक्लियोटाइड (nt) जीनोमिक डीएनए लक्ष्य का चयन, यह सुनिश्चित करना है कि यह Cas9 मांयता के लिए आवश्यक एक छोटी लाइसेंसिंग हस्ताक्षर के बगल में है, एक protospacer आसंन आकृति (पाम) कहा जाता है, और एक gRNA है कि पूरक अनुक्रम शामिल है डिजाइन12 .
एक बार कक्ष के अंदर, RNP परिसर अपने जीनोमिक लक्ष्य, पूरक डीएनए किनारा के साथ gRNA आधार जोड़े को रेखांकित करता है, और फिर एंजाइम दोनों डीएनए किस्में एक डबल-किनारा तोड़2उत्पंन करने के लिए सट । सेल मरंमत मशीनरी को ठीक से कम दो मार्गों में से एक द्वारा DSB: त्रुटि प्रवण गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) मार्ग या समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) है, जो मूल समरूपता के ‘ हथियार ‘ युक्त डीएनए को तोड़ने के दोनों ओर के द्वारा । पूर्व मरंमत मार्ग आम तौर पर indel गठन और फलस्वरूप जीन व्यवधान की ओर जाता है, जबकि बाद experimenters डालने या डीएनए दृश्यों को बदलने के लिए अनुमति देता है1।
संपादन दक्षता और सटीकता मतलब है जिसके द्वारा Cas9 और gRNA कक्ष में प्रवेश पर निर्भर करते हैं । इन घटकों न्यूक्लिक एसिड के रूप में या एक जुदा RNP जटिल13,14,15के रूप में प्रसंस्कृत कोशिकाओं, भ्रूण, या जीवों को दिया जा सकता है । कॉमन न्यूक्लिक एसिड आधारित डिलिवरी तरीकों में शामिल है वायरल transduction, अभिकर्मक, या electroporation mRNA या प्लाज्मिड डीएनए । Cas9 प्रोटीन और गाइड आरएनए तो सेल के भीतर उत्पादन कर रहे हैं और वे एक जटिल बनाने के लिए सहयोगी.
RNP के प्रत्यक्ष वितरण Cas9 प्रोटीन और गाइड आरएनए के अलग शुद्धि की आवश्यकता है । यह घर में किया जा सकता है, या प्रोटीन और sgRNA कई वाणिज्यिक विक्रेताओं में से एक से खरीदा जा सकता है । एक बार प्राप्त कर लिया, Cas9 और gRNA enzymatically सक्षम RNP परिसर के रूप में मिश्रित और निषेचित अंडे में प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा कोशिकाओं को शुरू की है/भ्रूण, लिपिड आधारित अभिकर्मक16, या electroporation । RNP संपादन की पहली रिपोर्ट सी. एलिगेंस gonads17में इंजेक्शन शामिल है । Microinjection अभी भी भ्रूण और पूरे जीवों में RNP शुरू करने का पसंदीदा साधन है, हालांकि प्रभावी electroporation माउस18,19 और चूहे20 भ्रूण में प्रदर्शन किया गया है । हम सीधे सी. एलिगेंस gonads और पी. hawaiensis भ्रूण में RNP इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है और electroporation के एक विशेष प्रकार की सिफारिश करने के लिए जब प्राथमिक मानव कोशिकाओं संपादन RNP उद्धार । इस विधि, nucleofection, अनुकूलित electroporation कार्यक्रमों और सेल प्रकार विशेष समाधान शामिल है और RNP दोनों कोशिका द्रव्य और नाभिक 21 दर्ज करने के लिए अनुमति देता है ।
RNP के साथ जीनोम संपादन कई विशिष्ट लाभ प्रदान करता है । क्योंकि प्रोटीन और आरएनए घटक पूर्व इकट्ठे होते हैं, और गुणवत्ता के वितरण से पहले सुनिश्चित किया जा सकता है, RNP संपादन न्यूक्लिक एसिड आधारित वितरण के साथ जुड़े कई नुकसान से बचा जाता है । अर्थात्, वहां Cas9 का कोई खतरा नहीं है मेजबान जीनोम में डीएनए एकीकरण एंकोडिंग, mRNA क्षरण के लिए कभी नहीं उजागर है, और यह vivo gRNA या प्रोटीन अभिव्यक्ति, तह में के साथ समस्याओं को दरकिनार, और22एसोसिएशन,23। इसके अलावा, RNP का उपयोग करने के लिए कम विषाक्तता की ओर जाता है और दूर से कम लक्ष्य की घटनाओं से प्लाज्मिड आधारित अभिव्यक्ति, RNP के छोटे आधे सेल के अंदर जीवन का परिणाम24,25,26,27।
