Summary
يصف لنا في هذا البروتوكول، واختيار وإعداد الخلايا المناسبة ميكرومانيبوليشن واستخدام ميكرومانيبولاتور كهرضغطية لتغيير موضع الكروموسومات داخل تلك الخلايا.
Abstract
ميكرومانيبوليشن الكروموزومات كانت وسيلة أساسية لإلقاء الضوء على إليه كونجريشن كروموسوم، وحاجز المغزل، وحركات كروموسوم طور الصعود، وكان مفتاح لفهم ما هي الضوابط حركات كروموسوم خلال تقسيم الخلية. يمكن استخدام بيولوجي مهرة ميكرومانيبولاتور لفصل الكروموسومات من محور الدوران، لإعادة تعيين موضع الكروموزومات داخل الخلية، وتطبيق القوات على الكروموسومات باستخدام إبرة زجاجية صغيرة مع تلميح جيد جداً. بينما يمكن جعل اضطرابات الكروموسومات باستخدام أساليب أخرى مثل تعويض بصري واستخدامات أخرى لليزر، حتى الآن، لا توجد طريقة أخرى يسمح إعادة تنظيم المكونات الخلوية بمقياس من عشرات إلى مئات ميكرون مع قليل من أي ضرر للخلية .
يتم اختيار وإعداد الخلايا المناسبة ميكرومانيبوليشن الكروموسومات، تصف على وجه التحديد إعداد جندب والكريكيت spermatocyte الثقافات الأولية لاستخدامها في تصوير خلية يعيش وميكرومانيبوليشن، ووصف هنا. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض بناء إبرة لاستخدامها لنقل الصبغيات داخل الخلية، واستخدام ميكرومانيبولاتور كهرضغطية تسيطر جويستيك بإبرة زجاجية الملحقة بها لتغيير موضع الكروموسومات داخل تقسيم الخلايا. ويظهر عينة نتيجة استخدام ميكرومانيبولاتور لفصل كروموسوم من مغزل في سبيرماتوسيتي الأولية وتغيير موضع هذا الكروموسوم داخل الخلية.
Introduction
وكشفت ميكرومانيبوليشن أجزاء إليه كونجريشن كروموسوم، وحاجز المغزل، وحركات كروموسوم طور الصعود. وكان المنشور أقرب وصف نتائج التجارب ميكرومانيبوليشن روبرت تشامبرز1. استخدام الدوائر ميكرومانيبولاتور ميكانيكية مع إبرة زجاج مرفقة التحقيق في السيتوبلازم لعدد من أنواع مختلفة من الخلايا. ولسوء الحظ، تباين الأساليب التي يسمح التصور من الكروموسومات والعديد من المكونات الخلوية الأخرى في الخلايا الحية لم تكن متاحة في ذلك الوقت، حيث لا تستطيع أن تثبت التجارب الدوائر آثار إعادة تموضع هذه المكونات الخلوية. ميكرومانيبوليشنز المبكر التي غيرت موقف كروموسوم يستخدم جهاز الدوائر لاكتساح ميدزوني المغزل في طور الصعود الخلايا، تبين أن مثل هذه المعالجات يمكن أن تغير موقف كروموسوم الأسلحة في طور الصعود جندب نيوروبلاستس2 . نيكلاس ومعاونيه كانوا الأول من أداء غرامة ميكرومانيبوليشنز من الكروموسومات، تمتد الكروموسومات3، وفصل لهم من محور الدوران والحث إعادة توجيه3،4، استقرار مالورينتيشن تطبيق التوتر إلى الكروموسومات6،،من57، وقياس القوى المنتجة بمغزل في طور الصعود8،9. أعمال أخرى بالمعمل نيكلاس أظهرت أيضا أن حبيبات هيولى التلاعب10 وأن سينتروسوميس يمكن أن تكون إعادة ميكرومانيبوليشن11. ميكرومانيبوليشن ليست مفيدة فقط لنقل الكروموسومات والمكونات الخلوية الأخرى. يمكن قطع نظيفة من خلال مغزل الانقسامية في الخلايا ديميمبراناتيد12 إبرة ميكرومانيبوليشن أو يمكن استخدامها لحل المغلف النووية13. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنصهر فيها الخلايا المتجاورة ميكرومانيبوليشن14،15.
