Utnyttja en förmonterade Cas9 är komplexa ribonukleoprotein (RNP) en kraftfull metod för precisa, effektiva gen editering. Här, belysa vi dess användbarhet inom ett brett spektrum av celler och organismer, inklusive primära mänskliga celler och både klassiska och nya modellorganismer.
Platsspecifika eukaryota gen editering med CRISPR (klustrad regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner)-Cas (CRISPR-associerade) system har snabbt blivit ett vanligt bland forskare bedriver en mängd olika biologiska frågor. Användare använder oftast den Cas9 protein från Streptococcus pyogenes i ett komplex med en lätt omprogrammeras guide RNA (gärna). Dessa komponenter introduceras in i celler, och i en base ihopkoppling med en kompletterande region av dubbelsträngat DNA (dsDNA) genomet, enzymet klyver båda delarna för att generera en dubbel-strand paus (DSB). Efterföljande reparation leder till antingen slumpmässig införande eller borttagning händelser (indels) eller införlivandet av förutsatt att försöksledaren DNA på platsen för avbrottet.
Användning av ett renat singel-guide RNA och Cas9 protein, förmonterade för att bilda en RNP och levereras direkt till celler, är en potent strategi för att uppnå högeffektiva gen redigering. RNP redigering ökar särskilt graden av genen införande, ett resultat som ofta är svårt att uppnå. Jämfört med leverans via en plasmid, leder kortare varaktigheten av den Cas9 RNP i cellen till färre off-target händelser.
Trots sina fördelar är många casual användare av CRISPR gen redigering mindre bekant med denna teknik. För att sänka inträdeshindret, beskriver vi detaljerade protokoll för genomförandet av RNP-strategi i en rad sammanhang, belysa dess distinkta fördelar och applikationsmöjligheter. Vi täcker redigering i två typer av primära mänskliga celler, T-celler och hematopoetiska stamceller/stamceller (HSPCs). Vi visar också hur Cas9 RNP redigering gör lättköpt genmanipulation av hela organismer, inklusive klassisk modell rundmasken Caenorhabditis elegans och mer nyligen infört modellen kräftdjur, Parhyale hawaiensis.
Hotellets CRISPR-Cas9 systemet tillåter forskare att förändra riktade regioner av någon genomet1. Denna snabb och billig teknik har revolutionerat grundforskning och lovar att göra en djupgående inverkan på utvecklingen av personlig sjukdom terapier, precisionsjordbruk, och bortom2. CRISPR redigering är en demokratiserande verktyg och genomföra systemet i ett nytt laboratorium kräver ingen särskild expertis i genomet engineering, bara grundläggande molekylärbiologi färdigheter. Forskare kan nu studera tidigare svårlösta organismer med några alternativa sätt för genmanipulation3,4. Enbart under de senaste fem åren, har CRISPR gen editering använts till ingenjör över 200 olika ryggradsdjur, ryggradslösa djur, växt och mikrobiell arter.
Anpassad från CRISPR prokaryota försvar vägen, de centrala delarna krävs för platsspecifika gen editering är proteinet Cas9, vanligtvis från S. pyogenes och kodon-optimerade med ljussignal added nukleära lokalisering (NLS) och dess specialiserade RNA guide5,6. Även om inte diskuteras här, andra Cas9 orthologues eller CRISPR endonucleases kan också användas. Den naturligt förekommande gärna består av två separat transkriberas bitar, CRISPR RNA (crRNA) och den trans-aktivera crRNA (tracrRNA)7. Dessa RNAs kan vara smält till en enda utskrift, känd som den enda-guide RNA (sgRNA)8. De flesta genomet redaktörer välja den strömlinjeformade sgRNA9, även om den dubbla-guiden också används regelbundet10,11. Praktiker välja 20-nukleotid (nt) genomisk DNA mål, se till att det ligger intill en kort licensiering signatur krävs för Cas9 erkännande, kallas en protospacer intill motiv (PAM), och utforma en gärna som innehåller sekvensen kompletterande12 .
En gång inne i cellen, den komplexa RNP lokaliserar dess genomisk mål, gärna basparen med kompletterande DNA strand och sedan enzymet klyver bryta båda DNA-strängar att generera en dubbel-strand2. Cell reparation maskiner fixar Tvistlösningsorganet av en av minst två vägar: via felbenägen icke-homolog slutet-anslutning (NHEJ) vägen eller homologi-regisserad reparation (HDR), som sömlöst innehåller DNA som innehåller ‘vapen’ av homologi endera sidan av avbrottet. Den tidigare reparation vägen leder vanligtvis till ditsatta bildandet och åtföljande gen störningar, medan den senare ger praktiker infoga eller ändra DNA sekvenser1.
