Summary
I denne protokol beskrive vi udvælgelse og forberedelse af passende celler til micromanipulation og brugen af en piezoelektriske micromanipulator flytte kromosomer i disse celler.
Abstract
Micromanipulation af kromosomer har været en vigtig metode til belysning af mekanismen til kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevægelser, og har været nøglen til at forstå hvad styrer kromosom bevægelser under en celledeling. En dygtig biolog kan bruge en micromanipulator til at frigøre kromosomer fra spindel, flytte kromosomer i cellen og anvende styrker på kromosomer ved hjælp af et lille glas nål med en meget fin spids. Mens perturbationer kan stilles til kromosomer ved hjælp af andre metoder såsom optiske diffusering og andre anvendelser af en laser, til dato, tillader ingen anden metode Repositionering af cellulære komponenter på omfanget af snesevis til hundredvis af mikron med lidt at ingen skader på cellen .
Udvælgelse og forberedelse af passende celler til micromanipulation af kromosomer, der specifikt beskriver forberedelse af græshoppe og cricket spermatocyte primære kulturer til brug i live-celle imaging og micromanipulation, er beskrevet her. Derudover viser vi opførelsen af en nål til at bruges til at flytte kromosomer inden for cellen, og brug af en joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulator med en glas nål knyttet til det for at flytte kromosomer inden for delende celler. En prøve resultatet viser brugen af en micromanipulator at løsne et kromosom fra en spindel i en primær spermatocyte og flytte kromosomet inden for cellen.
Introduction
Micromanipulation har afsløret dele af mekanismen for en kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevægelser. De tidligste publikation der beskriver resultaterne af micromanipulation eksperimenter blev af Robert Chambers1. Chambers anvendes en mekanisk micromanipulator med en vedhæftet glas nål for at sonde cytoplasmaet i en række forskellige celletyper. Desværre, kontrast metoder, der tillod visualisering af kromosomer og mange andre cellulære komponenter i levende celler var ikke tilgængelige på tidspunktet, så Chambers eksperimenter ikke kunne vise virkningerne af repositionering sådan cellulære komponenter. Tidlige micromanipulations, ændrede stillingen kromosom bruges apparatet kamre til at feje spindel midzone i anaphase celler, viser, at sådanne manipulationer kan ændre placeringen af kromosom arme i anaphase græshoppe neuroblasts2 . Nicklas og hans medarbejdere var først til at udføre fine micromanipulations af kromosomer, stretching kromosomer3, løsrive dem fra spindel og inducere en nyorientering3,4, stabilisere en malorientation ved at anvende spænding til kromosomer5,6,7, og måle de kræfter, der er produceret af spindler i anaphase8,9. Andet arbejde af Nicklas lab viste at cytoplasmatisk granulat kunne også være manipulerede10 og at centrosomes kunne flyttes af micromanipulation11. Micromanipulation er ikke kun nyttig til at flytte kromosomer og andre cellulære komponenter. En micromanipulation nål kan rent skære igennem en mitotiske spindel i demembranated celler12 eller kan bruges til at opløse de nukleare konvolut13. Derudover kan tilstødende celler være smeltet af micromanipulation14,15.