مع طائفة واسعة من التجارب المثيرة للاهتمام التي يمكن القيام به باستخدام ميكرومانيبوليشن، فمن المدهش للوهلة الأولى أن ميكرومانيبوليشن تجارب أجريت بعدد قليل جداً من علماء الأحياء كروموسوم. أحد أسباب هذا القصور هو أن تقسيم ميتوتيكالي الخلايا المستزرعة التي مشتقة من الأنسجة الفقاريات وتستخدم عادة لدراسة الحركات كروموسوم صعبة للغاية في ميكرومانيبولاتي. عموما لديهم هذه الخلايا زراعة الأنسجة سيتوسكيليتون القشرية أن "يحصل في الطريق" من ميكرومانيبوليشن إبرة، والكروموسومات أما لا يمكن الوصول بالإبرة أو يطحن الإبرة عن طريق الخلية، مما يؤدي إلى تمزق الخلايا والموت. ونحن، والأخرى المجربون الذين يستخدمون ميكرومانيبوليشن، وجدت الخلايا المفصلية لتكون قابلة ميكرومانيبوليشن. وتنتشر بسهولة تحت طبقة النفط الهالوكربون spermatocytes المفصلية ويبدو cytoskeleton القشرية أقل بكثير من قوي الكامنة وراء غشاء الخلية أثناء تقسيم الخلية. وهكذا، الخصيتين المفصلية توفر مصدرا جيدا لخلايا تقسيم ميوتيكالي (سبيرماتوسيتيس) وميتوتيكالي تقسيم الخلايا (سبيرماتوجونيا) مع الكروموزومات يمكن الوصول بسهولة ميكرومانيبوليشن. تقطيع المسلسل من spermatocyte جندب ثابت خلال تلاعب كشفت أن الإبرة ابدأ تخترق غشاء الخلية؛ تبعثر غشاء الخلية حول الإبرة (نيكلاس سنغ، اتصال شخصي). سبيرماتوسيتيس من عدد من الأصناف العنكبوت والحشرات، وقد تم ميكرومانيبولاتيد بنجاح، بما في ذلك الجنادب، mantids الصلاة وذباب الفاكهة، رافعة الذباب، الصراصير، سبيتليبوجس، العث، العناكب الأرملة السوداء، عناكب القبو والجرم السماوي نسج العناكب 37،،،من1719،18،20،،من2122. يمكن أن تكون الخلايا المستزرعة، وتقسيم ميتوتيكالي من الحشرات ميكرومانيبولاتيد. على سبيل المثال، قد الكروموسومات في neuroblasts جندب في ثقافة الابتدائي الكروموسومات التي يمكن بسهولة ميكرومانيبولاتيد2،23. أننا نشتبه في أنه مثقف تتوفر خطوط المستمدة من المورفولوجية والحشرات الأخرى سوف تكون أيضا ميكرومانيبولاتابل، على الرغم من أننا لم تختبر هذه التقنية مع هذه الخلايا. ونحن سوف تظهر كيف يمكن إعداد تقسيم الخلايا من الجنادب والصراصير ميكرومانيبوليشن. الصراصير سهلة للحصول على معظم محلات الحيوانات الأليفة في أي وقت من السنة. الجنادب فقط التي يمكن الحصول عليها بسهولة في الصيف إلا إذا كان الباحث الوصول إلى مستعمرة مختبر، ولكن الأنواع المستخدمة (سانجوينيبيس ميلانوبلوس) وقد سويت بالأرض بسهولة الخلايا والكروموسومات طويلة، وسهلة للتعامل.