अंत में, RNP संपादन प्रदर्शन मानव कोशिका लाइनों की एक किस्म में उच्च संपादन दरों की ओर जाता है, fibroblasts के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं, भ्रूण स्टेम सेल (ESCs), प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iSPCs), HSPCs, और टी कोशिकाओं16,24, 25,26,27,28,29; C. एलिगेंस, P. hawaiensisसहित अकशेरूकीय में, और फल मक्खियों3,17,30; zebrafish, चूहों, और चूहों की तरह हड्डीवाला प्रजातियों में31,३२; Arabidopsis, तंबाकू, सलाद पत्ता, चावल, दाखलता, सेब, मक्का, और गेहूं३३,३४,३५,३६सहित संयंत्र प्रजातियों में; और Chlamydomonas, Penicillium, और Candida प्रजातियों में३७,३८,३९। indel गठन की आवृत्ति अधिक हो सकता है जब प्लाज्मिड वितरण की तुलना में RNP का उपयोग कर, और HDR-मध्यस्थता डीएनए प्रविष्टि25,27,29प्राप्त करने के लिए आसान हो सकता है ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित Cas9 RNP का उपयोग करता है और एक प्रभावी, आसानी से अनुकूलनीय तकनीक है कि जैविक प्रणालियों की एक विस्तृत विविधता४०,४१, विशेष रूप से कोशिकाओं है कि अंयथा काम करने के लिए मुश्किल है में लागू करने के लिए सरल है साथ और जीवों में अच्छी तरह से बिना सटीक आनुवंशिक हेरफेर के लिए सिस्टम की स्थापना की । हम कैसे डिजाइन करने के लिए, प्राप्त करते हैं, और विभिंन मॉडल सेल प्रकार और जीवों के पार इसके उपयोग को कवर करने से पहले Cas9 RNP इकट्ठा वर्णन द्वारा शुरू करते हैं । टेम स्टेम/जनक कोशिकाओं (HSPCs) और टी कोशिकाओं को एक ही विधि का उपयोग कर संपादित कर रहे हैं, nucleofection, ताकि वे एक साथ चरण 2 और 3 में इस प्रोटोकॉल को कवर कर रहे हैं । Cके लिए संपादन कार्यविधियां । एलिगेंस चरण 4 और 5, और Pमें वर्णित हैं । hawaiensis संपादन चरण 6 और 7 में शामिल किया गया है । अंत में, के बाद से किसी भी जीव में एक जीन संपादन प्रयोग की सफलता जीनोटाइप अनुक्रमण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, सभी कोशिकाओं और प्रोटोकॉल में वर्णित जीवों के लिए संभव विश्लेषण विधियों का वर्णन उप चरण 8 में उल्लिखित हैं ।
एक सेल लाइन या ब्याज की जीव में एक मजबूत जीनोम संपादन प्रोटोकॉल की स्थापना के अनुकूलन और कई प्रमुख मापदंडों के अनुभवजंय परीक्षण, इस खंड में चर्चा की आवश्यकता है । यहां प्रस्तुत सामांय दृष्टिकोण के कुछ रूपों की कोशिश कर रहा है अत्यधिक प्रोत्साहित किया । इस प्रोटोकॉल की कुंजी सीमा है कि अंय कोशिकाओं या जीवों के लिए इन तरीकों को लागू करने का अध्ययन प्रजातियों के आधार पर एक अलग परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और एक प्रयोगात्मक डिजाइन कि एक उच्च दक्षता जीन नॉकआउट करने के लिए सुराग डीएनए प्रविष्टि को बढ़ावा नहीं कर सकते हैं । इस प्रकार, हम अनुशंसा करते है यहां प्रस्तुत तरीकों के साथ शुरू करने और नीचे वर्णित के रूप में समस्या निवारण ।
