Summary
在本协议中, 我们描述了用于显微操作的合适细胞的选择和制备, 以及使用压电微操作机器人在这些细胞中重新定位染色体。
Abstract
染色体显微操作是照亮染色体 congression、主轴检查点和后期染色体运动机制的重要方法, 是了解控制染色体运动的关键。在细胞分裂期间。一个熟练的生物学家可以使用微操作机器人从主轴分离染色体, 重新定位细胞内的染色体, 并使用一个小的玻璃针和一个非常细的尖端对染色体施加作用力。虽然可以使用其他方法 (如光学陷印和激光的其他用途) 对染色体进行摄动, 但迄今为止, 没有任何其他方法允许将蜂窝组件重新定位在十到成百上千微米的尺度上, 对细胞几乎没有损伤。.
为染色体显微操作选择和准备合适的细胞, 特别是描述蚱蜢和板球精母细胞主要文化的制备, 用于活体细胞成像和显微操作, 是这里描述。此外, 我们还展示了一种用于在细胞内移动染色体的针的构造, 以及使用带有玻璃针的操纵杆控制压电微操作机器人在分裂细胞内重新定位染色体。样本结果显示使用微操作机器人分离染色体从主轴在主精母细胞和重新定位该染色体在细胞内。
Introduction
显微操作揭示了染色体 congression、主轴检查点和后期染色体运动的部分机制。描述显微操作实验结果的最早出版物是罗伯特. 钱伯斯1。腔室使用带有连接玻璃针的机械微操作机器人来探测多种不同细胞类型的细胞质。不幸的是, 允许在活细胞中的染色体和许多其他细胞成分的可视化的对比方法当时是不可用的, 因此钱伯斯的实验无法显示重新定位这些蜂窝组件的效果。早期 micromanipulations 改变染色体位置使用腔室装置扫描后期细胞中的主轴安备, 表明这种操作可以改变染色体臂在后期蝗虫果蝇2的位置.本特纳和他的合作者是第一个执行精细 micromanipulations 染色体, 伸展染色体3, 分离他们从主轴和诱导方向3,4, 稳定一个malorientation 通过对5、6、7的染色体施加张力, 并测量主轴在后期8、9中产生的力。本特纳实验室的其他工作表明 , 细胞质颗粒也可以纵10 , 中心体可以通过显微操作11重新定位。显微操作不仅适用于移动染色体和其他蜂窝组件。显微操作针可以通过 demembranated 细胞中的有丝分裂主轴清晰地切割12或可用于溶解核包络13。此外, 相邻的细胞可以通过显微操作14,15进行融合。
使用微操作可以完成如此广泛的有趣实验, 乍一看, 很少有染色体生物学家做过显微操作实验。这一缺陷的一个原因是, 从脊椎动物组织派生的有丝分裂培养细胞和通常用于研究染色体运动是极其困难的 micromanipulate。这些组织培养细胞通常有皮质细胞骨架, "得到在方式" 的显微操作针, 和染色体要么无法通过针或针通过细胞研磨, 导致细胞破裂和死亡。我们, 以及其他使用显微操作的实验者, 发现了节肢动物细胞能够顺应显微操作。节肢动物精母细胞很容易在一层卤烃油中传播, 在细胞分裂过程中, 细胞膜上的皮质细胞骨架也很不稳定。因此, 节肢动物睾丸提供了一个良好的来源 meiotically 分裂细胞 (精母细胞) 和有丝分裂分裂细胞 (精原细胞) 与易于访问的染色体的显微操作。一个在操作过程中固定的蚱蜢精母细胞的序列切片表明, 针头从未穿透细胞膜;细胞膜在针周围变形 (本特纳右岸导流洞, 个人通信)。精母细胞从一些昆虫和蜘蛛分类 micromanipulated 成功, 包括蚱蜢, 祈祷螳螂, 果蝇, 鹤蝇, 蟋蟀, spittlebugs, 蛾, 黑寡妇蜘蛛, 地窖蜘蛛, 和 orb 编织蜘蛛3、7、17、18、19、20、21、22。从昆虫中培养、有丝分裂细胞可以 micromanipulated。例如, 蝗虫果蝇中的染色体在初级文化中有可以很容易地 micromanipulated2,23的染色体。我们怀疑, 来自果蝇和其他昆虫的可用培养线也将 micromanipulatable, 虽然我们没有测试这些细胞的技术。我们将展示如何为显微操作准备分裂的蝗虫和蟋蟀细胞。在一年中的任何时候, 蟋蟀都很容易从大多数宠物商店获得。蚱蜢只有在夏天才容易获得, 除非研究员可以进入实验室菌落, 但使用的物种 (Melanoplus sanguinipes) 有很容易扁平的细胞和长, 易于操作的染色体。