وهناك سبب آخر لماذا فعلت التجارب ميكرومانيبوليشن حفنة صغيرة من علماء الأحياء هو أن ميكرومانيبولاتورس أن تتحرك الكروموسومات نادراً ما تتوفر في السوق. وقد وجدنا أن يتحكم ميكرومانيبولاتور كهرضغطية جويستيك تسيطر حركة إبرة مع لا اهتزاز أو الانجراف الفاصلة بين الإبرة وحركة المقود، ولكن يمكن دفع أنواع أخرى من المتلاعبين بنجاح أيضا الكروموسومات حولها في الخلية. ميكرومانيبولاتورس صممه إيليس وبيج25،26 تعتبر مثالية ميكرومانيبوليشن الكروموسومات، على الرغم من أنها تستخدم تكنولوجيا قديمة. ميكرومانيبولاتورس كهرضغطية المتوفرة حاليا والمستخدمة عادة في الكهربية؛ ومع ذلك، ليست هذه ميكرومانيبولاتورس عادة ما تسيطر عليها جويستيك. عصا التحكم هو المفتاح لحركات سلسة المطلوبة من أجل ميكرومانيبوليشن نجاح، وحتى ينبغي تشييد جويستيك مخصصة لجعل ميكرومانيبولاتورس كهرضغطية متاحة في الوقت الراهن العمل من أجل ميكرومانيبوليشن كروموسوم. وقد ميكرومانيبولاتورس كهرضغطية تسيطر على عصا التحكم التي تعمل بشكل أفضل مراقبة الموقف المباشر، الذي يترجم حركة الجويستيك مباشرة إلى حركة إبرة.
يمكن بناؤها ميكرومانيبولاتور كهرضغطية المصممة حديثا من أجزاء المتاحة تجارياً التي يمكن استبدالها بسهولة، ومن بعض المكونات المطبوعة ثلاثي الأبعاد الصغيرة، وأنه يعمل بشكل جيد كروموسوم ميكرومانيبوليشن24. وقد ميكرومانيبولاتور حساسية قابلة للضبط أو دليل المواقع الخشنة، ولا الاهتزاز، والانجراف أو متخلفة في حركة الإبرة، ومراقبة الموقف المباشر من الإبرة. يمكن للعلماء بناء ميكرومانيبولاتور استخدام الإرشادات المتوفرة على الإنترنت24. وفيما يلي الطرق لإعداد ثقافة خلية الأولية سبيرماتوسيتي وميكرومانيبولاتينج الكروموسومات داخل الخلايا في تلك الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد ثقافة الخلية الأولية Spermatocyte الحشرات ميكرومانيبوليشن
- إعداد الشرائح
- الحصول على شريحة زجاجية 75 مم × 25 مم مع فتحه دائرية قطرها 20 ملم قطع في وسط الشريحة.
ملاحظة: هذه قطعت من ورقة واحدة من زجاج النوافذ ليكون بحجم شريحة زجاجية مع وجود ثقب في الوسط. - تشغيل ساترة 25 مم × 25 مم #1.5 عن طريق لهب موقد بنسن 2 s.
- تطبيق فراغ الشحوم حول حافة الثقب في الشريحة الزجاجية
- مكان ساترة في حفرة كما في الشكل 1. اضغط عليه وتأكد من أن تشكل ختم ضيق.
- الوجه الشريحة الزجاجية وملء التشريح جيدا مع زيت الهالوكربون.
- الحصول على شريحة زجاجية 75 مم × 25 مم مع فتحه دائرية قطرها 20 ملم قطع في وسط الشريحة.
- إعداد الثقافة سبيرماتوسيتي للعرض على المجهر
ملاحظة: هنا، نحن تصف طريقة إعداد ثقافة استخدام الخلايا جندب أو لعبة الكريكيت. يمكن مثقف محتويات الخصيتين المفصليات الأخرى باستخدام أسلوب مماثل.- الحصول على سوبادولت الصراصير الذكور (أو الجنادب). مكان الحشرات حية في ثلاجة لحوالي 2 دقيقة تخدير من البرد. استخدام مقص تشريح، بسرعة قطع من خلال سطح الظهرية موازيا للمحور الطويل للبطن مباشرة خلف براعم الجناح. يدوياً ضغط البطن برفق لدفع الخصيتين من خلال خفض الهيكل الخارجي (الشكل 2).
