Bruker en prefabrikkerte Cas9 er ribonucleoprotein kompleks (RNP) en kraftig metode for presis og effektiv genomet redigering. Her markere vi sin verktøyet over et bredt spekter av celler og organismer, inkludert primære menneskelige celler og både klassiske og nye modell organismer.
Områdespesifikke eukaryote genomet redigering med CRISPR (gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar)-Cas (CRISPR-tilknyttet) systemer har raskt blitt en vanlig blant forskere forfølge en rekke biologiske spørsmål. Brukerne benytter oftest Cas9 protein avledet fra Streptococcus pyogenes i et kompleks med en enkelt omprogrammeres guide RNA (gRNA). Disse komponentene er introdusert i celler, og gjennom en base sammenkobling med en utfyllende område double-strandet DNA (dsDNA) genomet, enzymet kløyver både tråder for å generere en dobbel-strand pause (DSB). Etterfølgende reparasjon fører til tilfeldige innsetting eller sletting hendelser (indeler) eller innlemmelse av eksperimentator gitt DNA på stedet av pausen.
Bruk av en renset single-guide RNA og Cas9 protein, prefabrikkerte for å danne en RNP og levert direkte til celler, er en potent tilnærming for å oppnå svært effektiv genet redigering. RNP redigering øker spesielt frekvensen av genet innsetting, et utfall som er ofte vanskelig å oppnå. Sammenlignet med levering via en plasmider, fører kortere utholdenhet av Cas9 RNP i cellen til færre off-målet hendelsene.
Til tross for sine fordeler er mange tilfeldige brukere av CRISPR genet mindre kjent med denne teknikken. Lavere barrieren til oppføring, skissere vi detaljert protokoller for implementering av strategien er RNP i en rekke sammenhenger, fremhever sin distinkte fordeler og forskjellige programmer. Vi dekker redigering i to typer primære menneskelige celler, T celler og blodkreft stem/stamfar celler (HSPCs). Vi viser også hvordan Cas9 RNP redigering gir lettvinte genetisk manipulering av hele organismer, inkludert den klassiske modellen rundorm Caenorhabditis elegans og mer nylig introdusert modell krepsdyr, Parhyale hawaiensis.
fThe CRISPR-Cas9 systemet tillater forskere å endre målrettede regioner av alle genomet1. Denne rask og billig teknologi har revolusjonert grunnforskning og lover å gjøre en betydelig innflytelse på utviklingen av personlig sykdom behandling, presisjon landbruk, og utover2. CRISPR redigering er et demokratiserende verktøy og implementere systemet i et nytt laboratorium krever ingen bestemt kompetanse i genomet engineering, bare grunnleggende molekylærbiologi ferdigheter. Forskere kan nå studere tidligere uløselige organismer noen alternative måter for genetisk manipulasjon3,4. I de siste fem årene alene, har CRISPR genomet redigering blitt brukt til ingeniør over 200 forskjellige virveldyr, virvelløse dyr, plante og mikrobielle arter.
Tilpasset fra CRISPR prokaryote forsvar veien, kjerneelementene kreves for områdespesifikke genomet redigering er Cas9 protein, vanligvis fra S. pyogenes og codon-optimalisert med et ekstra kjernefysiske lokalisering signal (NLS) og dens spesialiserte RNA guide5,6. Selv om ikke diskutert her, kan andre Cas9 orthologues eller CRISPR endonucleases også brukes. Den naturlig forekommende gRNA består av to separat transkribert stykker, CRISPR RNA (crRNA) og det trans-aktivert crRNA (tracrRNA)7. Disse RNAs kan være smeltet sammen til en enkelt transkripsjon, kjent som enkelt-guide RNA (sgRNA)8. De fleste genomet redaktører velge strømlinjeformet sgRNA9, men dual-guiden er også brukt regelmessig10,11. Forskere Velg et 20-nukleotid (nt) genomisk DNA mål, slik at det ligger en kort lisensiering signatur kreves for Cas9 anerkjennelse, kalt en protospacer tilstøtende motiv (PAM), og utforme en gRNA som inneholder komplementære rekkefølgen12 .