जीनोम संपादन एजेंट गुणवत्ता समस्या निवारण:
उत्पादन या क्रय उच्च गुणवत्ता वाले एजेंट किसी भी जीनोम संपादन प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है । Cas9 प्रोटीन लैब में शुद्ध किया जा सकता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा है । कई प्रोटोकॉल RNP व्यंजनों में Cas9 के लिए एक अंतिम एकाग्रता ध्यान दें, लेकिन इष्टतम जीन संपादन गतिविधि किसी भी व्यक्ति Cas9 प्रोटीन की तैयारी है, जो स्रोत के आधार पर बदलता है की विशिष्ट गतिविधि पर निर्भर करेगा । एक बार प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत काम कर रहा है, titrating Cas9 स्तर द्वारा प्रयुक्त RNP की राशि के अनुकूलन पर विचार के लिए एक इष्टतम एकाग्रता की स्थापना: एक कि अनावश्यक बंद लक्ष्य दरार के बिना अत्यधिक विशिष्ट लक्ष्य डीएनए दरार प्रदान करता है के कारण अत्यधिक Cas9४०।
गाइड आरएनए शुद्धता और एकरूपता भी जीनोम संपादन सफलता22के निर्धारकों हो सकता है । खरीदा sgRNAs या अलग crRNA और tracrRNA घटकों को आम तौर पर उच्च गुणवत्ता के एजेंट हैं और रासायनिक संशोधनों की एक किस्म आरएनए गिरावट के साथ समस्याओं का मुकाबला करने के लिए या RNP९१के लिए अतिरिक्त सुविधाओं को रंगना करने के लिए उपलब्ध हैं । जबकि रासायनिक संशोधित gRNAs मानक जीनोम संपादन प्रयोगों के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है, कुछ समूहों में ऐसे रिएजेंट के साथ बहुत अधिक संपादन क्षमता देखा है, तो वे प्रक्रिया माहिर के बाद की कोशिश कर रहा लायक हो सकता है और/या जब gRNA क्षरण एक समस्या22,९१प्रतीत होता है । इन विट्रो प्रतिलेखन और बाद में जेल शुद्धिकरण एक सस्ता विकल्प है, जो नियमित जीनोम संपादन प्रयोगों17,21,४९,५०के लिए पर्याप्त हो सकता है । इसके अलावा, कई दृष्टिकोण है कि सामांयतः vivo मेंसमरूप gRNA आबादी का उत्पादन करने के लिए लागू कर रहे हैं, सहित ribozyme-और tRNA-व्यक्तिगत गाइड के आधारित उत्पाद, इन विट्रो में करने के लिए बढ़ाया जा सकता है आरएनए तैयारी क्लीनर उत्पन्न करने के लिए उत्पाद९२।
गाइड आरएनए और दाता डीएनए डिजाइन युक्तियां:
गाइड आरएनए चयन बंद लक्ष्य दरार की संभावना को कम करते हुए अत्यधिक कुशल पर लक्ष्य संपादन को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । गाइड के चयन में सहायता करने के लिए, कई अध्ययनों से सफल गाइड के अनुक्रम सुविधाओं को संकलित करने के लिए उच्च प्रवाह अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ युग्मित स्क्रीन का उपयोग किया है४७,७९,९३,९४, ९५,९६. इन सुविधाओं के लिए पूर्वानुमानित एल्गोरिदम और ऑनलाइन उपकरण गाइड चयन में सहायता करने के लिए विकसित करने के लिए उपयोग किया गया है४४,४५,४६,४७,४८। इस तरह के एल्गोरिदम गाइड आरएनए अभिव्यक्ति के लिए डीएनए आधारित सिस्टम का उपयोग कर स्क्रीन पर जमीन कर रहे हैं. गाइड एक पोल iii प्रमोटर का उपयोग कर व्यक्त कर रहे हैं, और उनकी अभिव्यक्ति इसलिए ऐसे समयपूर्व समाप्ति के रूप में पॉल तृतीय प्रतिलेखन, के साथ जुड़े सीमाओं से ग्रस्त है जब uracil की पटरियों का सामना कर रहे हैं९७,९८, ९९. हालांकि, RNPs के उपयोग के साथ बनाया इन विट्रो-संश्लेषित