Summary
Neste protocolo, descrevemos a seleção e a preparação de células adequadas para micromanipulação e o uso de um micromanipulador piezoelétrico para reposicionar os cromossomos dentro dessas células.
Abstract
A micromanipulação de cromossomos tem sido um método essencial para iluminar o mecanismo para congression do cromossomo, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase e tem sido a chave para entender o que controla os movimentos do cromossomo durante a divisão celular. Um biólogo especializado pode usar um micromanipulador para desanexar cromossomos do eixo, para reposicionar cromossomos dentro da célula e para aplicar forças aos cromossomas usando uma agulha de vidro pequeno com uma ponta muito fina. Enquanto que as perturbações podem ser feitas para cromossomos usando outros métodos, como armadilhas ópticas e outros usos de um laser, até à data, nenhum outro método permite o reposicionamento dos componentes celulares na escala de dezenas a centenas de micra, com pouco ou nenhum dano à célula .
A seleção e preparação de células adequadas para a micromanipulação de cromossomos, especificamente, descrevendo a preparação do gafanhoto e grilo culturas primárias de maturação para o uso em imagem latente da viver-pilha e micromanipulação, são descritos aqui. Além disso, mostramos a construção de uma agulha a ser usado para mover-se com uma agulha de vidro acompanhada de cromossomos dentro da célula e o uso de um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick para reposicionar os cromossomos dentro das células de divisão. Um resultado de exemplo mostra o uso de um micromanipulador para desanexar um cromossomo de um eixo em uma maturação primário e reposicionar esse cromossomo dentro da célula.
Introduction
Micromanipulação revelou partes do mecanismo de um cromossoma congression, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase. A mais antiga publicação descrevendo os resultados de experimentos de micromanipulação foi por Robert Chambers1. Câmaras usado um micromanipulador mecânica com uma agulha de vidro anexado para sondar o citoplasma de um número de diferentes tipos de células. Infelizmente, os métodos de contraste que permitiu a visualização dos cromossomos e muitos outros componentes celulares em células vivas não estavam disponíveis na época, para que experimentos de Chambers não podem mostrar os efeitos de reposicionamento tais componentes celulares. Micromanipulations precoce que alterou a posição do cromossomo usado o aparelho de câmaras para varrer a midzone do eixo nas células anáfase, mostrando que tais manipulações podem alterar a posição dos braços do cromossoma em neuroblastos de gafanhoto anáfase2 . Nicklas e seus colaboradores foram os primeiros a realizar bem micromanipulations de cromossomos, esticando os cromossomos3, desanexando-os do eixo e induzir a uma reorientação3,4, estabilizando uma malorientation, aplicando a tensão ao cromossomos5,6,7e medindo as forças produzidas por eixos em anáfase8,9. Outros trabalhos por Nicklas laboratório mostraram que os grânulos citoplasmáticos também podem ser manipulado10 e que podem ser reposicionadas centrossomas micromanipulação11. Micromanipulação não é apenas útil para mover cromossomos e outros componentes celulares. Uma agulha de micromanipulação limpa pode cortar um fuso mitótico em células de demembranated12 , ou pode ser usada para dissolver o envelope nuclear13. Além disso, células adjacentes podem ser fundidas por micromanipulação14,15.