Når inne i cellen, RNP komplekse finner genomisk målet gRNA base parene med komplementære DNA strand og deretter enzymet kløyver bryter både DNA tilnærmingene til å generere en dobbel-strand2. Celle reparasjon maskiner løser DSB av en av minst to ruter: via feilutsatte ikke-homologe slutten-begynte (NHEJ) veien eller homologi-rettet reparasjon (HDR), som sømløst omfatter DNA som inneholder “armer” homologi på begge sider av pausen. Tidligere reparasjon veien vanligvis fører til indel dannelse og påfølgende gen avbrudd, mens sistnevnte tillater forskere å sette inn eller endre DNA-sekvenser1.
Redigering effektivitet og nøyaktighet, avhenger av midler som Cas9 og gRNA inn i cellen. Disse komponentene kan leveres til kulturperler celler, embryo eller organismer i form av nukleinsyrer eller som en prefabrikkerte RNP komplekse13,14,15. Vanlige nucleic acid-baserte leveringsmåter inkludere viral signaltransduksjon, hva, eller electroporation av mRNA eller plasmider DNA. Cas9 protein og guide RNA da produsert i cellen og de knytte danner et kompleks.
Direkte levering av RNP krever separate rensing av Cas9 protein og guide RNA. Dette kan gjøres internt, eller protein og sgRNA kan kjøpes fra en av flere kommersielle leverandører. Når kjøpte, er Cas9 og gRNA blandet for å danne enzymatisk kompetent RNP komplekset og introdusert til celler ved direkte injeksjon i befruktede egg/embryo, lipid-baserte transfection16eller electroporation. Den første rapporten RNP redigering involvert injeksjon i C. elegans gonader17. Microinjection er fortsatt foretrukket måte å introdusere RNP inn embryoer og hele organismer, men effektive electroporation har vist i mouse18,19 og rotten20 embryoer. Vi beskriver protokoller for direkte injeksjon RNP C. elegans gonader og P. hawaiensis embryoer og anbefaler en spesialisert type electroporation å levere RNP når du redigerer primære menneskelige celler. Denne metoden, nucleofection, optimalisert electroporation programmer og celle type-spesifikk løsninger og lar RNP både cytoplasma og kjernen21.
Genomet redigering med RNP tilbyr flere forskjellige fordeler. Fordi protein og RNA komponenter er ferdigmontert og kvalitet kan sikres før levering, unngår RNP redigering mange feller som er forbundet med nukleinsyre-baserte levering. Nemlig, det er ingen risiko for Cas9-koding DNA integrering i vert genomet mRNA er aldri utsatt til fornedrelse og det omgår problemer med i vivo gRNA eller protein uttrykk, bretting og foreningen22,23. Videre fører bruker RNP til lavere toksisitet og langt færre off-målet hendelser enn plasmider-baserte uttrykket, et resultat av den RNP kortere half-life inni cellen24,25,26,27.
Endelig fører RNP redigering påviselig til høye redigering priser i en rekke humane cellelinjer, primær celler som fibroblaster, embryonale stamceller (ESCs), indusert pluripotent stamceller (iSPCs), HSPCs, og T celler16,24, 25,26,27,28,29; i dyr inkludert C. elegans, P. hawaiensisog frukt fluer3,17,30; i virveldyr arter som sebrafisk, mus og rotter31,32; i plante arter inkludert Arabidopsis, tobakk, salat, ris, grapevine, apple, mais og hvete33,34,35,36; og i Chlamydomonas, penicillinog Candida arter37,38,39. Hyppigheten av indel formasjon kan være høyere ved RNP sammenlignet med plasmider levering, og HDR-mediert DNA innsetting kan være lettere å oppnå25,27,29.
Protokollen beskrevet her bruker Cas9 RNP og er en effektiv, lett tilpasses teknikk som er enkelt å bruke en rekke biologiske systemer40,41, spesielt i celler som er vanskelig å arbeide med og i organismer uten godt etablerte systemer for presis genetisk manipulasjon. Vi starter ved å beskrive hvordan design, hente og sette sammen Cas9 RNP før dekker bruk over annen modell celletyper og organismer. Blodkreft stem/stamfar celler (HSPCs) og T-celler redigeres ved hjelp av samme metode, nucleofection, så de er dekket sammen i trinn 2 og 3 i denne protokollen. Redigere prosedyrer for C. elegans er beskrevet i trinn 4 og 5, og P. hawaiensis redigering er dekket i trinn 6 og 7. Til slutt, siden suksessen til et gen-redigering eksperiment i noen organismer vurderes av genotype sekvensering, undertrinn beskriver mulige dataanalyse metoder for alle celler og organismer beskrevet i protokollen er beskrevet i trinn 8.