Redigering effektiviteten och precisionen är beroende av de medel som Cas9 och gärna in i cellen. Dessa komponenter kan levereras till odlade celler, embryon eller organismer i form av nukleinsyror eller som en förmonterade RNP komplexa13,14,15. Gemensamma nukleinsyrebaserade leveransmetoder inkluderar den virala transduktion, transfection eller elektroporation mRNA eller plasmid DNA. Cas9 protein och guide RNA produceras sedan i cellen och de förknippar bildar ett komplex.
Direkt leverans av RNP kräver separat rening av Cas9 protein och guide RNA. Detta kan göras internt eller protein och sgRNA kan köpas från en av flera kommersiella leverantörer. När förvärvade den Cas9 och gärna blandas för att bilda komplexet RNP enzymatiskt-kompetenta och infördes till celler genom direkt injektion i befruktade ägg och embryon, lipid-baserade transfection16eller elektroporation. Den första rapporten av RNP redigering inblandade injektion i C. elegans gonader17. Mikroskop är medel som föredras för att införa RNP i embryon och hela organismer, om effektiv elektroporation har visats i18,19 och råtta20 musembryon. Vi beskriva protokoll för direkt injicera RNP i C. elegans gonader och P. hawaiensis embryon och rekommenderar en specialiserad typ av elektroporation att leverera RNP när du redigerar primära mänskliga celler. Denna metod, nucleofection, innebär optimerad elektroporation program och cell typspecifika lösningar och tillåter RNP ange både cytoplasman och nucleus21.
Gen editering med RNP erbjuder flera distinkta fördelar. Eftersom protein och RNA komponenter är förmonterade och kvaliteten kan säkerställas före leverans, undviker RNP redigering många fallgropar kopplade nukleinsyra-baserade. Nämligen, det finns ingen risk för Cas9-encoding DNA integrering i den mottagande arvsmassan, mRNA utsätts aldrig för nedbrytning och det kringgår problem med i vivo gärna eller protein, vikning, och föreningsfrihet22,23. Dessutom leder använder RNP till lägre toxicitet och långt färre off-target händelser än plasmid-baserade uttrycket som ett resultat av den RNP kortare halveringstid inuti cellen24,25,26,27.
Slutligen, RNP redigering bevisligen leder till hög redigering priser i en mängd olika mänskliga cellinjer, primära celler som fibroblaster, embryonala stamceller (EKSG), inducerade pluripotenta stamceller (iSPCs), HSPCs, och T cells16,24, 25,26,27,28,29; hos ryggradslösa djur inklusive C. elegans, P. hawaiensisoch bananflugor3,17,30; i ryggradsdjur som zebrafisk, möss och råttor31,32. i växtart inklusive Arabidopsis, tobak, sallad, ris, grapevine, apple, majs och vete33,34,35,36. och i Chlamydomonas, Penicilliumoch Candida arter37,38,39. Frekvensen av ditsatta bildandet kan vara högre vid användning av RNP jämfört med plasmid leverans och HDR-medierad DNA införande kan bli lättare att uppnå25,27,29.
Protokollet beskrivs här använder den Cas9 RNP och är en effektiv, lätt anpassningsbar teknik som är enkel att tillämpa på en mängd olika biologiska system40,41, särskilt i celler som annars är svårt att arbeta med och i organismer utan väletablerade system för exakt genetisk manipulation. Vi börjar med att beskriva hur man designar, erhålla och montera den Cas9 RNP innan täcker dess användning över olika modell celltyper och organismer. Hematopoetiska stamceller/stamceller celler (HSPCs) och T-celler redigeras med samma metod, nucleofection, så de täcks tillsammans i steg 2 och 3 i detta protokoll. Redigera förfaranden för C. elegans beskrivs i steg 4 och 5, och P. hawaiensis redigering är täckt i steg 6 och 7. Slutligen, eftersom framgången för ett genredigering experiment i någon organism kan bedömas av genotyp sekvensering, delsteg som beskriver möjliga analysmetoder för alla celler och organismer beskrivs i protokollet anges i steg 8.