Med sådan en bred vifte af interessante eksperimenter, der kan gøres ved hjælp af micromanipulation, det er ved første øjekast overraskende, at micromanipulation eksperimenter har gjort meget få kromosom biologer. En af grundene til denne mangel er, at de mitotically dividere kulturperler celler, der er afledt af hvirveldyr væv og er almindeligt anvendt til at studere kromosom bevægelser er meget vanskelige at micromanipulate. Disse vævskultur celler har generelt en kortikale cytoskeleton, "kommer i vejen" af micromanipulation nål, og kromosomer enten ikke kan nås af nålen eller nålen kværner gennem celle, fører til en celle brud og død. Vi og andre eksperimentatorer, der bruger micromanipulation, har fundet leddyr celler til at være åbne over for micromanipulation. Leddyr spermatocytes spredes nemt under et lag af halocarbon olie og synes at have en langt mindre robust kortikale cytoskeleton underliggende cellemembranen under en celledeling. Således leddyr testiklerne giver en god kilde til meiotically dividere celler (spermatocytes) og mitotically dividere celler (spermatogonia) med let tilgængelige kromosomer for micromanipulation. En seriel skæring af en græshoppe spermatocyte fast under en manipulation afslørede at nålen aldrig trænger cellemembranen; cellemembranen deformerer omkring nålen (Nicklas R.B., personlig meddelelse). Spermatocytes fra en række insekt og spider taxa har været micromanipulated med succes, herunder græshopper, bedende mantids, bananfluer, kran fluer, græshopper, spittlebugs, møl, sort enke edderkopper, kælder edderkopper og orb-vævning edderkopper 3,7,17,18,19,20,21,22. Kulturperler, mitotically dividere celler fra insekter kan være micromanipulated. For eksempel, har kromosomer i grasshopper neuroblasts i en primær kultur kromosomer, der kan være let micromanipulated2,23. Vi formoder, at de tilgængelige kulturperler linjer stammer fra Drosophila og andre insekter bliver også micromanipulatable, selvom vi ikke har testet teknik med disse celler. Vi vil vise, hvordan dividere celler fra græshopper og fårekyllinger kan være forberedt på en micromanipulation. Fårekyllinger er let at opnå fra de fleste dyrehandlere til enhver tid af året. Græshopper er kun let kan indhentes i sommeren, medmindre forskeren har adgang til et laboratorium koloni, men de arter, der anvendes (Melanoplus sanguinipes) har let fladtrykt celler, og lange, let at manipulere kromosomer.
En anden grund hvorfor micromanipulation eksperimenter har været udført af en lille håndfuld biologer er at micromanipulators at flytte kromosomer godt er sjældent tilgængelige på markedet. Vi har fundet, at en joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulator styrer nålen bevægelse uden vibrationer, drift eller forsinkelse mellem bevægelsen joystick og nålen bevægelse, men andre typer af manipulatorer kan også med held skubbe kromosomer rundt i cellen. Micromanipulators designet af Ellis og Begg25,26 er ideel til micromanipulation af kromosomer, selvom de bruger ældre teknologi. Piezoelektriske micromanipulators er i øjeblikket tilgængelige og er almindeligt anvendt i Elektrofysiologi; disse micromanipulators er imidlertid ikke typisk joystick-kontrolleret. Joystick kontrol er nøglen til de glatte bevægelser kræves for en vellykket micromanipulation, og så en brugerdefineret joystick bør konstrueres til at gøre de aktuelt tilgængelige piezoelektriske micromanipulators arbejde for et kromosom micromanipulation. De joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulators, der fungerer bedst har direkte position kontrol, hvor bevægelse af joysticket kan oversættes direkte til en nål bevægelse.
En nyligt designet piezoelektriske micromanipulator kan konstrueres fra kommercielt tilgængelige dele, som kan udskiftes nemt og nogle små 3D-trykte komponenter, og det virker godt for kromosom micromanipulation24. Micromanipulator har justerbar følsomhed, manuel groft positionering, og ingen vibrationer, drift, eller forsinkelse i nålen bevægelse og direkte position kontrol af nålen. Forskere kan konstruere micromanipulator ved hjælp af instruktionerne tilgængelige online24. Nedenfor er metoderne til at forberede en primær spermatocyte cellekultur og for micromanipulating kromosomer i cellerne i denne kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af primære insekt Spermatocyte cellekultur til Micromanipulation
- Skub forberedelse
- Opnå en 75 mm x 25 mm glas dias med en 20 mm diameter cirkulære hul skåret ud i midten af diaset.
Bemærk: Disse blev skåret fra et blad af vinduesglas til at være på størrelse med et glas dias med et hul i midten. - Køre en 25 mm x 25 mm #1.5 coverslip gennem en bunsenbrænder flamme for 2 s.
- Anvende vakuum fedt rundt i kanten af hullet i glas dias
- Sted coverslip på hul som i figur 1. Tryk på det og sørg for at danne en tæt forsegling.
- Flip glas dias og fylde dissektion godt med halocarbon olie.
- Opnå en 75 mm x 25 mm glas dias med en 20 mm diameter cirkulære hul skåret ud i midten af diaset.