另一个原因, 微操作实验是由少数生物学家做的, 是并联, 移动染色体很好, 很少在市场上可用。我们发现, 操纵杆控制的压电微操作机器人控制在操纵杆运动和针头运动之间没有振动、漂移或滞后的针运动, 但其他类型的机械手也可以成功地推动染色体在牢房里由埃利斯和 Begg25,26并联设计的是染色体显微操作的理想选择, 尽管它们使用较旧的技术。压电并联目前可用, 并常用于生理学;但是, 这些并联通常不受操纵杆控制。操纵杆控制是成功的显微操作所需的平滑运动的关键, 因此, 应构建自定义操纵杆, 使当前可用的压电并联工作于染色体显微操作。操纵杆控制的压电并联的工作最好有直接位置控制, 在其中的操纵杆的移动直接转换为针运动。
新设计的压电微操作机器人可从可轻松更换的商用部件和一些小的3维印刷元件中构造, 适用于染色体显微操作24。微操作机器人具有可调节的灵敏度, 手动粗定位, 无振动, 漂移, 或滞后的针运动, 和直接位置控制的针。科学家可以使用在线24上提供的指令构造微操作机器人。以下是制备主要精母细胞细胞培养的方法和微操作细胞内的染色体。
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Protocol
1. 初级昆虫精母细胞细胞培养的显微操作制备
- 滑动准备
- 获得一个75毫米 x 25 毫米的玻璃滑块, 在幻灯片的中心切出20毫米直径的圆孔。
注意: 这些都是从一张窗玻璃切割成一个玻璃滑块的大小在中心的一个洞。 - 运行一个25毫米 x 25 毫米 #1 5 盖玻片通过本生燃烧火焰为 2 s。
- 在玻璃滑块的孔边缘周围涂抹真空润滑脂
- 将盖玻片放在孔上, 如图 1所示。按下它, 确保形成一个紧密的密封。
- 翻转玻璃滑块, 用卤烃油填充解剖井。
- 获得一个75毫米 x 25 毫米的玻璃滑块, 在幻灯片的中心切出20毫米直径的圆孔。
- 精母细胞在显微镜下观察的培养准备
注意: 在这里, 我们描述使用蚱蜢或板球细胞的培养方法。其他节肢动物的睾丸含量可以使用类似的方法进行培养。- 获得亚成年雄性蟋蟀 (或蚱蜢)。将活的昆虫放在冰箱里约2分钟冷麻醉它。使用解剖剪刀, 快速穿过背表面平行于长轴的腹部直接在机翼芽后面。手动挤压腹部, 以推动睾丸通过在外骨骼的切口 (图 2)。
- 使用镊子, 将孤立的睾丸放置在含有卤烃油的解剖井中。
- 如果需要, 在解剖显微镜下查看睾丸。用细尖钳将它们分成小块, 除去睾丸上的任何脂肪, 并用细尖的镊子来分解睾丸 (图 3A和3B)。在盖玻片表面 (图 3C), 将睾丸含量分布在油下。
- 传播睾丸的内容, 直到睾丸的扩散部分是几乎不明显的眼睛 (图 3C)。如有需要, 使用额外的油负载分离井。
2. 显微操作
- 微针的生产
- 将 a (外径为0.85 毫米, 内径为0.65 毫米) 的一端放置在本生燃烧器火焰中的玻璃管中。以一种150°角形成的方式拉动玻璃管的末端, 并创建狭窄玻璃管的扩展区域。在薄区域中折断油管, 使从角度延伸的薄区域长度约为 10 mm (图 4A)。
- 使用 microforge (根据鲍威尔27或商业提供的定制-见材料表), 触摸玻璃针的尖端到热白金线融化玻璃在尖端。在针与 microforge 的铂线之间形成大约45°的角度 (图 4B)。将玻璃从热线上拉出, 同时将热量关闭至导线, 在玻璃针末端形成≤1.5 mm 的薄尖端。
注: 刀尖直径将难以测量, 但这种长度的尖端很可能会产生一个坚定但灵活的针, 将适合显微操作。或者, 微量吸管拉拔器可用于创建适当的尖端直径的玻璃管 (实验者必须测试不同的牵引配方, 以产生适当的坚定但灵活的微针为工作)。针头可以放置在与根据上述方法创建的操作针类似的刀柄中。
- 定位微操作机器人
- 将准备好的幻灯片放在倒置的相位对比显微镜的舞台上。查找分隔单元格, 并将它们放在视野中。使用尽可能低的放大倍率来聚焦细胞。
注意: 我们使用16X 相位对比物镜。 - 将微针放在微操作机器人的针座上。