Com uma grande variedade de experiências interessantes que pode ser feito usando micromanipulação, é à primeira vista surpreendente que experimentos de micromanipulação tem sido feitos por muito poucos biólogos de cromossomo. Uma razão para esta deficiência é que mitotically-divisão de culturas de células que são derivadas de tecidos de vertebrados e são comumente usadas para estudar os movimentos do cromossomo são extremamente difíceis de micromanipulate. Estas células de cultura de tecido geralmente têm um citoesqueleto cortical que "fica no caminho", da micromanipulação de agulha e cromossomos também não podem ser alcançados pela agulha ou a agulha mói através da célula, levando a uma ruptura da célula e a morte. Nós e outros experimentadores que usam micromanipulação, encontraram células artrópodes para ser passível de micromanipulação. Artrópodes espermatócitos espalham-se facilmente sob uma camada de óleo halocarbono e parecem ter um muito menos robusto citoesqueleto cortical subjacente da membrana celular durante a divisão celular. Assim, os testículos de artrópodes fornecem uma boa fonte de meiotically-divisão de células (espermatócitos) e mitotically-divisão de células (espermatogónias) com cromossomos facilmente acessíveis para micromanipulação. Um seccionamento serial de uma maturação de gafanhoto fixada durante uma manipulação revelou que a agulha não penetra a membrana celular; a membrana celular deforma ao redor da agulha (Nicklas R.B., comunicação pessoal). Espermatócitos de vários táxons de insetos e aranhas têm sido micromanipulated com sucesso, incluindo gafanhotos, mantids orando, moscas de fruta, guindaste moscas, grilos, spittlebugs, traças, aranhas viúva-negra, aranhas adega e aranhas orb-tecendo 3,7,17,18,19,20,21,22. Cultas, mitotically-divisão de células de insetos podem ser micromanipulated. Por exemplo, os cromossomos em neuroblastos de gafanhoto numa cultura primária têm cromossomos que podem ser prontamente micromanipulated2,23. Suspeitamos que o disponível cultivadas linhas derivadas de Drosophila e outros insetos também será micromanipulatable, embora nós não testamos a técnica com essas células. Vamos mostrar como dividir células de gafanhotos e grilos pode estar preparado para uma micromanipulação. Grilos são fáceis de obter da maioria das lojas de animais em qualquer época do ano. Gafanhotos só são facilmente obteníveis no verão, a menos que o pesquisador tem acesso a uma colônia de laboratório, mas a espécie utilizada (Melanoplus sanguinipes) tem aplainado facilmente células e cromossomos longos, fácil de manipular.
Outra razão por que os experimentos de micromanipulação tem sido feitos por um pequeno punhado de biólogos é que Micromanipuladores que movem os cromossomos bem estão raramente disponíveis no mercado. Descobrimos que um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick controla o movimento da agulha sem vibração, deriva, ou desfasamento entre o movimento do joystick e o movimento da agulha, mas outros tipos de manipuladores também com êxito podem empurrar cromossomos ao redor na célula. Os Micromanipuladores desenhados por Ellis e Begg25,26 são ideais para a micromanipulação de cromossomos, embora eles usam a tecnologia mais antiga. Micromanipuladores piezoelétricos são atualmente disponíveis e comumente utilizada em eletrofisiologia; no entanto, estes Micromanipuladores não são normalmente controlado por joystick. Controle de joystick é chave para os movimentos suaves necessários para uma bem sucedida micromanipulação, e então um joystick personalizado deve ser construído a funcione os Micromanipuladores piezoelétricos atualmente disponíveis para micromanipulação um cromossomo. Os manche-controlou piezoelétricos Micromanipuladores que funcionam melhor tem controle direto da posição, na qual o movimento do joystick traduz diretamente a um movimento de agulha.
Um micromanipulador piezoelétrico recém-projetado pode ser construído de peças comercialmente disponíveis que podem ser facilmente substituídas e de alguns pequenos componentes impressos em 3D, e funciona bem para cromossomo micromanipulação24. O micromanipulador sensibilidade ajustável, posicionamento manual grosseiros e não tem vibração, deriva ou atraso no movimento da agulha e controle direto da posição da agulha. Os cientistas podem construir o micromanipulador usando instruções disponíveis on-line24. Abaixo estão os métodos para a preparação de uma cultura de células primárias de maturação e para micromanipulating os cromossomos dentro das células em cultura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação da cultura de pilha de maturação insetos primários para micromanipulação
- Preparação de slide
- Obter uma lâmina de vidro de 75 mm x 25 mm com um orifício circular de 20 mm de diâmetro cortado no centro do slide.
Nota: Estas foram cortadas de uma única folha de janela de vidro do tamanho de uma lâmina de vidro com um buraco no centro. - Executar uma lamela de 25 x 25 mm #1.5 através de uma chama de bico de Bunsen 2 s.
- Aplique lubrificante vácuo ao redor da borda do furo no vidro slide
- Coloca a lamela sobre o buraco como na Figura 1. Pressione-o e certifique-se de forma a um selo apertado.
- Virar a lâmina de vidro e encha a dissecação bem com óleo halocarbono.
- Obter uma lâmina de vidro de 75 mm x 25 mm com um orifício circular de 20 mm de diâmetro cortado no centro do slide.