Att upprätta en robust genomet redigering protokoll i en cell linje eller organismen av intresse kräver optimering och empirisk testning av flera viktiga parametrar, behandlas i detta avsnitt. Försöker några varianter av de allmänna strategier som presenteras här är mycket uppmuntras. Den viktigaste begränsningen av detta protokoll är att tillämpa dessa metoder till andra celler eller organismer kan leda till ett annat resultat beroende på vilken art som studerade och en experimentell design som leder till en högeffektiv gen knockout får inte marknadsföra DNA införande. Således rekommenderar vi börjar med de metoder som presenteras här och felsökning som beskrivs nedan.
Felsökning genomet redigering reagens kvalitet:
Generera eller köpa högkvalitativa reagenser är ett kritiskt steg i någon genomet redigering protokoll. Cas9 protein kan renas i labbet eller köpas kommersiellt. Många protokoll Observera en slutlig koncentration för Cas9 i RNP recept, men optimal genen redigering aktivitet beror på den specifika aktiviteten av någon enskild Cas9 protein beredning, som varierar beroende på källan. När protokollet presenteras här arbetar, överväga att optimera mängden RNP används av titrering Cas9 nivåer för att fastställa en optimal koncentration: en som ger mycket specifik DNA klyvning utan onödiga off-target klyvning orsakas av överdriven Cas940.
Guide RNA renhet och homogenitet kan också vara faktorer som påverkar genomet redigering framgång22. Köpta sgRNAs eller separat crRNA och tracrRNA komponenter är generellt högkvalitativa reagenser och en mängd kemiska modifieringar finns att bekämpa problemen med RNA nedbrytning eller att genomsyra ytterligare funktioner till RNP91. Även kemiskt modifierade gRNAs inte kanske är nödvändiga för standarden genomet redigering experiment, vissa grupper har observerat mycket högre redigering effektivitetsvinster med sådant reagens, så att de kan vara värt att försöka efter mastering processen och/eller när gärna nedbrytning verkar vara en fråga22,91. In vitro transkription och efterföljande gel rening är ett billigt alternativ, som kan vara tillräckligt för rutinmässig genomet redigering experiment17,21,49,50. Dessutom flera metoder som används vanligtvis för att producera homogen gärna populationer i vivo, inklusive ribozym – och tRNA-baserade excision av enskilda guider, kan förlängas till in vitro- RNA förberedelse att generera renare produkter92.
Guide RNA och givare DNA design tips:
Guide RNA urval är en kritisk faktor för att uppnå mycket effektiv på målet redigering samtidigt minimera chanserna för off-target klyvning. För att underlätta guide urval, har flera studier använt hög genomströmning skärmar tillsammans med nästa generations sekvensering för att sammanställa sekvens funktioner av framgångsrika guider47,79,93,94, 95,96. Dessa funktioner har använts för att utveckla förutsägande algoritmer och online verktyg för att bistå i guide urval44,45,46,47,48. Sådana algoritmer är jordad på skärmar med DNA-baserade system för guide RNA uttryck. Guider uttrycks med hjälp av en Pol III arrangören, och deras uttryck är därför benägen att de begränsningar som är associerade med Pol III transkription, såsom förtida upphörande när de stöter på spår av uracil97,98, 99. Användning av RNPs gjorde dock med in vitro-synthesized guide RNAs kringgår dessa farhågor och förenklar begränsningarna som guide-design. En gemensam funktion som vuxit fram ur dessa algoritmer och har bekräftats i ett flertal studier med mycket effektiv gen editering, är förekomsten av en purin, särskilt en guanin, 3′ slutet av guidens mål-specifika sekvens. Denna guide funktion har varit mycket framgångsrikt bland organismer alltifrån däggdjur till C. elegans, bananflugor och zebrafiskar65,100,101. Dessutom för C. elegansär utforma guider med en GG-dinukleotid 3′ slutet av guidens inriktning regionen en effektiv strategi för att förutsäga mycket effektiv guide RNAs65. Idealiskt, testa flera guider parallellt för att avgöra vilken som är mest framgångsrika för ett visst program.
