Udnytter en hovedmeningen Cas9 er ribonucleoprotein komplekse (RNP) en kraftfuld metode for præcis, effektiv genom-redigering. Her, fremhæve vi sin nytte over en bred vifte af celler og organismer, herunder primære menneskeceller og både klassiske og nye modelorganismer.
Lokationsspecifikke eukaryote genom-redigering med CRISPR (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser)-Cas (CRISPR-forbundet) systemer er hurtigt blevet et almindeligt blandt forskere forfølger en bred vifte af biologiske spørgsmål. Brugere anvender oftest Cas9 protein afledt af Streptococcus pyogenes i et kompleks med en let omprogrammeret guide RNA (gRNA). Disse komponenter er indført i celler, og gennem en base parring med en supplerende region af dobbelt-strenget DNA (dsDNA) genom, enzymet, der kløver begge tråde for at generere en dobbelt-strenget pause (DSB). Efterfølgende reparation fører til enten tilfældige indsættelse eller sletning begivenheder (indels) eller indarbejdelse af eksperimentatoren-forudsat DNA i stedet for pause.
Brug af en renset single-guide RNA og Cas9 protein, formonteret til at danne en RNP og leveret direkte til cellerne, er en potent tilgang til opnåelse af højeffektive gen redigering. RNP redigering øger især hastigheden af gen indsættelse, et resultat, der er ofte en udfordring at opnå. I forhold til levering via et plasmid, fører kortere Persistensen af Cas9 RNP inden for cellen til færre off target begivenheder.
Trods sine fordele er mange casual brugere af CRISPR gen redigering mindre bekendt med denne teknik. For at sænke adgangsbarriere, redegøre vi for detaljerede protokoller for gennemførelse af RNP strategien i en række sammenhænge, fremhæver sin særskilte ydelser og forskellige applikationer. Vi dækker redigering i to typer af primære menneskelige celler, T-celler og hæmatopoietisk stem/stamceller (HSPCs). Vi viser også, hvordan Cas9 RNP redigering gør det muligt for facile genmanipulation af hele organismer, herunder den klassiske model rundorm Caenorhabditis elegans og mere for nylig indført model krebsdyr, Parhyale hawaiensis.
fThe CRISPR-Cas9 system giver forskerne til at ændre målrettede regioner af enhver genom1. Denne hurtig og billig teknologi har revolutioneret grundforskning og lover at gøre en dybtgående indflydelse på udviklingen af personlig sygdom behandlinger, precision landbrug, og ud over2. CRISPR redigering er et værktøj, demokratisering og implementering af systemet i et nyt laboratorium kræver ingen særlig ekspertise i genom engineering, bare grundlæggende molekylær biologi færdigheder. Forskere kan nu studere tidligere genstridig organismer med et par alternative midler til genmanipulation3,4. Alene i de sidste fem år, er CRISPR genom-redigering blevet brugt til ingeniør over 200 forskellige hvirveldyr, hvirvelløse, vegetabilske og mikrobielle arter.
Tilpasset fra CRISPR prokaryote forsvar pathway, de centrale elementer kræves for lokationsspecifikke genom-redigering er Cas9 protein, typisk fra S. pyogenes og codon-optimeret med en tilføjet nukleare lokalisering signal (NLS), og dets specialiserede RNA guide5,6. Selvom ikke diskuteret her, kan også andre Cas9 orthologues eller CRISPR endonucleases bruges. De naturligt forekommende gRNA er sammensat af to separat transskriberede stykker, CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktiveringen crRNA (tracrRNA)7. Disse RNA’er kan være smeltet sammen til en enkelt udskrift, kendt som single-guide RNA (sgRNA)8. De fleste genom redaktører vælger strømlinet sgRNA9, men dual-guide er også brugt regelmæssigt10,11. Eksperimentatorer vælge en 20-nukleotid (nt) genomisk DNA mål, at sikre, at det ligger en kort licensudstedende signatur kræves for Cas9 anerkendelse, kaldet en protospacer tilstødende motiv (PAM), og designe en gRNA, der indeholder supplerende12 .
Når inde i cellen, den komplekse RNP lokaliserer sit genomisk mål, gRNA basepar med supplerende DNA strand og derefter enzymet kløver bryde begge DNA-strenge til at generere en dobbelt-strand2. Celle reparation maskiner løser DSB ved en af mindst to ruter: via den fejlbehæftede ikke-homologe at deltage i slutning (NHEJ) vej eller homologi-instrueret reparation (HDR), der problemfrit indeholder DNA, der indeholder ‘arme’ af homologi til begge sider af pausen. Den tidligere reparation pathway typisk fører til indel dannelse og deraf følgende gen forstyrrelser, mens sidstnævnte tillader eksperimentatorer indsætte eller ændre DNA sekvenser1.