- Spermatocyte kultur forberedelse til visning på mikroskop
Bemærk: Her, vi beskrive metoden kultur forberedelse ved hjælp af græshoppe eller cricket celler. Testiklerne indholdet af andre leddyr kan dyrkes ved hjælp af en lignende metode.- Få subadult mandlige fårekyllinger (eller græshopper). Placer en levende insekter i køleskab i ca 2 min til kolde-bedøver det. Ved hjælp af dissekere saks, skære hurtigt igennem det dorsale overflade parallelt med lange akse af maven direkte bag wing knopper. Manuelt presse maven forsigtigt at skubbe testiklerne gennem snit i exoskeleton (figur 2).
- Bruge pincet, placere de isolerede testiklerne i en dissektion godt indeholdende halocarbon olie.
- Hvis det er nødvendigt, se testikler under et dissekere mikroskop. Opdele dem i mindre stykker med fine spids pincet, at fjerne eventuelle fedt, der dækker testiklerne, og bruge fine spids pincet til at bryde op testiklerne (figur 3A og 3B). Sprede testiklerne indholdet under olie på overfladen af coverslip (figur 3 c).
- Sprede testiklerne indholdet, indtil spredning del af testiklerne er knap mærkbar på øjne (figur 3 c). Bruge ekstra olie-loaded dissociation wells, hvis nødvendigt.
2. micromanipulation
- Produktionen af microneedle
- Placer ene ende af et (0,85 mm ydre diameter, 0,65 mm indre diameter) glasrør i flammen på en bunsenbrænder. Trække slutningen af glas slanger på en sådan måde, at en 150° vinklen, og et udvidet område med smalle glas rør er lavet. Bryde slangen i regionen tynd, så den tynde regionen strækker sig fra vinklen er ca 10 mm lang (figur 4A).
- Ved hjælp af en microforge (enten custom-made ifølge Powell27 eller kommercielt tilgængelig-Se Tabel af materialer), røre spidsen af glas nålen til hot-platin tråd til at smelte glas på spidsen. Form en cirka 45° vinkel mellem nålen og af platin tråd af microforge (figur 4B). Træk glas fra den varme ledning, mens lukke varmen til wire, danner en tynd spids af ≤1.5 mm i slutningen af glas nålen.
Bemærk: Tip diameter vil være vanskeligt at måle, men en spids af denne længde er tilbøjelige til at producere en fast, men fleksibel nål, der vil være relevante for micromanipulation. Alternativt, en mikropipette puller kunne bruges til at oprette glas rør med en passende tip diameter (eksperimentatoren bliver nødt til at teste forskellige trækker opskrifter til at producere en passende fast men fleksible microneedle til jobbet). Nålen kan anbringes i en holder, der er formet på samme måde til manipulation nålen oprettet i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne metode.
- Placering af micromanipulator
- Plads det forberedte dias på scenen i en inverteret, fase-kontrast mikroskop. Find de delende celler og center dem i synsfeltet. Fokusere på celler ved hjælp af den laveste forstørrelse muligt.
Bemærk: Vi brugte en 16 X fasekontrast mål. - Sted microneedle i nål holder på micromanipulator.
- Manuelt placere microneedle i lette vejen for lup, så spidsen af nålen er oplyst af lys (figur 5B).
- Fokusere mikroskopet flere fokale planer over det plan, hvor cellerne ligger.
- Flytte microneedle bruger joystick controller på en lav følsomhed over for flere gange at finde skyggen af nålen i X- og Y-axes. Fortsætte med at justere holdning, indtil spidsen er synlig. Justere placeringen af nålen langs z-aksen, indtil nål-spidsen er i fokus.
- Fokusere på cellerne, så fokusere mikroskop over celle-plan, således at celler er bare ude af fokus og usynlig. Justere placeringen af nålen, således at dens spids er i fokus i denne fokalplan.
- Justere forstørrelse i mikroskopet, efter behov.
Bemærk: Vi brugte en 100 X 1,4 numerisk blænde (NA) fasekontrast mål for micromanipulation. - Efter fokusering på celler ved hjælp af højere forstørrelse mål, fokus igen mikroskop over celle plan så at cellerne er bare ude af fokus og usynlig. Ved hjælp af en højere følsomhedsindstilling, justere placeringen af nålen, således at dens spids er i fokus og centreret i brændplanet over det plan, hvor cellerne ligger.
- Fokusere på de celler, justere deres holdning, så de forbliver i midten af synsfeltet. Nålen er nu klar til micromanipulation.