- استخدام الملقط، مكان الخصيتين معزولة في تشريح جيدا المحتوية على زيت الهالوكربون.
- إذا لزم الأمر، عرض الخصيتين تحت مجهر تشريح. تقسيمها إلى أجزاء أصغر باستخدام الملقط أشار الجميلة، إزالة الدهون أي يغطي الخصيتين، واستخدام الملقط غرامة-وأشار إلى تفريق الخصيتين (الشكل 3 ألف و 3 باء). نشر محتويات الخصيتين تحت النفط، على سطح ساترة (الشكل 3).
- نشر محتويات الخصيتين حتى يتم انتشار جزء من الخصية الكاد للعيون (الشكل 3). استخدام الآبار تفارق تحميل النفط الإضافية إذا لزم الأمر.
2-ميكرومانيبوليشن
- الإنتاج ميكرونيدلي
- ضع واحدة من نهاية أنبوب الزجاج (0.85 مم في القطر الخارجي، 0.65 مم في القطر الداخلي) في شعلة الموقد بنسن. سحب نهاية الأنابيب الزجاجية بطريقة أن يتم تشكيل زاوية 150 درجة، وهو إنشاء منطقة واسعة من أنابيب زجاجية ضيقة. كسر الأنابيب في منطقة رقيقة حيث يكون منطقة رقيقة تمتد من الزاوية حوالي 10 مم طويلة (الشكل 4 أ).
- استخدام ميكروفورجي (مصنوعة خصيصا وفقا لأول27 أو تجارياً المتاحة انظر الجدول للمواد)، لمس غيض الإبرة الزجاجية لسلك البلاتين الساخن لإذابة الزجاج في التلميح. النموذج حوالي 45 درجة زاوية بين الإبرة وسلك البلاتين من ميكروفورجي (الشكل 4 باء). سحب الزجاج بعيداً عن الأسلاك الساخنة، بينما قطع الحرارة إلى السلك، تشكيل تلميح رقيقة من ≤1.5 مم في نهاية الإبرة الزجاج.
ملاحظة: سيكون من الصعب قياس القطر نصيحة، لكن تلميح لهذا الطول من المحتمل أن تنتج إبرة ثابتة ولكنها مرنة وسوف تكون مناسبة ميكرومانيبوليشن. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ساحبة ميكروبيبيتي لإنشاء أنابيب زجاجية مع قطر تلميح مناسبة (المجرب سيتعين اختبار وصفات شد مختلفة لإنتاج microneedle ثابتة لكن مرنة على نحو ملائم للوظيفة). يمكن أن توضع الإبرة في حامل أن يتشكل على نحو مماثل للتلاعب بالإبرة التي تم إنشاؤها وفقا للطريقة الموضحة أعلاه.
- تحديد المواقع ميكرومانيبولاتور
- مكان الشريحة المعدة في مرحلة المجهر المقلوب، المرحلة-على النقيض. العثور على تقسيم الخلايا ومركز لهم في مجال الرؤية. وتركز على الخلايا باستخدام التكبير أقل ممكن.
ملاحظة: كنا هدفا مرحلة-تباين X 16. - مكان ميكرونيدلي في حامل الإبرة على ميكرومانيبولاتور.
- يدوياً ضع في ميكرونيدلي في مسار الضوء المجهر حيث غيض الإبرة مضاءة بالضوء (الشكل 5 (ب)).
- وتركز المجهر عدة طائرات التنسيق أعلاه أن الطائرة التي تكمن الخلايا.
- تغيير موضع ميكرونيدلي استخدام وحدة تحكم المقود في حساسية منخفضة عدة مرات للبحث عن ظل الإبرة في العاشر--وياكسيس. الاستمرار في تعديل الموقف حتى موقف التلميح مرئياً. ضبط موضع الإبرة على طول محور ع حتى تلميح إبرة في التركيز.