- Preparação de cultura de maturação para visualização no microscópio
Nota: Aqui, descrevemos o método de preparação de cultura usando células gafanhoto ou grilo. Conteúdo de testículos de outros artrópodes pode ser cultivado utilizando um método semelhante.- Obter promissor grilos masculinos (ou gafanhotos). Coloque um inseto vivo no frigorífico durante cerca de 2 min para frio-anestesiá-lo. Usando tesouras de dissecação, rapidamente corte a superfície dorsal paralelo ao eixo longitudinal do abdome diretamente para trás os botões da asa. Aperte manualmente o abdômen suavemente para empurrar os testículos através do corte no exoesqueleto (Figura 2).
- Usando a pinça, coloque os testículos isolados em uma dissecação bem contendo óleo halocarbono.
- Se necessário, Ver os testículos sob um microscópio de dissecação. Dividi-los em pedaços menores, usando pinça pontas fina, removendo qualquer gordura cobrindo os testículos e usar fórceps pontas fina para separar os testículos (Figura 3A e 3B). Espalhe o conteúdo de testículos sob o óleo, na superfície da lamela (Figura 3).
- Espalhe o conteúdo de testículos até a porção de propagação do testículo é pouco perceptível aos olhos (Figura 3). Use poços adicionais dissociação carregados de óleo se necessário.
2. micromanipulação
- Produção do microneedle
- Coloque uma extremidade de um tubo de vidro (0,85 mm de diâmetro exterior, 0.65 mm de diâmetro interno) na chama de um bico de Bunsen. Puxe a extremidade do tubo de vidro de tal forma que é formado um ângulo de 150°, e uma área estendida do tubo de vidro estreito é criada. Quebre a tubulação na região fina para que a região fina, estendendo-se desde o ângulo é aproximadamente 10 mm de comprimento (Figura 4A).
- Usando um microforge (ou feitos sob medida de acordo com Powell27 ou comercialmente disponíveis-consulte Tabela de materiais), toque na ponta da agulha para o fio de platina quente para derreter o vidro na ponta vidro. Forma um ângulo de aproximadamente 45° entre a agulha e o fio de platina da microforge (Figura 4B). Puxe o vidro do fio quente, enquanto a interrompê-lo para o fio, formando uma ponta fina de ≤1.5 milímetros na extremidade da agulha vidro.
Nota: O diâmetro de ponta será difícil de medir, mas uma ponta deste comprimento é susceptível de produzir uma agulha firme, mas flexível que será apropriada para micromanipulação. Alternativamente, um puxador de micropipeta poderia ser usado para criar o tubo de vidro com um diâmetro de ponta adequada (o experimentador terá que testar diferentes receitas puxa para produzir um microneedle apropriadamente firme, mas flexível para o trabalho). A agulha pode ser colocada num suporte que é dado forma similarmente para a manipulação de agulha criada de acordo com o método descrito acima.
- Posicionamento do micromanipulador
- O slide preparado no palco de um microscópio de contraste de fase invertida, de lugar. Encontrar as células em divisão e centralizá-las no campo de visão. Concentre-se nas células usando a ampliação mais reduzida possível.
Nota: Usamos um objectivo de contraste de fase X 16. - Coloque o microneedle no suporte de agulha sobre o micromanipulador.
- Manualmente, posicione o microneedle no caminho de luz do microscópio, para que a ponta da agulha é iluminada pela luz (Figura 5B).
- Focar o microscópio vários aviões focais acima do plano em que as células mentem.
- Reposicione o microneedle usando o controlador de joystick em uma baixa sensibilidade várias vezes para encontrar a sombra da agulha no X - e y-Axes. Continue a reajustar a posição até que a posição da ponta é visível. Ajuste a posição da agulha ao longo do eixo z até a ponta da agulha está em foco.
- Mudar o foco sobre as células e, em seguida, focar o microscópio acima do plano de celular para que as células são apenas fora de foco e invisível. Reajuste a posição da agulha para que sua ponta está em foco neste plano focal.
- Ajuste a ampliação do microscópio, conforme necessário.
Nota: Utilizamos um objectivo de contraste de fase de abertura numérica (NA) 100 X 1.4 para a micromanipulação. - Depois focando as células com o objectivo de maior ampliação, focar novamente o microscópio acima do plano de celular para que as células são apenas fora de foco e invisível. Usando uma definição de maior sensibilidade, reajuste a posição da agulha para que sua ponta está em foco e centrado no plano focal acima do plano em que as células mentem.
- Mudar o foco sobre as células, ajustando a sua posição, então eles permanecem no centro do campo de visão. A agulha está agora pronta para a micromanipulação.