- Plads det forberedte dias på scenen i en inverteret, fase-kontrast mikroskop. Find de delende celler og center dem i synsfeltet. Fokusere på celler ved hjælp af den laveste forstørrelse muligt.
- Micromanipulation af kromosomer
- Bruger indstillingen samme følsomhed som for den fine placering på en høj forstørrelse, brug joysticket til at styre microneedle og skubbe kromosomerne inde i cellen. Hold nålen spidsen over plan af celler.
- At trække eller flytte et kromosom, fokusere på et kromosom nær toppen af cellen.
Bemærk: Disse kromosomer er lettere at manipulere-manipulere kromosomer tæt på coverslip gør det sandsynligt, at nålen vil male i coverslip, sprængfyldt cellen og slutter eksperimentet. - Juster z-aksen på joysticket for at bringe nål-spidsen i fokus, og derefter flytte nålen tip med joystick i X og Y. Placer spidsen af nålen direkte på kromosom at blive manipuleret og skubbe det i den ønskede retning til at tillade manipulator til repositi på kromosom.
- Afhængigt af hvor langt kromosomet er skubbet, enten anvende spænding til kromosom eller anvende tilstrækkelig spænding for at frigøre et kromosom fra spindel. Når et kromosom er fjernet fra en spindel, placere den hvor som helst inden for cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 viser en prøve micromanipulation af 2 tilstødende græshoppe primære spermatocytes i flere eksempler af de mulige anvendelser af micromanipulation. Dette forsøg blev gjort ved hjælp af en omvendt, fase-kontrast mikroskop. 0:00 (gange vist er i min:s) billede viser begge celler før manipulation. Et kromosom i cellen nederst er vist under spænding anvendes af micromanipulation nål (0:05; sort pil) og derefter helt løsrevet fra spindel (0:10; sort pil). Et kromosom i cellen nederst (6:25; gul pil) er skubbet mod 1 spindel pol i cellen (7:05, gul pil) og derefter flyttes uden for området vigtigste spindel (7:10; gule område). Begge manipulerede kromosomer (gule og sorte pile) i dette eksperiment er holdt fra genmonteres til spindlen ved at være konstant puffede med micromanipulation nål til at forhindre dannelsen af nye spindel vedhæftede filer. Skyggen støbt af micromanipulation nålen er synlige i nogle billeder, men spidsen af nålen er sjældent synlige. Disse billeder viser, at det er muligt at flytte, anvende spændinger og løsne et kromosom fra spindel ved hjælp af micromanipulation. Kromosomer kan afmonteres fra en spindel i deres prometaphase, metafase, og anaphase, selvom anaphase kromosomer er yderst vanskeligt at frigøre.
Figur 1 : Glas slide med coverslip fastgjort. En 25 mm x 25 mm, flamme-behandlede coverslip er knyttet til en 75 mm x 25 mm glas dias med en 20 mm i diameter cirkulære hul skåret i midten og forseglet med vakuum fedt. Bemærk manglen på synlige bobler eller huller i vakuum fedt under coverslip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Fjernelse af testikler fra cricket og græshoppe. Testiklerne (pil) kan fjernes fra en mandlig cricket (Acheta domesticus-top) eller en græshoppe (Melanoplus sanguinipes-bund) efter et snit er lavet på maven af insektet, direkte bag wing knopper (pilespidser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Forberedelse af celle spredes. (A) testiklerne hovedparten af en cricket er vist med pilen. Testiklerne segment anvendes til et enkelt dias er vist ved pilespidsen. Skalalinjen = 1 mm. (B) græshoppe testiklerne er sammensat af en række af tubuli. Typisk, vi brugte 4 tubuli fra en juvenil mandlige græshoppe for hvert dias, som vist i dette billede. Skalalinjen = 1 mm. (C) For enten arter, testiklerne er brudt ved hjælp af pincet, og indholdet af testiklerne segmenter er spredt i halocarbon olie. Spredning testiklerne indholdet under olie er vist. Skalalinjen = 10 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : En micromanipulation nål dannet fra glas slanger. (A) den generelle form af nålen er en lang, uforandret segment af glas slanger (≥10 cm), med en bøje af ca. 150 ° ca. 10 mm fra afslutningen (dannet af stretching og bøjning glas slangen i en bunsenbrænder flamme). (B) panelet viser nålen placeres i microforge. Nålen (pilespids) former en ca 60° vinkel med platin wire glødetråden (pil) inden opvarmning. (C) spidsen af nålen (pilespids) er dannet efter bøjet glasrør er rørt til hot platin wire glødetråden (pil) i microforge og trak væk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Placering af nålen i mikroskopet lys sti. (A) dette panel viser en udsigt over micromanipulator. (B) dette panel viser et nærbillede af micromanipulation nål anbringes i micromanipulator nål holder, som er et stykke af 3-D trykt plast. (C) en nål tip placeret i lette vejen for en inverteret, fase-kontrast mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Micromanipulation af kromosomer i to tilstødende græshoppe primære spermatocytes. Tiderne er vist i min:s. 0:00 billede viser begge celler inden micromanipulation. Spænding er anvendt på kromosom (vist ved den sorte pil) ved hjælp af micromanipulation nål mod den øverste spindel pol i cellen (0:05). Kromosom er løsrevet fra spindel og pressede mod den nederste spindel pol (0:10), og til sidst flyttet uden for området vigtigste spindel (6:25, 7:05 og 7:10). Et kromosom i nabocellen (6:25, gul pil) er skubbet mod den øverste spindel pol i cellen (7:05, gul pil) og derefter flyttes uden for de vigtigste spindel masse (7:10, gul pil). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med praksis, kan færdes kromosomer i cellen blive anden natur. Nåle, der er både tilstrækkeligt stive og tilstrækkelig tynd spids er svært at "få håndelag for" opdigte, men denne evne også kommer med praksis. Nåle, der er så fint at de deformeres når flyttede i halocarbon olie vil ikke være nyttigt for at skubbe kromosomer i cellen. Nåle, der er så afstumpede at deres tips er synlige og så store som 1/3 i bredden af et kromosom (eller større) er meget sandsynligt, at dræbe cellen. Oprettelsen af en nål, der er tilstrækkeligt fin at skubbe kromosomer, men ikke så afstumpede at dræbe cellen er det afgørende skridt i protokollen.
Succes resulterer typisk når raske organismer er anvendes til fremstilling af spermatocyte præparater, og kromosomerne nær den øverste overflade af cellen er valgt til micromanipulation. Forsøg på at manipulere kromosomer nær coverslip-overfladen af cellen ofte resultere i slibning micromanipulation nålen ind i coverslip og dermed punktering cellen, slutter eksperimentet. Hvis cellen ikke er punkteret eller andet usundt, cellen skal overleve micromanipulation. Celledød er let diagnosticeret, som kromosomerne meget hurtigt klumper sig sammen. Micromanipulated celler typisk overleve gennem anaphase og cytokinesis, og vi har med succes gennemført 6 h lang micromanipulation eksperimenter.
Mens der er en stejl indlæringskurve og et krav om at anskaffe udstyr i geare op til at micromanipulate, er der en stor værdi i at være i stand til manuelt flytte cellulære komponenter i en præcis måde. Som anført ovenfor, er der ingen anden metode i øjeblikket tilgængelige der tillader sådanne præcise Repositionering af store cellulære strukturer. Der er en lang tradition for at bruge micromanipulation til at flytte strukturer i cellen. Eksempler, med smukke figurer af processen, ved at bruge micromanipulation til at måle kræfter udøves på anaphase kromosomer8 og anvende spænding til kromosomer5 findes i litteraturen. Derudover mange eksempler på, hvordan micromanipulation kan også bruges til at ændre placeringen af andre strukturer i celle-lignende mikrotubuli28,29, forstyrre andre strukturer i cellen som nuklear konvolut13, eller fuse tilstødende celler14,15 er illustreret i litteraturen.
Mere micromanipulation eksperimenter skal gøres, som evnen til at manuelt flytte kromosomer og andre strukturer skal gælde strukturer, styrker og for at måle kræfter på kromosomer i forskellige stadier af celledeling vil føre til en bedre forståelse af cellulære processer, og oprettelsen af præcise, intelligent matematiske modeller af cellulære processer. Fremtidige ansøgninger vil tillade en nem måling af kræfter på kromosomer i alle faser af celledeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Jessica Hall for hendes værdifulde diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu (2018).
- Ellis, G. W.
- Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