गाइड RNAs उन चिंताओं को दरकिनार और गाइड डिजाइन पर बाधाओं को सरल । एक आम सुविधा है कि इन एल्गोरिदम से उभरा है और अत्यधिक प्रभावी जीनोम संपादन के साथ कई अध्ययनों में पुष्टि की गई है, एक प्यूरीन की उपस्थिति है, विशेष रूप से एक guanine, ‘ 3 गाइड लक्ष्य विशेष अनुक्रम के अंत में । इस गाइड सुविधा स्तनधारी से सी. एलिगेंस, फल मक्खियों, और zebrafish६५,१००,१०१से लेकर जीवों के बीच बहुत सफल रहा है । इसके अलावा, C. एलिगेंसके लिए, मार्गदर्शिका के लक्ष्यीकरण क्षेत्र के 3 ‘ अंत में एक जीजी dinucleotide के साथ मार्गदर्शिकाएं डिज़ाइन करना अत्यधिक प्रभावी गाइड RNAs६५की भविष्यवाणी के लिए एक प्रभावी रणनीति है । आदर्श रूप में, परीक्षण कई गाइड समानांतर में निर्धारित करने के लिए जो किसी दिए गए आवेदन के लिए सबसे सफल है ।
जब जीनोम में एक डीएनए अनुक्रम परिचय का प्रयास, दाता या टेंपलेट डीएनए के डिजाइन भी महत्वपूर्ण है । एकल असहाय oligonucleotide दाताओं (ssODNs) अंय ठेठ मरंमत टेंपलेट्स, रैखिक डबल फंसे और प्लाज्मिड डीएनए५४,५५,१०२से अधिक मज़बूती से डाला जाता है । कुछ loci पर, HDR दक्षता ssODNs कि गैर-लक्ष्य या विस्थापित डीएनए कतरा के पूरक हैं और समरूपता हथियार है कि लंबाई27,५५में असममित हैं अधिकारी के साथ सुधार किया जा सकता है. चूंकि मरंमत टेम्पलेट कट साइट पर डाला जा रहा है और लक्षित अनुक्रम भी शामिल है, कदम Cas9 से पहले या जीनोमिक प्रविष्टि के बाद दाता डीएनए सट से रोकने के लिए लिया जाना चाहिए । इस पाम अनुक्रम या बीज क्षेत्र में मूक उत्परिवर्तनों बनाने के द्वारा पूरा किया है, Cas9 द्वारा मांयता से परहेज करते हुए डाला जीन21,१०३के समारोह को बनाए रखने । हालांकि पाम में भी एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन के लिए बाध्यकारी१०४को समाप्त करने की संभावना है, को बदलने की कोशिश कम से चार न्यूक्लियोटाइड सुरक्षित हो ।
महत्व और भविष्य अनुप्रयोगों:
CRISPR के साथ जीनोम संपादन-Cas9 किसी भी जीव के सतही आनुवंशिक हेरफेर को सक्षम करने के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में उभरा है । Cas9 RNP के साथ संपादन पहले थोड़ा और अधिक प्रयास लेता है, लेकिन एक बार रिएजेंट और प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला में स्थापित कर रहे है का उपयोग करने के लिए सीधा है । प्लाज्मिड डीएनए के बजाय पूर्व इकट्ठे RNP के साथ संपादन कोशिकाओं उच्च समग्र संपादन क्षमता की ओर जाता है, HDR के माध्यम से मुश्किल से प्राप्त जीन प्रविष्टि सहित, कम से दूर लक्ष्य प्रभाव के साथ24,25,26 , 27 , 29. इसके अलावा, प्रयोगकों जीन अभिव्यक्ति, आरएनए गिरावट, प्रोटीन तह, और gRNA और Cas9 सेल के भीतर अलग से संश्लेषित अणुओं के बीच संघ22,23के साथ समस्याओं से बचें । RNP संपादन भी संमिलनत्मक mutagenesis और निरंतर अभिव्यक्ति है कि जब वायरल वितरण तरीकों नैदानिक14इस्तेमाल कर रहे है पैदा हो सकता है के बारे में सुरक्षा चिंताओं को दरकिनार । इन फायदों की वजह से, कई वैज्ञानिकों का आयोजन पूर्व नैदानिक, सबूत की अवधारणा प्रयोगों मानव चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए RNP संपादन एहसान । दोनों vivo में और पूर्व vivo RNP-आधारित जीनोम संपादन दृष्टिकोण विकास में है या यहां तक कि शर्तों की एक किस्म का इलाज, Duchenne पेशी dystrophy१०५ और सिकल सेल रोग की तरह आनुवंशिक रोगों से27 करने के लिए एचआईवी29 और कैंसर11। दिलचस्प है, Cas9 RNP तेजी से कृषि इंजीनियरिंग के लिए एक वितरण पद्धति के रूप में कार्यरत है, क्योंकि यह ‘ सक्षम बनाता है डीएनए मुक्त ‘ पौधों के संपादन३३,३४,३६।