Etablere et robust genom redigering protokollen i en celle linje eller organisme rundt krever optimalisering og empirisk testing av flere viktige parametere, drøftes i dette avsnittet. Prøver noen varianter av de generelle metodene som presenteres her er svært oppmuntret. Nøkkel begrensning av denne protokollen er at å bruke disse metodene til andre celler eller organismer kan føre til en ulike utfall avhengig av arten studerte, og en eksperimentell design som fører til en høy effektivitet genet knockout kan ikke promotere DNA innsetting. Derfor anbefaler vi starter med metodene presenteres her og feilsøking som beskrevet nedenfor.
Feilsøking genomet redigering reagens kvalitet:
Generere eller kjøpe høykvalitets reagenser er en avgjørende skritt i noen genomet redigering protokollen. Cas9 protein kan renset i laboratoriet eller kjøpt kommersielt. Mange protokoller Merk en siste konsentrasjon for Cas9 i RNP oppskrifter, men optimal genet redigering aktivitet avhenger til aktiviteten med noen personlige Cas9 protein forberedelser, som varierer avhengig av kilden. Når protokollen presenteres her fungerer, kan du vurdere å optimalisere mengden RNP brukt av titrating Cas9 for å etablere en optimal konsentrasjon: en som gir svært spesifikke mål DNA cleavage uten unødvendige off-målet cleavage skyldes overdreven Cas940.
Guide RNA renhet og homogenitet kan også være determinanter av genomet redigering suksess22. Kjøpte sgRNAs eller separate crRNA og tracrRNA komponenter er generelt høy kvalitet reagenser og en rekke kjemiske modifikasjoner er tilgjengelige mot problemer med RNA degradering eller tilegner funksjoner RNP91. Mens kjemisk endret gRNAs ikke kan være nødvendig for standard genomet redigering eksperimenter, noen grupper har observert mye høyere redigering effektiviteten med slike reagenser, så de kan være verdt å prøve etter mestring prosessen og/eller når gRNA fornedrelse synes å være et problem22,91. In vitro transkripsjon og påfølgende gel rensing er et billig alternativ, som kan være tilstrekkelig for rutinemessig genomet redigering eksperimenter17,21,49,50. Videre, flere tilnærminger som brukes vanligvis for å produsere homogen gRNA bestander i vivo, inkludert ribozyme og tRNA-baserte excision av enkelte hjelpelinjene, kan utvides til in vitro RNA forberedelse til å generere renere produkter92.
Guide RNA og donor DNA design tips:
Guide RNA utvalg er en kritisk faktor i å oppnå svært effektiv på målet redigering samtidig minimere sjansene for off-målet cleavage. For å hjelpe guide valg, har flere studier brukt høy gjennomstrømming skjermer sammen med neste generasjons sekvensering for å kompilere sekvens funksjoner av vellykket guider47,79,93,94, 95,96. Disse funksjonene har vært brukt til å utvikle prediktiv algoritmer og online verktøy for å hjelpe guide utvalg44,45,46,47,48. Slike algoritmer er jordet på skjermer ved hjelp av DNA-baserte systemer for guide RNA uttrykk. Guider er uttrykt ved hjelp av en Pol III promoter, og deres uttrykk er derfor utsatt for begrensningene knyttet til Pol III transkripsjon, som tidlig avslutning når møter spor av uracil97,98, 99. Bruk av RNPs gjort med in vitro-syntetisert guide RNAs utenom disse bekymringene og forenkler begrensningene i guide design. En vanlig funksjon som fremkom fra disse algoritmene og er bekreftet i flere studier med effektive genomet redigering, er tilstedeværelsen av en purine, spesielt en guanine, på 3 slutten av guiden mål-spesifikke. Denne guide funksjonen har vært svært vellykket blant organismer spenner fra pattedyr C. elegans, frukt fluer og sebrafisk65,100,101. I tillegg for C. eleganser designe guider med en GG dinucleotide på 3 slutten av guiden målretting regionen en effektiv strategi for å forutsi effektive guide RNAs65. Ideelt sett teste flere guider parallelt hva som er mest vellykkede for et gitt program.