När du försöker införa en DNA-sekvens i arvsmassan, är utformningen av den givaren eller templat-DNA också avgörande. Enkelsträngat oligonukleotiden givare (ssODNs) infogas mer tillförlitligt än andra typiska reparation mallar, linjärt dubbelsträngat och plasmid DNA54,55,102. På vissa lokus, kan HDR effektivitet förbättras med ssODNs som kompletterar målart eller fördrivna DNA-strängen och besitter homologi armar som är asymmetriska i längd27,55. Eftersom mallen reparation infogas på webbplatsen skär och innehåller sekvensen riktade, måste åtgärder vidtas för att förhindra Cas9 klyva donatorns DNA före eller efter genomisk insättningspunkten. Detta åstadkoms genom att göra tysta mutationer till PAM sekvens eller utsäde regionen, undvika erkännande av Cas9 samtidigt behålla funktionen av den infogade gen21,103. Om ens enda nukleotid ändringar till PAM är sannolikt att avskaffa bindande104, prova att ändra minst fyra nukleotider för att vara säker.
Betydelse och framtida tillämpningar:
Genomet redigering med CRISPR-Cas9 har vuxit fram som en kraftfull metod som gör det möjligt för facile genmanipulation av någon organism. Redigering med den Cas9 RNP tar lite mer ansträngning först men är enkel att använda när reagenser och protokoll är etablerade i ett labb. Redigera celler med förmonterade RNP istället för plasmid DNA leder till högre övergripande redigering effektivitetsvinster, inklusive svåra att nå gen insättningspunkten via HDR, med färre off-target effekter24,25,26 , 27 , 29. vidare praktiker undvika problem med genuttryck RNA nedbrytning, proteinveckning och associationen mellan gärna och Cas9 molekyler syntetiseras separat inom den cell22,23. RNP redigering också kringgår säkerhet oro för insertionsmutationer och ihållande uttryck som kan uppstå när viral leveransmetoder är används kliniskt14. På grund av dessa fördelar ynnest många forskare bedriver preklinisk, proof-of-concept experiment RNP redigering för mänskliga terapeutiska tillämpningar. Både i vivo och ex vivo RNP-baserade genomet redigering metoder är under utveckling att behandla eller även bota en mängd tillstånd, från genetiska sjukdomar som Duchennes muskeldystrofi105 och sicklecellsjukdom27 till HIV29 och cancer11. Intressant, används Cas9 RNP alltmer som en leveransmetod för jordbrukets teknik eftersom det möjliggör ‘DNA-fri’ redigering av växter33,34,36.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar många tidigare medlemmar i våra labb och Bay Area genomet redigering gemenskapen för deras bidrag till utvecklingen av dessa metoder. Vi tackar Ross Wilson för att kritiskt läsa detta manuskript.
Alexander Marsons forskning stöds av en gåva från den Jake Aronov och en nationell multipelskleros samfund bevilja (CA 1074-A-21). Alexander Marson rymmer en karriär Award för medicinska forskare från Burroughs Wellcome fonden och är en Chan Zuckerberg Biohub utredare. Jacob E. Corns forskning stöds av Li Ka Shing Foundation, Heritage medicinsk medicinska forskningsinstitut och California Institute for Regenerative Medicine. Behnom Farboud och Barbara J. Meyers forskning finansieras delvis av NIGMS bidraget R01 GM030702 till Barbara J. Meyer, som är en utredare för Howard Hughes Medical Institute. Erin Jarvis och Nipam H. Patels forskning finansieras delvis av NSF bidraget IOS-1257379 och Erin Jarvis erkänner stöd från en NSF-GRFP och en Philomathia Graduate Fellowship.
Reagents/Materials | |||
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells | AllCells | PB032-2 | |
StemSpan SFEM | StemCell Technologies | 09650 | |
StemSpan CC110 | StemCell Technologies | 02697 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3032 | |
RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid | Sigma | R0883-6X500ML | |
EasySep™ Human T Cell Isolation Kit | Stemcell | 17951 | |
cell culture plate, 96 wells, round | Fisher Scientific | 3799 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Life Tech | 40203D | |
Reombinant Human IL-2 | UCSF Pharmacy | NA | |
SepMate-50 500-pack IVD | Stemcell Technologies | 85460 | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
Compressed nitrogen | – | ||
60 mM culture dishes | BD | ||
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
Tungsten wire (0.005 in. diameter) | Ted Pella | ||
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) | – | ||
Marine salt | – | ||
9" pasteur pipettes | – | ||
Phenol red | – | ||
Nuclease-free water | – | ||
Equipment | |||
4D Nucleofector | Lonza | AAF-1002X | |
MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol) | Sutter Instrument | P-80/PC | |
Microinjector (for P. hawaiensis protocol) | Narishige | IM300 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NG-agar |