- 手动将微针放置在显微镜的光路中, 使针头的尖端被光线照亮 (图 5B)。
- 将显微镜聚焦在细胞所在平面上方的几个焦平面上。
- 重新定位微针使用操纵杆控制器在低灵敏度几次, 以找到在 X 和 Y 轴的针的影子。继续调整位置, 直到笔尖的位置可见。调整针沿 Z 轴的位置, 直到针头处于焦点。
- 重新聚焦在细胞上, 然后将显微镜聚焦在细胞平面上方, 这样细胞就会失去焦点和隐形。重新调整针头的位置, 使其尖端在该焦平面上对焦。
- 根据需要调整显微镜的放大倍率。
注: 我们使用 100X 1.4 数值孔径 (NA) 相比较物镜进行显微操作。 - 在使用更高放大率物镜聚焦细胞后, 再次将显微镜聚焦在细胞平面上方, 这样细胞就失去了焦点和无形。使用更高的灵敏度设置, 调整针的位置, 使其尖端处于焦点, 并以位于单元格所在平面上方的焦点平面为中心。
- 重新聚焦在细胞上, 调整它们的位置, 使其保持在视野的中心。针现在已准备好进行显微操作。
- 将准备好的幻灯片放在倒置的相位对比显微镜的舞台上。查找分隔单元格, 并将它们放在视野中。使用尽可能低的放大倍率来聚焦细胞。
- 染色体显微操作
- 使用与高放大倍率下的精细定位相同的灵敏度设置, 使用操纵杆控制微针, 并在细胞内推动染色体。将针头放在细胞的平面上方。
- 要拉动或移动染色体, 请将焦点放在细胞顶部附近的染色体上。
注意: 这些染色体更容易操作-操纵靠近盖玻片的染色体, 这使得针头可能会研磨成盖玻片, 爆裂细胞并结束实验。 - 调整操纵杆上的 Z 轴, 使针头进入对焦, 然后用 X 的操纵杆移动针头尖端, 并将针头的尖端直接放在染色体上, 并将其推入所需的方向, 以使机械手 repositi在染色体上。
- 根据染色体的推进程度, 无论是对染色体施加张力, 还是应用足够的张力从主轴分离染色体。一旦染色体从主轴中移除, 将其放置在细胞内的任何地方。
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Representative Results
图 6显示了2个相邻蚱蜢主精母细胞的显微操作, 其中几个例子说明了显微操作的可能用法。这个实验是使用倒置的相位对比显微镜完成的。0:00 (显示的时间在 min: s) 图像显示在操作之前的两个单元格。底部细胞中的一条染色体显示在由显微操作针 (0:05; 黑色箭头) 所施加的张力下, 然后完全脱离主轴 (0:10; 黑色箭头)。底部细胞中的一条染色体 (6:25; 黄色箭头) 被推向该细胞的1主轴杆 (7:05; 黄色箭头), 然后移动到主轴区域 (7:10; 黄色区域) 之外。在这个实验中, 两个操纵的染色体 (黄色和黑色箭头) 都是通过微操作针不断地被重新连接到主轴上, 以防止新的主轴附件的形成。显微操作针投射的阴影在一些图像中可见, 但针头的尖端很少可见。这些图像表明, 它是可能的重新定位, 应用张力, 并从主轴分离染色体使用显微操作。染色体可以从主轴中分离出来, prometaphase, 中期和后期, 虽然后期染色体是非常难以分离。
图 1:玻璃随附盖玻片滑动.一个25毫米 x 25 毫米, 火焰处理盖玻片连接到75毫米 x 25 毫米玻璃滑块与20毫米直径圆孔切割中心和密封的真空润滑脂。注意在盖玻片下的真空润滑脂中缺少可见气泡或空隙。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2:从板球和蚱蜢中取出睾丸。睾丸 (箭头) 可以从一个男性板球 (Acheta 幼雏顶) 或蚱蜢 (Melanoplus sanguinipes底部) 后, 在昆虫的腹部, 直接在机翼芽 (箭头) 后面切开。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3:细胞传播的制备。(a) 板球的睾丸大部分由箭头显示。用于单个幻灯片的睾丸段由箭头显示。刻度条 = 1 毫米 (B) 蚱蜢睾丸由若干小管组成。通常, 我们使用4小管从一个少年雄性蚱蜢为每张幻灯片, 如图所示。比例尺 = 1 mm (C) 对于这两种物种, 睾丸都是用镊子折断的, 睾丸部分的含量在卤烃油中传播。