Redigering effektivitet og nøjagtighed afhænger af de midler, hvormed Cas9 og gRNA træder i cellen. Disse komponenter kan leveres til kulturperler celler, embryoner eller organismer i form af nukleinsyrer eller som en hovedmeningen RNP komplekse13,14,15. Fælles nukleinsyre-baserede leveringsmetoder omfatter viral transduktion, Transfektion eller elektroporation af mRNA eller plasmid DNA. Cas9 protein og guide RNA er derefter fremstillet i cellen og de forbinder til at danne et kompleks.
Den direkte levering af RNP kræver særskilt rensning af Cas9 protein og guide RNA. Dette kan gøres internt, eller protein og sgRNA kan købes fra en af flere kommercielle leverandører. Når erhvervet, Cas9 og gRNA blandes til at danne enzymatisk kompetente RNP komplekset og introduceret til celler injiceres direkte i befrugtede æg/embryoner, lipid-baserede Transfektion16eller elektroporation. Den første rapport af RNP redigering involveret injektion i C. elegans gonaderne17. Mikroinjektion er stadig det foretrukne middel til at indføre RNP i embryoner og hele organismer, men effektiv elektroporation er blevet påvist i mus18,19 og rotte20 embryoner. Vi beskriver protokoller for direkte indsprøjtning RNP i C. elegans gonaderne og P. hawaiensis embryoner og anbefaler en specialiseret type af elektroporation at levere RNP, når du redigerer primære humane celler. Denne metode, nucleofection, indebærer optimeret elektroporation programmer og celle type-specifikke løsninger og tillader RNP at indtaste både cytoplasma og kerne21.
Genom-redigering med RNP tilbyder flere forskellige fordele. Fordi protein og RNA komponenter er pre-samlet, og kvaliteten kan sikres før levering, undgår RNP redigering mange faldgruber forbundet med nukleinsyre-baserede levering. Nemlig, der er ingen risiko for Cas9-kodning DNA integreres vært genom, mRNA er aldrig udsat for nedbrydning og det omgår problemer med i vivo gRNA eller protein udtryk, folde og foreningen22,23. Yderligere, ved hjælp af RNP fører til lavere toksicitet og langt færre off target begivenheder end den plasmid-baserede udtryk, et resultat af den RNP kortere halveringstid inde i cellen24,25,26,27.
Endelig fører RNP redigering beviseligt til høje redigering priser i en bred vifte af menneskelige cellelinjer, primærelementer såsom fibroblaster, embryonale stamceller (økonomiske), induceret pluripotente stamceller (iSPCs), HSPCs, og T celler16,24, 25,26,27,28,29; hvirvelløse dyr herunder C. elegans, P. hawaiensisog bananfluer3,17,30; i vertebrater som zebrafisk, mus og rotter31,32; i plantearter, herunder Arabidopsis, tobak, salat, ris, grapevine, æble, majs og hvede33,34,35,36; og i Chlamydomonas, Penicilliumog Candida arter37,38,39. Hyppigheden af indel dannelse kan være højere, når du bruger RNP sammenlignet med plasmid levering, og HDR-medieret DNA indsættelsen kan være lettere at opnå25,27,29.
Protokollen beskrevet her bruger Cas9 RNP og er en effektiv, let fleksibel teknik, der er ligetil at anvende en bred vifte af biologiske systemer40,41, især i celler, som ellers er svære at arbejde med og i organismer uden veletablerede systemer for præcise genmanipulation. Vi starter med at beskrive hvordan man designer, opnå og samle Cas9 RNP før der dækker dets anvendelse på tværs af forskellige model celletyper og organismer. Hæmatopoietisk stem/stamceller-celler (HSPCs) og T-celler er redigeret ved hjælp af samme metode, nucleofection, så de er dækket sammen i trin 2 og 3 i denne protokol. Redigering procedurer for C. elegans er beskrevet i trin 4 og 5, og P. hawaiensis redigering er dækket i trin 6 og 7. Endelig, da en gen-redigering eksperiment succes i enhver organisme kan vurderes af genotype sekventering, undertrin beskriver mulige analysemetoder for alle celler og organismer beskrevet i protokollen er skitseret i trin 8.