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने प्रयोगशालाओं के कई पिछले सदस्यों और इन तरीकों के विकास के लिए उनके योगदान के लिए खाड़ी क्षेत्र जीनोम संपादन समुदाय का धंयवाद । हम गंभीर रूप से इस पांडुलिपि पढ़ने के लिए रॉस विल्सन धंयवाद ।
अलेक्जेंडर है Marson अनुसंधान जेक Aronov और एक राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी अनुदान से एक उपहार द्वारा समर्थित है (सीए १०७४-a-21) । अलेक्जेंडर Marson बरोज वेलकम फंड से मेडिकल वैज्ञानिकों के लिए करियर अवार्ड रखती है और एक चान नॐ Biohub खोजी है । याकूब ई. मकई अनुसंधान ली Ka शिंग फाउंडेशन द्वारा समर्थित है, विरासत चिकित्सा अनुसंधान चिकित्सा संस्थान, और कैलिफोर्निया संस्थान के लिए अपक्षयी चिकित्सा । Behnom Farboud और बारबरा जे है मेयेर अनुसंधान NIGMS अनुदान R01 GM030702 बारबरा जे मेयेर, जो हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान के एक अंवेषक है द्वारा भाग में वित्त पोषित है । आयलैंड जार्विस और Nipam एच पटेल अनुसंधान NSF अनुदान IOS-१२५७३७९ और आयलैंड जार्विस द्वारा भाग में वित्त पोषित है एक NSF GRFP और एक Philomathia स्नातक फैलोशिप से समर्थन स्वीकार करता है ।
Reagents/Materials | |||
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells | AllCells | PB032-2 | |
StemSpan SFEM | StemCell Technologies | 09650 | |
StemSpan CC110 | StemCell Technologies | 02697 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3032 | |
RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid | Sigma | R0883-6X500ML | |
EasySep™ Human T Cell Isolation Kit | Stemcell | 17951 | |
cell culture plate, 96 wells, round | Fisher Scientific | 3799 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Life Tech | 40203D | |
Reombinant Human IL-2 | UCSF Pharmacy | NA | |
SepMate-50 500-pack IVD | Stemcell Technologies | 85460 | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
Compressed nitrogen | – | ||
60 mM culture dishes | BD | ||
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
Tungsten wire (0.005 in. diameter) | Ted Pella | ||
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) | – | ||
Marine salt | – | ||
9" pasteur pipettes | – | ||
Phenol red | – | ||
Nuclease-free water | – | ||
Equipment | |||
4D Nucleofector | Lonza | AAF-1002X | |
MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol) | Sutter Instrument | P-80/PC | |
Microinjector (for P. hawaiensis protocol) | Narishige | IM300 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NG-agar |