- تركيز على الخلايا، ثم تركز المجهر أعلاه الطائرة الخلية حيث تكون الخلايا فقط للخروج من التركيز وغير مرئية. إعادة ضبط موضع الإبرة حتى لا يكون طرفها في التركيز في هذا المستوى البؤري.
- ضبط تكبير المجهر حسب الحاجة.
ملاحظة: كنا هدفا تباين مرحلة فتحه عددية (غ) 100 × 1.4 ميكرومانيبوليشن. - بعد التركيز على الخلايا باستخدام هدف أعلى التكبير، مرة أخرى تركز المجهر أعلاه الطائرة الخلية حيث تكون الخلايا فقط للخروج من التركيز وغير مرئية. استخدام إعداد حساسية أعلى، إعادة ضبط موضع الإبرة حيث يكون طرفها هو في التركيز وتركزت في المستوى البؤري أعلاه أن الطائرة التي تكمن الخلايا.
- تركيز على الخلايا، وتعديل موقفها حتى يمكنهم البقاء في مركز مجال الرؤية. الإبرة جاهز الآن ميكرومانيبوليشن.
- مكان الشريحة المعدة في مرحلة المجهر المقلوب، المرحلة-على النقيض. العثور على تقسيم الخلايا ومركز لهم في مجال الرؤية. وتركز على الخلايا باستخدام التكبير أقل ممكن.
- ميكرومانيبوليشن الكروموسومات
- استخدام نفس الإعداد حساسية فيما يتعلق بتحديد المواقع الجميلة في تكبير عالية، استخدام الجويستيك للسيطرة ميكرونيدلي، ودفع الكروموزومات داخل الخلية. الحفاظ على طرف إبرة فوق طائرة الخلايا.
- لسحب أو نقل كروموسوم، التركيز على كروموسوم القرب من الجزء العلوي من الخلية.
ملاحظة: هذه الكروموسومات أسهل للتلاعب التلاعب بالكروموسومات قريبة من ساترة يجعل من المرجح أن الإبرة سوف طحن في ساترة، تتضاعف الخلية وتنتهي التجربة. - ضبط محور ع على الجويستيك لإحضار تلميح إبرة إلى التركيز، وثم نقل تلميح الإبرة مع عصا التحكم في العاشر ويوسف مكان غيض الإبرة مباشرة على الكروموسوم التلاعب بها ودفعها في الاتجاه المطلوب للسماح المناور إلى ريبوسيتي على الصبغي.
- اعتماداً على مدى يتم الضغط الكروموسوم، أما تطبيق التوتر على الكروموسوم أو تطبيق التوتر كافية لفصل كروموسوم من محور الدوران. بمجرد إزالة كروموسوم من مغزل، وضعه في أي مكان داخل الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 6 ميكرومانيبوليشن عينة من 2 جندب المتاخمة سبيرماتوسيتيس الأولية في عدة أمثلة للاستخدامات الممكنة ميكرومانيبوليشن. هذه التجربة تم استخدام مجهر تباين مرحلة مقلوب،. 0:00 (أوقات سيظهر في min:s) تظهر الصورة كلا الخليتين قبل التلاعب. ويرد كروموسوم واحد في الخلية السفلي تحت التوتر المطبق بإبرة ميكرومانيبوليشن (0:05؛ والأسود السهم) وثم بعيدة تماما عن محور الدوران (0:10؛ والأسود السهم). كروموسوم واحد في الخلية السفلي (06:25؛ السهم الأصفر) دفعت نحو القطب 1 المغزل في الخلية (07:05؛ السهم الأصفر) وثم انتقل خارج منطقة المغزل الرئيسي (07:10؛ المنطقة الصفراء). يتم الاحتفاظ بكلا الكروموسومات التلاعب (الأسهم الأصفر والأسود) في هذه التجربة من إعادة ربط المغزل التي حثت يجري باستمرار مع إبرة ميكرومانيبوليشن لمنع تشكيل جديد المغزل المرفقات. ظل يلقي بإبرة ميكرومانيبوليشن مرئياً في بعض الصور، ولكن غيض الإبرة مرئياً إلا نادراً. هذه الصور تظهر أنه من الممكن تغيير موضعها وتطبيق التوتر، وفصل كروموسوم من محور الدوران باستخدام ميكرومانيبوليشن. يمكن فصل الكروموسومات من مغزل في بروميتافاسي، الطورية، وطور الصعود، على الرغم من الكروموسومات طور الصعود صعبة للغاية لفصل.