Oprettelse af en robust genom-redigering protokol i en celle linje eller organisme af interesse kræver optimering og empirisk afprøvning af flere vigtige parametre, diskuteres i dette afsnit. Prøver et par variationer af de generelle tilgange præsenteres her er stærkt tilskyndes. Den vigtigste begrænsning af denne protokol er at anvende disse metoder til andre celler eller organismer kan føre til et andet resultat dyrearten studerede, og en eksperimentel design, der fører til en højeffektiv gen knockout må ikke promovere DNA indsættelse. Dermed, vi anbefaler at starte med de metoder, der præsenteres her og fejlfinding som beskrevet nedenfor.
Fejlfinding genom-redigering reagens kvalitet:
Generere eller købe høj kvalitet reagenser er et afgørende skridt i enhver genom-redigering protokol. Cas9 protein kan renses i laboratoriet eller købt kommercielt. Mange protokoller Bemærk en endelig koncentration for Cas9 i RNP opskrifter, men det optimale gen redigering aktivitet vil afhænge af den specifikke aktivitet af individuelle Cas9 protein præparater, som varierer afhængigt af kilden. Når protokollen præsenteres her er orden, overveje at optimere mængden af RNP bruges ved at titrere Cas9 niveauer til at etablere en optimal koncentration: en, der giver meget specifikke mål DNA kavalergang uden unødvendige off target kavalergang forårsaget af overdreven Cas940.
Guide RNA renhed og homogenitet kan også være determinanter for genom-redigering succes22. Købt sgRNAs eller separate komponenter, crRNA og tracrRNA er generelt høj kvalitet reagenser og en lang række kemiske ændringer er tilgængelige til at bekæmpe problemer med RNA nedbrydning eller til at give ekstra funktioner til RNP91. Mens kemisk modificerede gRNAs ikke må være nødvendig for standard genom-redigering eksperimenter, nogle grupper har observeret meget højere redigering effektivitetsgevinster med sådanne reagenser, så de kan være værd at prøve efter mastering processen og/eller når gRNA nedbrydning synes at være et spørgsmål22,91. In vitro transskription og efterfølgende gel rensning er et billigt alternativ, som kan være tilstrækkeligt til rutinemæssig genom-redigering eksperimenter17,21,49,50. Yderligere, flere tilgange, der er almindeligt anvendt til at producere homogen gRNA populationer i vivo, herunder ribozym – og tRNA-baserede excision af individuelle vejledninger, kan udvides til in vitro- RNA forberedelse til at generere renere produkter92.
Guide RNA og donor DNA design tips:
Guide RNA udvælgelse er en kritisk faktor for opnåelse af højeffektive på target redigering samtidig minimere chancerne for off-target kavalergang. For at støtte i guide udvælgelse, har flere undersøgelser brugt høj overførselshastighed skærme koblet med næste generation sequencing kompilere sekvens funktioner af vellykket guider47,79,93,94, 95,96. Disse funktioner har været brugt til at udvikle intelligent algoritmer og online værktøjer til at hjælpe med at guide udvælgelse44,45,46,47,48. Sådanne algoritmer er funderet på skærme ved hjælp af DNA-baserede systemer til guide RNA udtryk. Guider er udtrykt ved hjælp af en Pol III promotor, og deres udtryk er derfor udsat for de begrænsninger i forbindelse med Pol III transskription, såsom for tidlig afslutning når de støder på spor af uracil97,98, 99. Dog gjort brug af RNPs med in vitro-syntetiserede guide RNA’er omgår disse bekymringer og forenkler begrænsningerne på guide design. Et fælles træk, der fremgik af disse algoritmer og er blevet bekræftet i talrige undersøgelser med meget effektiv genom-redigering, er tilstedeværelsen af en purin, især en guanin, for 3 ‘ enden af guide’s target-specifikke sekvens. Denne guide funktion har været meget vellykket blandt organismer spænder fra pattedyr til C. elegans, bananfluer og zebrafisk65,100,101. Derudover for C. eleganser design guides med en GG dinucleotid for 3 ‘ enden af den guide målretning region en effektiv strategi til at forudsige meget effektiv guide RNA’er65. Ideelt, teste flere guider i parallel til at afgøre, hvilket er mest succesfulde for en given ansøgning.