显示了油下的扩散睾丸含量。刻度条 = 10 mm.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4:由玻璃管形成的显微操作针。(A) 针的一般形状是一个长的, 未经修改的玻璃管 (≥10 cm), 弯曲约150°约10毫米从末端 (形成通过拉伸和弯曲玻璃管在本生燃烧器火焰)。(B) 小组显示在 microforge 中放置的针头。在加热前, 针 (箭头) 与铂丝灯丝 (箭头) 形成约60°角。(C) 针的尖端 (箭头) 是在弯曲的玻璃管接触到 microforge 的热铂丝 (箭头) 并拉走之后形成的。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5:针在显微镜光路中的位置。(A) 该小组显示了微操作机器人的观点。(B) 该面板显示了在微操作机器人针座上放置的显微操作针的特写视图, 它是一块3维印刷塑料。(C) 在倒置的相对照显微镜的光路中定位的针头尖端。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6:两个相邻蝗虫主精母细胞染色体的显微操作.时间显示在 min: s. 0:00 图像在显微操作之前显示两个单元格。在染色体上施加张力 (由黑色箭头显示), 使用显微操作针朝向该细胞的顶部主轴杆 (0:05)。染色体与主轴分离, 并推向底部主轴杆 (0:10), 并最终移动到主轴区域 (6:25、7:05 和 7:10) 之外。相邻细胞 (6:25, 黄色箭头) 中的染色体被推入该单元格 (7:05, 黄色箭头) 的顶部主轴杆, 然后移动到主轴质量 (7:10, 黄色箭头) 之外。比例尺 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
通过练习, 在细胞周围移动染色体可以成为第二天性。针是足够僵硬和足够薄的尖端是很难 "得到的诀窍" 捏造, 但这种能力也附带实践。针是如此之好, 它们在卤烃油中移动时会变形, 对推动细胞中的染色体并不有用。针是如此钝, 他们的提示是可见的, 大到1/3 的宽度的染色体 (或更大) 很可能杀死细胞。这项协议的关键步骤是创建一个足够精细的针来推动染色体, 但不像杀死细胞那样钝。
成功通常是当健康的生物体用于做精母细胞准备, 并且在细胞的顶部表面附近的染色体被选择用于显微操作。试图操纵细胞在盖玻片表面附近的染色体通常会导致将显微操作针研磨成盖玻片并刺穿细胞, 从而结束实验。如果细胞没有被刺穿或不健康, 细胞应该存活显微操作。细胞死亡很容易诊断, 因为染色体非常迅速地聚集在一起。Micromanipulated 细胞通常通过后期和胞质分裂存活, 我们已经成功地进行了6小时的显微操作实验。
虽然有一个陡峭的学习曲线和要求获取设备在 micromanipulate, 有很大的价值, 能够手动重新定位蜂窝组件的精确方式。如上所述, 目前尚无其他方法可用于大型蜂窝结构的精确重定位。使用显微操作来移动单元格中的结构有很长的历史。例如, 使用显微操作测量后期 I 染色体8上施加的力, 并将张力应用于染色体5 , 可在文献中获得。此外, 还有许多例子说明了显微操作如何也可以用来改变细胞样微管28、29中其他结构的位置, 扰乱像核包络13这样的单元格中的其他结构, 或者保险丝相邻单元格14,15在文献中进行了说明。
需要做更多的显微操作实验, 因为能够手动重新定位染色体和其他结构, 将力应用于结构, 并在细胞分裂的不同阶段测量染色体上的作用力将导致更好的了解细胞过程, 建立细胞过程的准确预测数学模型。未来的应用将允许在细胞分裂的所有阶段轻松测量染色体上的作用力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢杰西卡霍尔的宝贵讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu (2018).
- Ellis, G. W.
- Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