- O slide preparado no palco de um microscópio de contraste de fase invertida, de lugar. Encontrar as células em divisão e centralizá-las no campo de visão. Concentre-se nas células usando a ampliação mais reduzida possível.
- Micromanipulação de cromossomos
- Usando a mesma configuração de sensibilidade quanto o bom posicionamento em uma ampliação alta, use o joystick para controlar o microneedle e intimidar os cromossomos dentro da célula. Mantenha a ponta da agulha acima do plano das células.
- Para puxar ou mover um cromossomo, focar um cromossomo perto do topo da célula.
Nota: Esses cromossomos são mais fáceis de manipular-manipulando cromossomos perto de que lamela torna provável que a agulha vai moer em lamela, estourando a célula e acabar com o experimento. - Ajuste do eixo z no joystick para trazer a ponta da agulha em foco e então mover a agulha de ponta com o joystick em X e Y. Coloque a ponta da agulha diretamente no cromossomo para ser manipulado e empurrá-lo na direção desejada para permitir que o manipulador para o repositi no cromossomo.
- Dependendo de quão longe o cromossomo é empurrado, ou aplicar uma tensão para o cromossomo ou aplicar uma tensão suficiente para desanexar um cromossomo do eixo. Uma vez que um cromossomo é removido de um eixo, colocá-lo em qualquer lugar dentro da célula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 6 mostra uma micromanipulação de amostra de 2 espermatócitos primários de gafanhoto adjacentes em vários exemplos dos possíveis usos de micromanipulação. Esta experiência foi feita usando um microscópio de contraste de fase invertida,. A 0:00 (tempos mostrados estão em min:s) imagem mostra ambas as células antes da manipulação. Um cromossomo na célula inferior é mostrado sob tensão aplicada pela agulha micromanipulação (0:05; preto seta) e então completamente separada do eixo (0:10; preto seta). Um cromossomo na célula inferior (06:25; seta amarela) é empurrado em direção do polo 1 do eixo da célula (07:05; seta amarela) e em seguida, mudou-se fora da área do fuso principal (07:10; área amarela). Os dois cromossomos manipulados (setas amarelas e pretas) neste experimento são mantidos de recolocar o eixo por continuamente sendo empurrados com a agulha de micromanipulação para evitar a formação de novos anexos do eixo. A sombra projectada pela agulha micromanipulação é visível em algumas imagens, mas a ponta da agulha é raramente visível. Estas imagens mostram que é possível reposicionar e aplicar uma tensão para desanexar um cromossomo do eixo usando micromanipulação. Cromossomos podem ser extraídos um fuso na sua prometafase, metáfase e anáfase, embora anáfase cromossomos são extremamente difíceis de separar.
Figura 1 : Vidro slide com lamela anexada. Uma 25 mm x 25 mm, flama-tratados lamela é anexada a uma lâmina de vidro de 75 mm x 25 mm com uma 20 mm no orifício circular de diâmetro corte no centro e selado com graxa de vácuo. Note a falta de bolhas visíveis ou lacunas no vácuo graxa sob a lamínula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Remoção dos testículos do grilo e gafanhoto. Testículos (seta) podem ser removidos de um grilo macho (Acheta domesticus-top) ou um gafanhoto (Melanoplus sanguinipes-inferior) depois que uma incisão é feita no abdômen do inseto, diretamente para trás os gomos de asa (setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Preparação da célula se espalhou. (A) a maior parte de testículos de um grilo é mostrada pela seta. O segmento de testículos utilizado para um único slide é mostrado pela seta. Barra de escala = 1 mm. (B) os testículos do gafanhoto são compostos de um número de túbulos. Normalmente, usamos 4 túbulos de um gafanhoto masculino juvenil para cada slide, como mostrado nesta imagem. Barra de escala = 1 mm. (C) de qualquer espécie, os testículos está quebrado usando fórceps, e o conteúdo dos segmentos de testículo está distribuído em óleo halocarbono. O conteúdo de testículos de propagação sob óleo é mostrado. Barra de escala = 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Uma agulha de micromanipulação, formada a partir de tubos de vidro. (A), a forma geral da agulha é um segmento de tempo, sem modificações de vidro tubo (≥ 10 cm), com uma curva de aproximadamente 150 ° aproximadamente 10 mm da extremidade (formado por alongamento e dobra o tubo de vidro em uma chama de bico de Bunsen). (B) o painel mostra a agulha colocada no microforge. As formas de agulha (seta) um aproximadamente o ângulo de 60° com o filamento de fio de platina (seta) antes de aquecê-lo. (C), a ponta da agulha (seta) é formada após o tubo de vidro dobrado é tocado para o filamento de fio de platina quente (seta) no microforge e afastou-se. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Colocação da agulha no caminho de luz do microscópio. (A), este painel mostra uma exibição do micromanipulador. (B), este painel mostra uma visão mais apurada da agulha micromanipulação colocada no porta-agulha micromanipulador, que é um pedaço de 3-d impresso de plástico. (C), A ponta da agulha posicionada no caminho de luz de um microscópio de contraste de fase invertida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Micromanipulação de cromossomos em dois espermatócitos primários de gafanhoto adjacentes. Os tempos são mostrados em min:s. a 0:00 imagem mostra ambas as células antes de micromanipulação. Tensão é aplicada no cromossomo (indicado pela seta preta) usando a agulha de micromanipulação em direção do polo superior do eixo da célula (0:05). O cromossomo é desanexado do eixo e empurrou em direção do polo inferior do eixo (0:10) e eventualmente mudou-se fora da área do fuso principal (06:25, 07:05 e 07:10). Um cromossomo na célula adjacente (06:25, seta amarela) é empurrado para o polo superior do eixo naquela cela (07:05, seta amarela) e então movido para fora da massa do eixo principal (07:10, seta amarela). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Com a prática, a se mover cromossomos na célula pode se tornar segunda natureza. Agulhas que são suficientemente rígida e suficientemente fina com ponta são difíceis de "pegar o jeito de" fabricando, mas essa capacidade também vem com a prática. Agulhas, que são tão finas que eles deformam quando mudei o óleo halocarbono não será útil para empurrar os cromossomos na célula. Agulhas, que são tão blunt que suas dicas são visíveis e tão grande como 1/3 da largura de um cromossoma (ou maior) é muito prováveis matar a célula. A criação de uma agulha que é suficientemente bom para empurrar os cromossomos, mas não tão brusco que matariam a célula é a etapa crucial do protocolo.
Sucesso resulta tipicamente quando os organismos saudáveis são usados para fazer os preparativos de maturação, e os cromossomos perto da superfície superior da célula são selecionados para micromanipulação. Tentativas para manipular os cromossomos perto da lamela-superfície da célula, muitas vezes resultam em moagem a agulha de micromanipulação em lamela e perfurando a célula, terminando assim o experimento. Se a célula não for perfurado ou caso contrário insalubres, a célula deve sobreviver micromanipulação. Morte celular é facilmente diagnosticada, como os cromossomos agregam muito rapidamente. Micromanipulated células tipicamente sobrevivem através da anáfase e citocinese, e temos realizado com sucesso experimentos de micromanipulação longa de 6 h.
Enquanto há uma curva de aprendizagem e um requisito para adquirir o equipamento em preparar-se para micromanipulate, há uma grande quantidade de valor em ser capaz de reposicionar manualmente componentes celulares de forma precisa. Como dito acima, não há nenhum outro método atualmente disponível que permite tal reposicionamento exacto de grandes estruturas celulares. Há uma longa história de uso micromanipulação para mover estruturas na célula. Exemplos, com belas figuras do processo, do uso de micromanipulação para medir forças exercidas na anáfase eu cromossomos8 e aplicar uma tensão de cromossomos5 estão disponíveis na literatura. Além disso, muitos exemplos de como micromanipulação também pode ser usada para alterar a posição de outras estruturas no celular, como microtúbulos28,29, interromper outras estruturas na célula como o envelope nuclear13ou fusível 14,de células adjacentes15 são ilustrados na literatura.
Experimentos de micromanipulação mais precisam ser feito, como a capacidade para reposicionar manualmente cromossomos e outras estruturas, aplicar forças para estruturas, e medir forças em cromossomas em diferentes fases da divisão celular, conduzirá a uma melhor compreensão dos processos celulares e a criação de modelos matemáticos precisos, preditivas de processos celulares. Aplicações futuras permitirá uma fácil medição de forças nos cromossomos em todas as fases da divisão celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos sua valiosa discussão Jessica Hall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu (2018).
- Ellis, G. W.
- Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