الشكل 1 : الزجاج الشريحة مع ساترة المرفقة. 25 مم × 25 مم، تعامل اللهب ساترة موصولة إلى شريحة زجاجية 75 مم × 25 مم مع 20 مم في حفرة دائرية قطرها قطع في المركز ومختومة بفراغ الشحوم. ملاحظة عدم وجود فقاعات مرئية أو الثغرات في الشحوم فراغ تحت ساترة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : إزالة الخصيتين من لعبة الكريكيت وجندب. يمكن إزالة الخصيتين (السهم) من لعبة كريكيت ذكور (دوميستيكوس أتشيتا--أعلى) أو جندب (سانجوينيبيس ميلانوبلوس-أسفل) بعد إجراء شق في البطن للحشرة، مباشرة خلف براعم الجناح (رؤوس الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إعداد الخلايا تنتشر. (أ) يرد جل الخصيتين من لعبة الكريكيت بالسهم. ويرد الجزء الخصيتين يستخدم لشريحة واحدة برأس السهم. مقياس بار = 1-(ب) الخصيتين جندب تتألف من عدد من الأنابيب. عادة، ونحن استخدام الأنابيب 4 من جندب ذكور الأحداث لكل شريحة، كما هو موضح في هذه الصورة. مقياس بار = 1-(ج) أما الأنواع، الخصيتين يتم تقسيم استخدام الملقط، ومحتويات الأجزاء الخصية تنتشر في النفط الهالوكربون. يتم عرض محتويات الخصيتين انتشار تحت النفط. شريط مقياس = 10 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : إبرة ميكرومانيبوليشن التي تكونت من الأنابيب الزجاجية. (أ) الشكل العام للابرة قطعة طويلة، غير معدلة من زجاج الأنابيب (إيه وان زيرو سم)، مع منحنى من حوالي 150 درجة حوالي 10 مم من النهاية (التي شكلتها وتمتد ثني الأنابيب الزجاجية في لهب موقد بنسن). (ب) يظهر الفريق الإبرة الموضوعة في ميكروفورجي. أشكال إبرة (رأس السهم) حوالي 60° زاوية مع خيوط سلك البلاتين (سهم) قبل التدفئة فإنه. (ج) طرف الإبرة (رأس السهم) شكلت بعد أن لمس أنبوب الزجاج عازمة للشعيرة حارة سلك البلاتين (سهم) في ميكروفورجي وابتعد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : وضع إبرة في مسار ضوء المجهر. (أ) هذا الفريق يظهر طريقة العرض ميكرومانيبولاتور. (ب) هذا الفريق يظهر عرض عن قرب لابره ميكرومانيبوليشن وضعها في حامل إبرة ميكرومانيبولاتور، وقطعة من ثلاثي الأبعاد طباعة البلاستيك. (ج) إبرة نصيحة المتمركزة في مسار الضوء المجهر المقلوب، المرحلة-على النقيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : ميكرومانيبوليشن الكروموسومات في اثنين جندب المتاخمة سبيرماتوسيتيس الأولية- تظهر المرات في min:s. 0:00 صورة يظهر كلا من الخلايا قبل ميكرومانيبوليشن. يتم تطبيق التوتر على الصبغي (كما هو موضح بالسهم الأسود) باستخدام إبرة ميكرومانيبوليشن تجاه القطب المغزل أعلى من تلك الخلية (0:05). الكروموسوم هي بعيدة عن محور الدوران ودفعت نحو القطب المغزل السفلي (0:10)، ونقل في نهاية المطاف خارج منطقة المغزل الرئيسي (06:25، 07:05 و 07:10). كروموسوم في الخلية المجاورة (06:25، السهم الأصفر) دفعت نحو القطب العلوي المغزل في الخلية (07:05، السهم الأصفر) وثم انتقل خارج كتلة المغزل الرئيسي (07:10، السهم الأصفر). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع الممارسة، تتحرك الكروموسومات في الخلية يمكن أن تصبح طبيعة ثانية. الإبر التي تكون شديدة بما فيه الكفاية ورقيقة ذات الرؤوس بما فيه الكفاية من الصعب على "الحصول على براعة من" اختﻻق، ولكن هذه القدرة كما يأتي مع الممارسة. الإبر التي على ما يرام حتى أنها تشوه عند نقل النفط الهالوكربون لن يكون مفيداً لدفع الكروموزومات في الخلية. بصراحة الإبر حتى أن مرئية على نصائح وكبيرة مثل 1/3 عرض الكروموسوم (أو أكبر) من المرجح جداً أن تقتل الخلية. إنشاء إبرة جيد بما فيه الكفاية لدفع الكروموزومات ولكن ليس ذلك صريحا فيما يتعلق بقتل الخلية هو الخطوة الحاسمة للبروتوكول.