Når du forsøger at indføre en DNA-sekvens i genomet, er design af donor eller DNA-template også afgørende. Enkeltstrenget oligonukleotid donorer (ssODNs) der indsættes mere pålideligt end andre typiske reparation skabeloner, lineære dobbelt-strenget og plasmid DNA54,55,102. På nogle loci, kan HDR effektivitet forbedres med ssODNs, der supplerer de ikke-målarter eller fordrevet DNA streng og besidde homologi våben, der er asymmetrisk i længde27,55. Da reparation skabelon er ved at blive sat på webstedet cut og indeholder den målrettede sekvens, skal der tages skridt til at forhindre Cas9 i at holde donor DNA før eller efter genomisk indsættelse. Dette opnås ved at gøre tavs mutationer til PAM sekvens eller frø område og undgå anerkendelse af Cas9 samtidig bevare funktionen af indsatte gen21,103. Selvom selv enkelt nucleotid ændringer i PAM er tilbøjelige til at afskaffe bindende104, prøv at ændre mindst fire nucleotider for at være sikker.
Betydning og fremtidige ansøgninger:
Genom-redigering med CRISPR-Cas9 er opstået som en kraftfuld metode gør det muligt for facile genmanipulation af enhver organisme. Redigering med Cas9 RNP tager en lidt større indsats i første omgang men er ligetil at bruge når reagenser og protokoller, der er etableret i et laboratorium. Redigering af celler med formonterede RNP i stedet for plasmid DNA fører til højere samlet redigering effektivitet, herunder vanskeligt at opnå gen indsættelse via HDR, med færre off target effekter24,25,26 , 27 , 29. Desuden eksperimentatorer undgå problemer med genekspression RNA nedbrydning, proteinfoldning og tilknytningen mellem gRNA og Cas9 molekyler syntetiseret separat inden for celle22,23. RNP redigering også omgår sikkerhed bekymringer om pattedyrsceller mutagenese og vedvarende udtryk, der kan opstå, når viral leveringsmetoder er anvendt klinisk14. På grund af disse fordele favor mange forskere foretage prækliniske, proof of concept eksperimenter RNP redigering for menneskelige terapeutiske anvendelsesmuligheder. Både i vivo og ex vivo RNP-baseret genom redigering metoder er under udvikling til at behandle eller endda kurere en række betingelser, fra genetiske sygdomme som Duchenne muskeldystrofi105 og seglcelleanæmi27 til HIV29 og kræft11. Det er interessant, er Cas9 RNP stadig ansat som en leveringsmetode for landbrugs udvikling, fordi det giver mulighed for ‘DNA-fri’ redigering af planter33,34,36.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker mange tidligere medlemmer af vores labs og Bay Area genom redigering Fællesskabet for deres bidrag til udviklingen af disse metoder. Vi takker Ross Wilson til kritisk læsning af dette manuskript.
Alexander Marson forskning er understøttet af en gave fra Jake Aronov og en National dissemineret sklerose samfundet yde (CA 1074-A-21). Alexander Marson holder en karriere Award for medicinsk forskere fra fondens Burroughs Wellcome og er en Chan Zuckerberg Biohub Investigator. Jacob E. Corn forskning er støttet af Li Ka Shing Foundation, arv medicinsk forskning Medical Institute og California Institute for regenerativ medicin. Behnom Farboud og Barbara J. Meyers forskning er delvis finansieret af NIGMS grant R01 GM030702 til Barbara J. Meyer, der er en investigator af Howard Hughes Medical Institute. Erin Jarvis og Nipam H. Patels forskning er delvis finansieret af NSF grant IOS-1257379 og Erin Jarvis anerkender støtte fra en NSF GRFP og en Philomathia Graduate stipendium.
Reagents/Materials | |||
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells | AllCells | PB032-2 | |
StemSpan SFEM | StemCell Technologies | 09650 | |
StemSpan CC110 | StemCell Technologies | 02697 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3032 | |
RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid | Sigma | R0883-6X500ML | |
EasySep™ Human T Cell Isolation Kit | Stemcell | 17951 | |
cell culture plate, 96 wells, round | Fisher Scientific | 3799 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Life Tech | 40203D | |
Reombinant Human IL-2 | UCSF Pharmacy | NA | |
SepMate-50 500-pack IVD | Stemcell Technologies | 85460 | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
Compressed nitrogen | – | ||
60 mM culture dishes | BD | ||
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
Tungsten wire (0.005 in. diameter) | Ted Pella | ||
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) | – | ||
Marine salt | – | ||
9" pasteur pipettes | – | ||
Phenol red | – | ||
Nuclease-free water | – | ||
Equipment | |||
4D Nucleofector | Lonza | AAF-1002X | |
MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol) | Sutter Instrument | P-80/PC | |
Microinjector (for P. hawaiensis protocol) | Narishige | IM300 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NG-agar |