Når du prøver å innføre en DNA sekvens i genomet, er utformingen av donor eller mal DNA også avgjørende. Single-strandet oligonucleotide givere (ssODNs) settes mer pålitelig enn andre typiske reparasjon maler, lineær double-strandet og plasmider DNA54,55,102. På noen loci, kan HDR effektivitet forbedres med ssODNs som er komplementære til ikke-målet eller fordrevet DNA strand og har homologi våpen som er asymmetriske i lengde27,55. Siden malen reparasjon settes på webområdet kutt og inkluderer målrettet sekvensen, tas skritt å hindre Cas9 i å spalte donor DNA før eller etter genomisk innsetting. Dette gjøres ved å stille mutasjoner PAM rekkefølgen eller frø regionen, unngå anerkjennelse av Cas9 samtidig beholde funksjonen til innsatte genet21,103. Selv single nukleotid endringer av PAM er sannsynlig å avskaffe bindende104, prøv å endre minst fire nukleotider for å være sikker.
Betydning og framtidige applikasjoner:
Genomet redigering med CRISPR-Cas9 har dukket opp som en kraftfull metode aktivere lettvinte genetisk manipulering av noen organismer. Redigering med Cas9 RNP tar litt mer innsats først, men er enkel å bruke når reagenser og protokoller er etablert i et laboratorium. Redigerer du celler med pre-monterte RNP i stedet for plasmider DNA fører til høyere samlede redigering effektivitet, inkludert vanskelig å oppnå genet innsetting via HDR, med færre off-målet effekter24,25,26 , 27 , 29. videre eksperimentelle unngå problemer med genuttrykk RNA fornedrelse, proteinfolding og tilknytningen mellom gRNA og Cas9 molekyler syntetisert separat i cellen22,23. RNP redigering også omgår sikkerhet bekymringer om insertional mutagenese og vedvarende uttrykk som kan oppstå når viral leveringsmetoder er brukt klinisk14. På grunn av disse fordelene favoriserer mange forskere gjennomfører pre-klinisk, proof-of-concept eksperimenter RNP redigering for menneskelig terapeutiske programmer. Både i vivo og ex vivo RNP-baserte genomet redigering tilnærminger er i utvikling å behandle eller selv kurere en rekke forhold, genetiske sykdommer som Duchenne muskeldystrofi105 og sigdcelleanemi27 HIV29 og kreft11. Interessant, er Cas9 RNP stadig ansatt som en leveringsmetode for landbruket tekniske fordi ‘DNA-ledig’ redigering av planter33,34,36.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker mange tidligere medlemmer av våre laboratorier og Bay Area genomet redigering samfunnet for sine bidrag til utviklingen av disse metodene. Vi takker Ross Wilson for kritisk lesing dette manuskriptet.
Alexander Marson forskning støttes av en gave fra Jake Aronov og en nasjonal multippel sklerose samfunnet gir (CA 1074-A-21). Alexander Marson holder en Career-pris for medisinske forskere fra Burroughs Wellcome fondet og er en Chan Zuckerberg Biohub etterforsker. Jacob E. Corn forskning støttes av Li Ka Shing Foundation, arv medisinsk forskning Medical Institute og California Institutt for regenerativ medisin. Behnom Farboud og Barbara J. Meyers forskning er finansiert delvis av NIGMS tilskudd R01 GM030702 til Barbara J. Meyer, som er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute. Erin Jarvis og Nipam H. Patels forskning er finansiert delvis av NSF stipendet IOS-1257379 og Erin Jarvis anerkjenner støtte fra en NSF-GRFP og en Philomathia Graduate Fellowship.
Reagents/Materials | |||
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells | AllCells | PB032-2 | |
StemSpan SFEM | StemCell Technologies | 09650 | |
StemSpan CC110 | StemCell Technologies | 02697 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3032 | |
RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid | Sigma | R0883-6X500ML | |
EasySep™ Human T Cell Isolation Kit | Stemcell | 17951 | |
cell culture plate, 96 wells, round | Fisher Scientific | 3799 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Life Tech | 40203D | |
Reombinant Human IL-2 | UCSF Pharmacy | NA | |
SepMate-50 500-pack IVD | Stemcell Technologies | 85460 | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
Compressed nitrogen | – | ||
60 mM culture dishes | BD | ||
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
Tungsten wire (0.005 in. diameter) | Ted Pella | ||
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) | – | ||
Marine salt | – | ||
9" pasteur pipettes | – | ||
Phenol red | – | ||
Nuclease-free water | – | ||
Equipment | |||
4D Nucleofector | Lonza | AAF-1002X | |
MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol) | Sutter Instrument | P-80/PC | |
Microinjector (for P. hawaiensis protocol) | Narishige | IM300 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NG-agar |