ونتائج النجاح عادة عندما تستخدم الكائنات صحية لاستعدادات spermatocyte، ويتم اختيار الكروموزومات قرب السطح العلوي للخلية ميكرومانيبوليشن. محاولات التلاعب بالكروموسومات قرب ساترة-سطح الخلية غالباً ما ينتج عن طحن الإبرة ميكرومانيبوليشن في ساترة وثقب الخلية، وبذلك تنتهي التجربة. إذا لم تكن الخلية ثقب أو خلاف ذلك غير صحية، وينبغي البقاء الخلية ميكرومانيبوليشن. يتم تشخيص موت الخلايا بسهولة، كما الكروموزومات تتجمع معا بسرعة. خلايا ميكرومانيبولاتيد عادة البقاء على قيد الحياة من خلال طور الصعود وسيتوكينيسيس، ونحن قد أجرت بنجاح تجارب طويلة ميكرومانيبوليشن ح 6.
بينما هناك منحنى التعلم حاد، واشتراط الحصول على المعدات في تستعد ميكرومانيبولاتي، إلا أن هناك قدرا كبيرا من القيمة في التمكن من إعادة تحديد موضع العناصر الخلوية يدوياً بشكل دقيق. وكما ذكر أعلاه، هناك أية وسيلة أخرى متاحة حاليا تسمح هذه دقيقة إعادة تنظيم الهياكل الخلوية الكبيرة. وهناك تاريخ طويل من استخدام ميكرومانيبوليشن لنقل الهياكل في الخلية. أمثلة، مع الأرقام الجميلة من هذه العملية، باستخدام ميكرومانيبوليشن لقياس القوى المبذولة في طور الصعود الكروموسومات8 وتطبيق التوتر للكروموزومات5 متوفرة في الأدب. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الأمثلة على كيفية يمكن أيضا استخدام ميكرومانيبوليشن لتغيير وضع هياكل أخرى في28،ميكروتوبوليس الخليوي تشبه29، تعطيل الهياكل الأخرى في الخلية مثل المغلف النووية13، أو الصمامات الخلايا المجاورة14،15 موضحة في الأدب.
أكثر ميكرومانيبوليشن التجارب تحتاج إلى القيام به، كالقدرة على يدوياً إعادة تحديد موضع الكروموسومات وغيرها من الهياكل لتطبيق قوي لهياكل، وقياس القوى في الكروموسومات في مراحل مختلفة من انقسام الخلية سوف يؤدي إلى أفضل فهم العمليات الخلوية، وإيجاد نماذج رياضية دقيقة، التنبؤية للعمليات الخلوية. التطبيقات المستقبلية سوف تسمح قياس سهلة للقوات في الكروموسومات في جميع مراحل انقسام الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر جيسيكا قاعة لمناقشة قيمة لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu (2018).
- Ellis, G. W.
- Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
